郭 丹，杜 寧

0引言

視網(wǎng)膜病變是糖尿病眼病中最為嚴重的可致盲的一種并發(fā)癥，隨著糖代謝發(fā)生紊亂，會引起視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)損傷，最終發(fā)生血管周細胞凋亡、血管舒縮調(diào)節(jié)功能異常等視網(wǎng)膜病理改變[1-2]。臨床上對于糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療雖然能有效對患者視網(wǎng)膜進行保護，但效果往往不太理想。白皮杉醇屬于白藜蘆醇的衍生物，具有較強的清除自由基、抗氧化的作用[3]。有研究表明，血管生成素-2(Ang-2)/Tie-2受體信號系統(tǒng)在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生和發(fā)展中有著重要的作用，且參與視網(wǎng)膜病變血管增殖[4]。在本實驗中，運用白皮杉醇對糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠進行干預，探究其對糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療效果及作用機制。

1材料和方法

1.1材料研究動物：選擇50只SD健康雄性大鼠，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。大鼠年齡為6～10(平均7.8±0.5)周齡，體質(zhì)量為220～240(平均228.4±21.5)g，飼養(yǎng)溫度為22℃～25℃，室內(nèi)濕度35%～40%，飼養(yǎng)室定時進行紫外線照射消毒。統(tǒng)一喂給標準飼料，允許自由活動，飼養(yǎng)時間為1wk。本研究所做實驗均獲得倫理委員會批準，符合實驗動物管理條例。

主要藥物和試劑：白皮杉醇(購自于成都曼思特生物科技有限公司)，B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)單克隆抗體(上海振譽生物科技有限公司，bsm-33411M)，Bax單克隆抗體(北京博奧森生物科技有限公司，bsm-33279M)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)單克隆抗體(上海群己生物科技有限公司，H00007422-M05)，缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)單克隆抗體(上海恒斐生物科技有限公司，K000487P)，血管緊張素Ⅱ(ANGⅡ)單克隆抗體(上海莼試生物技術有限公司，CS-ELISA1280)，血管生成素-1(Ang-1)單克隆抗體(上海群己生物科技有限公司，H00000283-M05)，血管生成素-2(Ang-2)單克隆抗體(武漢博歐特生物科技有限公司，orb77073)，Tie-2單克隆抗體(上海滬震實業(yè)有限公司，hz126Ra21)；HE染色劑、PBS緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1建模及分組隨機選取50只健康SD大鼠中10只作為對照組，其余40只大鼠建立糖尿病視網(wǎng)膜病變模型。建模過程中對照組大鼠使用基礎飼料進行喂養(yǎng)，其余40只大鼠使用高脂高糖的飼料喂養(yǎng)。8wk后，所有大鼠均禁食12h，高脂高糖飼料喂養(yǎng)的40只大鼠腹腔注射40mg/kg的鏈脲佐菌素，對照組大鼠注射等體積的生理鹽水。3d后采取斷尾措施，采集大鼠尾部靜脈血進行血糖檢測，血糖值≥16.7mmol/L，尿糖為3+,說明糖尿病模型大鼠建造成功，最終建模成功38只。所有大鼠給予基礎飼料進行喂養(yǎng)，自由活動4wk后，觀察大鼠眼底出現(xiàn)明顯的視網(wǎng)膜出血或者滲出、毛細血管擴張及動靜脈異常等情況，說明糖尿病視網(wǎng)膜病變模型大鼠建模成功，最終糖尿病視網(wǎng)膜病變模型建模成功35只。將建模成功的糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠隨機分為模型組8只、常規(guī)用藥組9只、低劑量白皮杉醇組9只、高劑量白皮杉醇組9只。

1.2.2藥物干預在糖尿病視網(wǎng)膜病變模型建模成功后，對五組大鼠進行藥物干預。常規(guī)用藥組大鼠使用依帕司他進行灌胃，劑量為100mg/kg；低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠參照杜倩等[5]研究實驗中使用白皮杉醇治療青光眼大鼠的劑量分別使用劑量為100、200mg/kg的白皮杉醇行灌胃治療。對照組、模型組大鼠給予劑量為100mg/kg的生理鹽水灌胃。五組大鼠均1次/d，連續(xù)給藥4wk。

