馬翾,張洋子,許文濤,2*

1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(食用)重點實驗室,北京 100083

DNA既能作為遺傳物質(zhì)編碼、儲存和傳遞遺傳信息，又能在納米尺度上作為精確調(diào)控物質(zhì)的獨特模板，利用可高度編程的自組裝特性來構(gòu)建納米結(jié)構(gòu)和納米材料[1-3]。DNA納米結(jié)構(gòu)的成功合成可以追溯到1982年，Seeman首次構(gòu)建了除DNA反向雙螺旋結(jié)構(gòu)以外的十字架構(gòu)型，后期又與具有堿基互補性的粘性末端的支鏈DNA分子進行編程，運用“自下而上”的分子自組裝法在納米尺度上創(chuàng)建了特殊的DNA二維晶體[4-5]，為后人利用Watson-Crick堿基配對原理的可編程性和精確性繼續(xù)探索DNA自組裝納米技術(shù)領(lǐng)域提供了指導(dǎo)[6-10]。隨著DNA分子合成技術(shù)日趨成熟以及生物材料的不斷更新，Watson-Crick堿基互補配對原則開始逐漸融入高分子自組裝領(lǐng)域，并與其他熒光基團、納米顆粒以及功能核酸結(jié)構(gòu)結(jié)合，這賦予了DNA納米材料更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能，從而使DNA突破了分子生物學(xué)的學(xué)科邊界而兼存于新型納米材料的研究中，并在物理、化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和計算機科學(xué)等領(lǐng)域有了一席之地。目前，DNA自組裝主要通過DNA瓦片組裝、DNA折紙磚和陣列這3種途徑實現(xiàn)[11]。DNA作為組裝材料具有高度的自組裝能力、精確的分子識別能力、便利的可編程性、充足的生物相容性和可降解性等特性。同時，DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)在生理條件下通過堿基之間堆疊的氫鍵、離子鍵等維持穩(wěn)定構(gòu)象，這些相互作用強度較低的鍵同時賦予了DNA分子柔性，從而使其能響應(yīng)溫度、pH、離子等物理刺激[12]。此外，序列定向雜交的能力也增加了DNA納米結(jié)構(gòu)的分子靶向?qū)傩?，使DNA成為構(gòu)建水凝膠的優(yōu)良組裝原件。

DNA水凝膠是由高度交聯(lián)的DNA分子組成，兼具了DNA分子的優(yōu)越特性以及水凝膠的高負(fù)載能力與機械強度。根據(jù)DNA水凝膠的結(jié)構(gòu)組成，可分為純DNA水凝膠(pure DNA hydrogel)和雜化DNA水凝膠(hybrid DNA hydrogel)。本文所綜述的純DNA水凝膠是指DNA(尤其是功能核酸)作為水凝膠的唯一組分、骨架或交聯(lián)劑，無其他聚合物參與，通過化學(xué)作用或物理作用交聯(lián)形成的水凝膠[12]。其中，化學(xué)交聯(lián)可利用DNA分子化學(xué)鍵交聯(lián)形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，也可利用連接酶將DNA構(gòu)建單元通過磷酯鍵共價連接；物理交聯(lián)是指通過以氫鍵為主的DNA分子堿基互補配對作用或分子鏈間的物理纏結(jié)作用等非共價鍵制備DNA水凝膠。由于化學(xué)和物理作用中均存在多重刺激反應(yīng)，結(jié)合目前已成熟或新興的核酸擴增途徑，使得DNA水凝膠在自主設(shè)計堿基分布后擁有多向選擇交叉來完成制備。如帶有回文結(jié)構(gòu)粘性末端的Y型DNA單體(Y-DNA)，可依據(jù)堿基互補配對連接形成構(gòu)建單元，再引入連接酶催化實現(xiàn)交聯(lián)-介導(dǎo)反應(yīng)；或者僅利用堿基互補原則在溫度可逆變化下交聯(lián)成膠[9,13]。

