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低溫肉制品以其肉質(zhì)細(xì)膩、攜帶方便、保質(zhì)期長等特點，深受廣大人民群眾的喜愛，是居家旅行的必備佳品。但是由于其營養(yǎng)豐富，是微生物的天然培養(yǎng)基，非常適合腐敗及產(chǎn)生毒素的微生物生長繁殖，對人們的健康造成極大的威脅[1～3]。鑒于此，控制好低溫肉制品生產(chǎn)過程中的細(xì)節(jié)就顯得尤為重要[4，5]。

本文對低溫肉制品生產(chǎn)過程的原料、攪拌、灌裝、晾曬、包裝等關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行了微生物分析，對其中的主要污染微生物進(jìn)行了分子鑒定，期望為廣大低溫肉制品生產(chǎn)企業(yè)提供微生物防治對策的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 待檢樣品

斬拌原料、加工器具、灌裝環(huán)境、灌裝后產(chǎn)品、晾制間環(huán)境、包裝前產(chǎn)品、包裝后未二次殺菌產(chǎn)品、成品。以上樣品均由國內(nèi)一著名肉制品生產(chǎn)企業(yè)提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

細(xì)菌計數(shù)培養(yǎng)基[6]、孟加拉紅培養(yǎng)基[7]、LB培養(yǎng)基[8]、PDB培養(yǎng)基[9]。

1.1.3 設(shè)備

全自動滅菌柜、顯微鏡、電熱恒溫干燥箱、電子天平、超凈工作臺、生化培養(yǎng)箱、pH計、混合器、PCR儀、生物顯微鏡、高速離心機、電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離與培養(yǎng)

采用細(xì)菌計數(shù)培養(yǎng)基，嚴(yán)格按照文獻(xiàn)[6]記錄的方法，對待檢樣品中污染細(xì)菌的菌落總數(shù)進(jìn)行計數(shù)，以及優(yōu)勢菌群的培養(yǎng)。

1.2.2 真菌的分離與培養(yǎng)

采用孟加拉紅培養(yǎng)基，嚴(yán)格按照文獻(xiàn)[7]記錄的方法，對待檢樣品中污染真菌菌落總數(shù)進(jìn)行計數(shù)，以及優(yōu)勢菌群的培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)菌形態(tài)觀察

取步驟1.2.1中的優(yōu)勢菌種，使用革蘭氏染色法進(jìn)行染色，置于生物顯微鏡下進(jìn)行觀察，初步確定其種類。

1.2.4 真菌形態(tài)觀察

取步驟1.2.2中的優(yōu)勢菌種，進(jìn)行簡單染色，直接置于生物顯微鏡下進(jìn)行觀察，初步確定其種類。

1.2.5 優(yōu)勢細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定

細(xì)菌總DNA的提取采用CTAB法[10]進(jìn)行，16S rDNA基因擴增采用通用引物，分別為27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’[11]，反應(yīng)體系為50μL，擴增完成后，使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化回收，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，采用Genbank中的Blast程序進(jìn)行相似性分析，獲得菌株的準(zhǔn)確種屬。

1.2.6 優(yōu)勢真菌的分子生物學(xué)鑒定

真菌總DNA的提取采用文獻(xiàn)[12]記錄的方法進(jìn)行，ITS基因擴增采用通用引物，序列為：ITS1-F:5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’和ITS2：5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’反應(yīng)體系為50μL[13]，擴增完成后，使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化回收，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，采用Genbank中的Blast程序進(jìn)行相似性分析，獲得菌株的準(zhǔn)確種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 生產(chǎn)線不同部位細(xì)菌的分離與培養(yǎng)

按照1.2.1方法對斬拌原料、加工器具、灌裝環(huán)境、灌裝后產(chǎn)品、晾制間環(huán)境、包裝前產(chǎn)品、包裝后未二次殺菌產(chǎn)品、成品8個樣品進(jìn)行了污染細(xì)菌情況分析，并使用細(xì)菌計數(shù)培養(yǎng)基對其中的優(yōu)勢細(xì)菌進(jìn)行了分離培養(yǎng)，按照1.2.3的方法對獲得優(yōu)勢種類進(jìn)行觀察，數(shù)據(jù)見表1。

表1 生產(chǎn)線不同部位污染細(xì)菌情況

從表1中的數(shù)據(jù)可以看出，低溫肉制品生產(chǎn)線中不同部位污染的微生物種類和數(shù)量不完全相同。原料和灌裝環(huán)境中分離出的微生物種類和數(shù)量最多；其次是加工器具；再次是晾制間環(huán)境和未二次殺菌的產(chǎn)品。在一次殺菌后產(chǎn)品和成品中未獲得微生物，這可能與計數(shù)平板的精度有關(guān)。從上面的數(shù)據(jù)可以推斷出，產(chǎn)品經(jīng)過灌裝后，細(xì)菌總數(shù)有所上升，這可能與灌裝間環(huán)境細(xì)菌數(shù)量較大密切相關(guān)；產(chǎn)品經(jīng)過一次殺菌后，未獲得微生物，但是經(jīng)過包裝后出現(xiàn)多種細(xì)菌，這可能與包裝間環(huán)境和人員衛(wèi)生狀況有較大關(guān)系。從污染的細(xì)菌類型來看，有耐熱的芽孢菌出現(xiàn)，如果殺菌不徹底會造成產(chǎn)品的變質(zhì)。