1.2.3樣本采集在對大鼠干預4wk后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉處死，取大鼠視網(wǎng)膜組織，左眼視網(wǎng)膜組織使用4%多聚甲醛固定，常溫下使用15%的EDTA脫鈣，脫水后進行石蠟包埋，制作3μm的組織切片，行后續(xù)病理學觀察。右眼視網(wǎng)膜組織，在液氮冰凍保存。

1.2.4病理學觀察對五組大鼠切片樣本進行染色處理，使用二甲苯進行常規(guī)脫蠟處理2次，每次5min，然后在梯度乙醇下水化處理3min，自來水沖洗1次；使用蘇木素染色5min，自來水沖洗1次；使用濃度為1%的鹽酸-乙醇分化處理30s，在0.2%氨水中返藍處理2min，自來水沖洗1次；在濃度0.5%伊紅染色10min，自來水沖洗1次；使用梯度乙醇進行脫水處理，最后用中性樹膠進行封片，使用光學顯微鏡進行圖像分析。

1.2.5 Western blot檢測五組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax、Bcl-2蛋白的表達取液氮中保存的視網(wǎng)膜組織，研磨后加入蛋白緩沖液，進行常規(guī)蛋白提取，BCA測定蛋白濃度。取20μg/孔蛋白質(zhì)，通過10%的SDS-PAGE凝膠進行電泳，轉(zhuǎn)膜結束之后，將電轉(zhuǎn)膜浸泡在10%的牛奶中，在37℃環(huán)境下的搖床上封閉1.5h；與一抗結合，加入TBST稀釋一抗(1∶1000)，在4℃的環(huán)境下孵育24h；之后TBST緩沖液清洗處理，與二抗結合在室溫下孵育1h，使用TBST緩沖液反復清洗，Tubulin為內(nèi)參照。加入顯影劑將其浸在底物溶液中進行顯色，嚴格按照顯影定影試劑盒操作說明書進行。

1.2.6酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測五組大鼠視網(wǎng)膜組織VEGF、HIF-1α、ANGⅡ、Ang-1、Ang-2、Tie-2水平采用酶聯(lián)免疫吸附試驗，將采集到的標本，取包被液(pH9.5 0.05mol/L CB)適當稀釋的抗VEGF、HIF-1α、ANGⅡ、Ang-1、Ang-2、Tie-2 0.1mL，添加至聚苯乙烯反應板孔中，加蓋后溫度4℃24h，次日使用洗滌劑洗滌3次后，甩干。在各孔中加入稀釋液(pH7.4, 0.02mol/L Tris-HCl緩沖液)稀釋的待測標本0.1mL，同時加入陽性和陰性的對照標本，在43℃置60min，將液體移除洗滌3次后，甩干。在各孔中加入VEGF、HIF-1α、ANGⅡ、Ang-1、Ang-2、Tie-2的酶標抗體0.1mL，43℃置60min。液體移去后洗滌3次，甩干。在各個孔中加入底物液(0.1mol/L Na2HPO4(Na2HPO4·12H2O 35.8g/L)5.14mL,0.05mol/L枸櫞酸(10.5g/L)4.86mL混勻,加入鄰苯二胺(OPD)4mg，置棕色小瓶中,臨用時加30% H2O2,混勻，置黑20min，在各孔中加入2mol/L H2SO40.05mL，終止反應。在酶標儀上讀取A405吸收值。分析VEGF、HIF-1α、ANGⅡ、Ang-1、Ang-2、Tie-2水平。

圖1五組大鼠視網(wǎng)膜病理組織學觀察圖HE染色(×400)A:對照組; B:模型組;C:常規(guī)用藥組;D:低劑量白皮杉醇組;E:高劑量白皮杉醇組。

組別BaxBcl-2對照組2.40±0.560.18±0.02模型組0.35±0.05a1.26±0.36a常規(guī)用藥組0.76±0.04a,c1.12±0.07a,c低劑量白皮杉醇組1.01±0.21a,c,e0.96±0.21a,c,e高劑量白皮杉醇組1.76±0.05a,c,e,g0.37±0.06a,c,e,g F5.11014.208P<0.001<0.001