為了更好地發(fā)揮引入功能核酸后DNA水凝膠的實際效果，每一種提取方式的選擇、擴增手段的優(yōu)化和相應(yīng)的反應(yīng)設(shè)計都是一種挑戰(zhàn)。因此，本文詳細(xì)介紹了具有多功能性質(zhì)的功能核酸結(jié)構(gòu)，包括具有高度選擇性的核酸適配體、DNA核酶(DNAzymes)、G-四聯(lián)體(G-quadruplex，G4)和i-motif結(jié)構(gòu)等；并重點綜述了功能核酸DNA水凝膠制備途徑中多種DNA獲取方式和擴增手段。在此基礎(chǔ)上，總結(jié)了通過物理、化學(xué)交聯(lián)形成水凝膠的原理和過程，并提出了功能核酸DNA水凝膠組裝方法的發(fā)展方向，以期為開發(fā)高效組裝的功能核酸DNA水凝膠提供參考。

1 常用的功能核酸

功能核酸是指大量含有發(fā)夾環(huán)、四重環(huán)和凸起等結(jié)構(gòu)的核苷酸，在氫鍵、范德華力、疏水作用和堿基對等作用下形成的能進行特異性識別或具有催化功能活性的生物大分子[14]，其中包括具有獨特二級和三級結(jié)構(gòu)的單鏈核酸適配體、模擬天然酶功能的DNAzymes、富含G或C堿基的DNA鏈自組裝成的分子內(nèi)或分子間G4和i-motif結(jié)構(gòu)等[15-18]。這些功能核酸能夠在特定條件下發(fā)生構(gòu)象或性質(zhì)的改變，從而為DNA水凝膠的組裝及其結(jié)構(gòu)或功能帶來變化，其中研究與應(yīng)用于功能核酸DNA水凝膠較多的是核酸適配體和DNAzymes。同時，功能核酸普遍具有高穩(wěn)定性、低成本、易合成與編輯等優(yōu)點，所以將功能核酸序列引入DNA水凝膠能拓寬DNA水凝膠在生物傳感、環(huán)境分析、藥物控制釋放、細(xì)胞粘附和靶向癌癥治療等方面的應(yīng)用。

1.1 核酸適配體

核酸適配體是在體外從隨機DNA或RNA文庫中篩選出的單鏈寡核苷酸分子，隨后通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)進行配體[15]。由于適配體能夠折疊成二級結(jié)構(gòu)或三級結(jié)構(gòu)，因而具有高度的靶向結(jié)合能力和更大的靶向范圍[19]。通常，適配體的解離常數(shù)較低，范圍從納摩爾(nmol)到皮摩爾(pmol)，即使在底物濃度極低的情況下，或底物發(fā)生解離/結(jié)合的結(jié)構(gòu)變化后，適配體仍然能夠特異性地識別底物，從而刺激DNA水凝膠系統(tǒng)發(fā)生特定的物理或化學(xué)變化[20]。此外，適配體具有目標(biāo)識別重復(fù)性高、易于標(biāo)記和化學(xué)修飾等優(yōu)勢，同時其具有極強的穩(wěn)定性，能夠?qū)崿F(xiàn)經(jīng)過熱變性和復(fù)性間的多次循環(huán)而不喪失結(jié)合能力。因此，引入適配體的DNA水凝膠是生物傳感器的理想識別元件。此外，適配體的分子量較低，在體內(nèi)易被血液排出，故多選擇搭載在DNA水凝膠的骨架上或包裹在DNA水凝膠內(nèi)部進入體內(nèi)以輔助快速識別靶分子。

目前，核酸適配體已被廣泛應(yīng)用于靶向生物成像、分子檢測和醫(yī)學(xué)診斷[1,21]。在適配體摻入后，基于適配體合成的DNA水凝膠可以強烈抑制靶人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的增殖，但無法控制細(xì)胞的遷移，這表明適配體具有靶向基因治療的潛力[22]。此外，Zhou等[23]利用赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)適配體作為DNA接頭與2種Y-DNA單體交聯(lián)雜交形成靶依賴性可切換的功能核酸DNA水凝膠，該水凝膠中形成的剛性空間可以包裹信號分子辣根過氧化物酶(horseradis peroxidase，HRP)，當(dāng)OTA靶標(biāo)存在時，HRP被釋放，通過水凝膠體系從無色變?yōu)榫G色的視覺切換以實現(xiàn)可視化雙信號放大檢測，從而用于靈敏的比色分析。