2.2 生產(chǎn)線不同部位真菌的分離與培養(yǎng)

按照1.2.2方法對斬拌原料、加工器具、灌裝環(huán)境、灌裝后產(chǎn)品、晾制間環(huán)境、包裝前產(chǎn)品、包裝后未二次殺菌產(chǎn)品、成品8個樣品進(jìn)行了污染細(xì)菌情況分析，并使用孟加拉紅培養(yǎng)基對其中的優(yōu)勢細(xì)菌進(jìn)行了分離培養(yǎng)，按照1.2.4的方法對獲得優(yōu)勢種類進(jìn)行觀察，數(shù)據(jù)見表2。

表2 生產(chǎn)線不同部位污染真菌情況

從上面的數(shù)據(jù)可以看出：在斬拌原料以及灌裝后產(chǎn)品、灌裝環(huán)境和晾制間樣品中分離出了真菌，同時發(fā)現(xiàn)在灌裝后，菌數(shù)有所增加，這可能是由灌裝間環(huán)境污染造成的，在晾制間發(fā)現(xiàn)真菌也要引起足夠的重視。

2.3 生產(chǎn)線不同部位優(yōu)勢細(xì)菌種類

按照1.2.5方法對生產(chǎn)線中污染的優(yōu)勢細(xì)菌(共7株)進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定，具體種類及來源如下：

(1)Micrococcus luteus NCTC 2665(藤黃微球菌)。

該菌屬于一種革蘭氏陽性球菌，存在于土壤、灰塵、水、空氣和哺乳動物皮膚等生境中。這種細(xì)菌也寄生在人類的口腔、粘膜、口咽和上呼吸道。

(2)Chryseobacterium hispanicum VP48(西班牙金黃桿菌)。

該菌屬于一種革蘭氏陰性桿菌，存在于淡水環(huán)境、土壤、海洋魚類和人類等生境中，該菌也會引起人類的疾病。

(3)Staphylococcus edaphicus CCM 8730(土壤葡萄球菌)。

該菌在自然界中分布廣泛，并占據(jù)著多種生態(tài)位。由于其普遍性和適應(yīng)性，是人類、其他哺乳動物和鳥類的皮膚、皮膚腺和粘膜中的主要細(xì)菌群。

(4)Acinetobacter johnsonii ATCC 17909(約翰遜不動桿菌)。

該菌屬于一種革蘭陰性桿菌，通常存在于環(huán)境和動物體內(nèi)，偶爾可定植人體皮膚，引起導(dǎo)管相關(guān)血流感染或腹膜透析相關(guān)腹膜炎等臨床感染。

(5)Exiguobacterium indicum HHS 31(印度微小桿菌)。

該菌屬于一種革蘭氏陽性桿菌，也有一些菌種在對數(shù)生長期及穩(wěn)定生長期為球狀。具有周生鞭毛，不形成芽孢，是一類兼性厭氧菌。廣泛存在于熱泉、植物根際、空氣、海洋等生境中。

(6)Kocuria carniphila CCM 132(嗜肉庫克菌)。

該菌屬于放線菌門中革蘭氏陽性菌，在土壤和海洋中均有分布，以分布于土壤為主。

(7)Moraxella osloensis A1920(奧斯陸摩拉克菌)。

該菌屬于一種革蘭氏陰性球菌，存在于人類及動物的皮膚及消化道等處，能夠引起人類及動物疾病。

2.4 生產(chǎn)線不同部位優(yōu)勢真菌種類

按照1.2.6方法對生產(chǎn)線中污染的優(yōu)勢細(xì)菌(共2株)進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定，具體種類及來源如下。

(1)Candida boleticola CBS:6420(菌生假絲酵母)。

該菌又稱為白色念珠菌，通常存在于正常人口腔，上呼吸道，腸道及陰道等，為條件致病菌。

(2)Cutaneotrichosporon curvatus CBS:5358(彎曲隱球菌)。

該菌是隱球菌的一種，為一種病菌，可導(dǎo)致隱球菌病。存在于土壤、鳥糞、尤其是鴿糞中大量存在，也可存在于人體的體表、口腔及糞便等環(huán)境中。

3 討論

本文采用常規(guī)的微生物分離技術(shù)與手段，對低溫肉制品生產(chǎn)線關(guān)鍵點的微生物污染情況進(jìn)行了研究，初步確定了生產(chǎn)線受微生物污染的情況，從中分離出優(yōu)勢種類，使用分子生物學(xué)技術(shù)對其核糖體DNA特定序列進(jìn)行擴增，純化，測序，進(jìn)行序列比對，獲得其確切的種屬信息。

從本文低溫肉制品生產(chǎn)線關(guān)鍵點分離的物生物來源來看，主要是來自于土壤、糞便、人體體表、口腔及呼吸道等環(huán)境中，從污染的類群來看，主要是一些條件致病菌。這說明本條生產(chǎn)線的污染源可能主要來源于以下幾個方面：第一，操作工人的工作鞋或者工作靴；第二，操作工人的工作服裝清洗不及時或者不到位；第三，操作工人的防護(hù)用具佩戴不到位；第四，各個工作間之間互相聯(lián)通，造成空氣互相污染。這為企業(yè)生產(chǎn)線的優(yōu)化及產(chǎn)品質(zhì)量的控制與提升提供了重要的參考。