注：aP<0.05vs對照組；cP<0.05vs模型組；eP<0.05vs常規(guī)用藥組；gP<0.05vs低劑量白皮杉醇組。

組別VEGF(ng/mL)HIF-1α(pg/mL)ANGⅡ(ng/mL)對照組107.28±10.250.30±0.026.57±1.12模型組170.53±15.24a0.65±0.26a9.10±1.98a常規(guī)用藥組146.25±12.15a,c0.50±0.05a,c8.78±1.56a,c低劑量白皮杉醇組140.25±8.10a,c,e0.42±0.02a,c,e8.12±0.09a,c,e高劑量白皮杉醇組121.89±5.45a,c,e,g0.38±0.01a,c,e,g7.58±0.10a,c,e,gF5.71716.2344.032P<0.001<0.001<0.001

注：aP<0.05vs對照組；cP<0.05vs模型組；eP<0.05vs常規(guī)用藥組；gP<0.05vs低劑量白皮杉醇組。

2結果

2.1五組大鼠視網(wǎng)膜病理組織學觀察如圖1所示，對五組大鼠視網(wǎng)膜病理組織圖進行觀察?？梢妼φ战M大鼠視網(wǎng)膜表面光滑，內(nèi)、外核層細胞排列緊密、整齊；模型組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)界出現(xiàn)明顯水腫，內(nèi)外核層細胞排列不整齊，可見較多的血管內(nèi)皮細胞突觸內(nèi)界膜；常規(guī)用藥組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)界水腫有所減輕，但仍出現(xiàn)內(nèi)外核層細胞排列不整齊，仍有較多的血管內(nèi)皮細胞突觸內(nèi)界膜；低劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)界膜水腫明顯減輕，且血管內(nèi)皮細胞突觸內(nèi)界膜情況得到改善；高劑量白皮杉醇組大鼠僅出現(xiàn)內(nèi)核層細胞較排列疏松，血管未見明顯異常。

2.2五組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較如表1所示，模型組、常規(guī)用藥組、低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax表達量均低于對照組，Bcl-2蛋白表達量均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；常規(guī)用藥組、低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax表達量均高于模型組，Bcl-2蛋白表達量均低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax表達量均高于常規(guī)用藥組，Bcl-2蛋白表達量均低于常規(guī)用藥組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax表達量高于低劑量白皮杉醇組，Bcl-2蛋白表達量低于低劑量白皮杉醇組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3五組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF、HIF-1α、ANGⅡ表達水平比較如表2所示，模型組、常規(guī)用藥組、低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF、HIF-1α、ANGⅡ表達水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；常規(guī)用藥組、低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF、HIF-1α、ANGⅡ表達水平均低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF、HIF-1α、ANGⅡ表達水平均低于常規(guī)用藥組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF、HIF-1α、ANGⅡ表達水平均低于低劑量白皮杉醇組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4五組大鼠視網(wǎng)膜組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2表達水平及Ang-1/Ang-2比值比較如表3所示，模型組、常規(guī)用藥組、低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2表達水平均高于對照組，Ang-1/Ang-2比值低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；常規(guī)用藥組、低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2表達水平均低于模型組，Ang-1/Ang-2比值高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；低劑量白皮杉醇組、高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2表達水平均低于常規(guī)用藥組，Ang-1/Ang-2比值高于常規(guī)用藥組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2表達水平均低于低劑量白皮杉醇組，Ang-1/Ang-2比值高于低劑量白皮杉醇組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

組別Ang-1(μg/L)Ang-2(μg/L)Tie-2(μg/L)Ang-1/Ang-2對照組7.56±0.982.16±0.122.78±0.233.98±0.56模型組11.59±1.59a6.12±1.00a4.29±0.78a1.70±0.10a常規(guī)用藥組10.12±0.98a,c5.26±0.67a,c3.99±0.67a,c2.10±0.31a,c低劑量白皮杉醇組9.10±0.46a,c,e4.12±0.23a,c,e3.46±0.15a,c,e2.98±0.02a,c,e高劑量白皮杉醇組8.56±0.04a,c,e,g3.24±0.25a,c,e,g3.00±0.04a,c,e,g3.16±0.09a,c,e,g F9.93218.7608.77816.958P<0.001<0.001<0.001<0.001