1.2 DNAzymes

DNAzymes是通過體外篩選的方式獲得的另一類功能性核酸，其具有特異性結(jié)合切割能力和高催化活性，主體由底物鏈和酶鏈構(gòu)成，可在人工合成時設(shè)計出多功能化的DNAzymes底物，用于構(gòu)建多重依賴性的DNAzymes[16]。DNAzymes作為一種生物催化劑，可通過寡核苷酸或小分子進行有效的變構(gòu)控制，提高其催化效率[24]。當(dāng)存在輔助催化因子(通常為金屬離子或氨基酸)時，DNAzymes酶鏈可快速裂解并按照底物鏈上的特定位點進行切割，其中DNAzymes的濃度和結(jié)合在底物表面的序列量將影響切割效率[24-25]。由于DNAzymes能催化一系列磷酸二酯鍵水解和過氧化物降解等反應(yīng)，因此，可將其整合至DNA水凝膠等納米材料中，以賦予DNA水凝膠催化效應(yīng)和分子識別功能。Xiang等[26]通過將模擬過氧化物酶的DNAzyme整合到DNA基序中構(gòu)建功能性DNAzyme水凝膠。首先通過兩兩依次部分互補配對的4條單鏈形成X-DNA單體，隨后利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)延長其中4個暴露有3′-OH末端的臂，從而形成具有poly-A和poly-T的X-DNA單體以作為構(gòu)建單元，再通過poly-T和poly-A之間的雜交形成水凝膠。隨后通過將葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOx)和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)共同包封到DNAzyme水凝膠中構(gòu)建雜合級聯(lián)酶促反應(yīng)系統(tǒng)，這種高效的級聯(lián)反應(yīng)提供了可視化檢測葡萄糖/乳糖的潛在方法。

1.3 G4

1.4 i-motif結(jié)構(gòu)

i-motif結(jié)構(gòu)是在酸性條件下由C·CH+對維持的2個平行雙鏈反向平行地互相插入形成的一段富含胞嘧啶(C)的四聯(lián)體結(jié)構(gòu)[18]。i-motif結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性取決于胞嘧啶區(qū)的長度、序列長度、溫度、鹽濃度和環(huán)境pH等因素，通常在pH 3～7的范圍內(nèi)保持穩(wěn)定[29-30]。基于i-motif結(jié)構(gòu)的pH依賴性，可將其用于構(gòu)建pH響應(yīng)型功能核酸DNA水凝膠，并憑借pH的調(diào)節(jié)實現(xiàn)快速響應(yīng)。如Sharma等[31]在堿性條件下利用3條等量的兩兩互補序列組裝成Y-DNA結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)利用DNA雙鏈中心結(jié)構(gòu)域和3條半i-motif序列作為互鎖結(jié)構(gòu)域。當(dāng)調(diào)節(jié)pH為5時，Y-DNA通過i-motif結(jié)構(gòu)變化完成分子間連接，從而形成三維網(wǎng)狀功能核酸DNA水凝膠。不同pH條件下i-motif結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變使得DNA水凝膠能快速切換形態(tài)，從而實現(xiàn)在生理環(huán)境下pH響應(yīng)型純DNA水凝膠的生物傳感應(yīng)用。

2 核酸的獲取方式和擴增手段

DNA水凝膠構(gòu)建的基礎(chǔ)方式是先依據(jù)堿基互補配對原則形成組裝DNA水凝膠的交聯(lián)單元，再通過單元中留有的粘性末端相互雜交形成水凝膠網(wǎng)絡(luò)的3D結(jié)構(gòu)。然而，這種利用寡核苷酸級聯(lián)自組裝的方法存在著一定的局限性，如在高濃度DNA的自組裝過程中無法避免積累誤差，而需要消耗大量DNA形成水凝膠的高成本問題也阻礙了這一方法的實際應(yīng)用[13]。因此，目前主要通過天然核酸提取及化學(xué)合成這2種方式獲得形成DNA水凝膠的基礎(chǔ)原料，并與核酸擴增手段相結(jié)合，包括變溫擴增手段(如PCR)、等溫擴增手段(如滾環(huán)擴增、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增)以及非酶依賴的恒溫鏈?zhǔn)诫s交反應(yīng)(hybridization chain reaction，HCR)和DNA超級三明治(super sandwich)結(jié)構(gòu)等[32-35]。