注：aP<0.05vs對照組；cP<0.05vs模型組；eP<0.05vs常規(guī)用藥組；gP<0.05vs低劑量白皮杉醇組。

3討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變早期沒有明顯的癥狀，對視力的影響不明顯，但隨著病情的加重，其視網(wǎng)膜病變會累及黃斑，導致眼底出血、黃斑水腫、眼底血管閉塞等情況的發(fā)生，嚴重影響著糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的視力，甚至導致患者失明[6-7]。目前常規(guī)西藥治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的效果并不理想，因此本研究為尋找有效治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的藥物，建立糖尿病視網(wǎng)膜病變模型大鼠，使用白皮杉醇對其干預，探究其治療效果及作用機制。

白皮杉醇是主要存在于大黃、甘蔗、葡萄中的一種多酚化合物，有研究表明，白皮杉醇不僅具有抗氧化、清除自由基的作用，還具有抗炎、抗菌、保護心、腦、血管及提高機體免疫力的作用[8-9]。在本研究中，對糖尿病視網(wǎng)膜病變模型大鼠進行干預，結果顯示，白皮杉醇能夠有效保護其視網(wǎng)膜，改善炎癥反應，且呈現(xiàn)劑量依賴，高劑量的白皮杉醇改善糖尿病視網(wǎng)膜病變的程度高于低劑量白皮杉醇。

糖尿病視網(wǎng)膜病變均伴隨著神經(jīng)損傷，其在高血糖、應激反應谷氨酰胺代謝障礙有著重要的意義[10]。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF、Bax、Bcl-2水平存在異常表達，與劉舒靜等[11]、謝安明等[12]、宋麗君等[13]、董白霞等[14]研究認為糖尿病視網(wǎng)膜病變患者視網(wǎng)膜損傷與VEGF、Bax、Bcl-2水平表達異常有關的結果一致，對糖尿病視網(wǎng)膜病變模型大鼠使用藥物干預后，VEGF、Bax、Bcl-2水平表達異常情況顯著改善，但使用白皮杉醇干預的大鼠VEGF、Bax、Bcl-2水平表達改善程度高于常規(guī)藥物干預的大鼠，且劑量越高改善越明顯，此結果說明高劑量的白皮杉醇通過改善VEGF、Bax、Bcl-2水平表達的異常表達而對視網(wǎng)膜進行保護。此結果與張會嶺等[15]研究中認為藥物干預后通過改善大鼠Bax、Bcl-2異常表達起到保護視網(wǎng)膜的作用研究一致。

另外有研究顯示，HIF-1α、ANGⅡ參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生、發(fā)展[16-17]。在本研究中，對五組大鼠視網(wǎng)膜組織中HIF-1α、ANGⅡ表達水平進行檢測，結果顯示，糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠其HIF-1α、ANGⅡ表達水平顯著高于對照組大鼠，使用藥物進行干預后，高劑量白皮杉醇組大鼠視網(wǎng)膜組織中HIF-1α、ANGⅡ的表達水平顯著降低，說明高劑量白皮杉醇干預能夠有效抑制HIF-1α、ANGⅡ的異常表達，進而抑制炎性反應。

糖尿病視網(wǎng)膜病變后期患者會出現(xiàn)視網(wǎng)膜脫離，Ang/Tie受體信號系統(tǒng)參與其發(fā)展。Ang-2可同時拮抗Ang-1和促進血管內(nèi)皮結構的穩(wěn)定，從而對血管基底膜進行限制[18-19]。本研究結果顯示糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2出現(xiàn)異常的表達，張冬花[20]在其研究中認為糖尿病視網(wǎng)膜病變患者視網(wǎng)膜組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2表達水平均顯著高于對照組。本研究進一步觀察對糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠藥物干預后Ang-1、Ang-2、Tie-2表達水平，結果顯示，高劑量白皮杉醇能夠有效改善大鼠視網(wǎng)膜組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2的異常表達，可能是由于高劑量白皮杉醇通過作用于Ang/Tie受體信號通路而抑制Ang-1、Ang-2、Tie-2的異常表達，從而起到抑制氧化應激損傷及新生血管的生成。

綜上所述，白皮杉醇能夠有效保護糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠的視網(wǎng)膜組織，通過作用于Ang/Tie受體信號通路，抑制炎性因子VEGF、HIF-1α、ANGⅡ的異常表達，抑制氧化應激損傷、新生血管的生成，且呈劑量依賴，高劑量效果更加顯著，為臨床上治療糖尿病視網(wǎng)膜病變提供了理論依據(jù)。