2.1 基因組、質(zhì)粒的提取以及核酸的人工合成

功能核酸DNA水凝膠中的DNA可以從自然界生物體的活性組織中提取。傳統(tǒng)方法中基因組DNA的提取可通過酶溶或機械力裂解破壞細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等，隨后對游離出來的DNA等物質(zhì)進行純化除雜，最終得到的基因組DNA既要保證其雙螺旋結(jié)構(gòu)的完整，也要排除蛋白質(zhì)等有機物和離子的干擾[32]。通過測定OD260與OD280的比值可驗證所提基因組的純度，應(yīng)在1.7～1.9之間；同時還可以通過瓊脂糖凝膠電泳驗證基因組的長度、產(chǎn)量和純度，電泳結(jié)果應(yīng)顯示為1條清晰明亮的條帶。質(zhì)粒(plasmid DNA，pDNA)也是基因傳遞載體之一，由超螺旋和開環(huán)異構(gòu)體組成。超螺旋pDNA可以更有效地傳遞遺傳信息，提取高質(zhì)量的超螺旋pDNA(回收未受損的pDNA大小>5 kb)可以通過特殊色譜分離，如尺寸排阻色譜[36]。從瓊脂糖凝膠中純化基因組和質(zhì)粒的傳統(tǒng)方法包括有機萃取和電洗脫[37]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展以及市場要求的不斷提升，利用試劑盒提取基因組和質(zhì)粒已成為一種便捷、高效的方法。目前市售的試劑盒可根據(jù)DNA的生物體來源和樣本數(shù)量選擇需要的規(guī)格，并通過簡潔的步驟完成裂解、純化除雜和洗脫等工作。相比于傳統(tǒng)方法，利用試劑盒進行提取能保證基因組或質(zhì)粒的純度和高產(chǎn)率，但得到的DNA片段較短、濃度略低，最終大多需要通過核酸擴增手段進行彌補。

另一方面，通過人工合成能夠獲得可控量和可控尺寸的單鏈DNA(single-stranded DNA，ssDNA)，其主要依據(jù)為最基本的堿基互補配對原則，使用DNA合成儀設(shè)計編碼進行反向轉(zhuǎn)錄或化學(xué)合成，最終在體外篩選得到短鏈DNA分子。目前多將所需的序列、長度和濃度等要求交予生物技術(shù)公司完成，可快速得到復(fù)雜、高質(zhì)量的功能核酸。

2.2 核酸擴增手段

通過試劑盒或人工合成的方式獲得用于構(gòu)建基于功能核酸的純DNA水凝膠的核酸時，核酸原料受到成本、純度、核酸鏈長度等諸多限制，單純通過這2種方式不足以支撐純DNA水凝膠的構(gòu)建，因此，可根據(jù)核酸序列設(shè)計選擇不同的體外擴增方法，以輔助高效獲得高濃度的長DNA鏈作為搭建DNA水凝膠骨架的方法。

PCR是指在耐熱DNA聚合酶作用下延伸寡核苷酸引物并沿著模板鏈進行遺傳信息的復(fù)制，經(jīng)過20～30次“高溫變性-低溫退火-適溫延伸”過程的循環(huán)使靶標(biāo)序列擴增百萬倍[32]。PCR特異性擴增產(chǎn)物可以通過瓊脂糖凝膠電泳表征。PCR具有高度的特異性、靈敏度，以及對模板純度要求低等優(yōu)勢。但是PCR結(jié)果可能會出現(xiàn)假陰性、假陽性或者不出現(xiàn)擴增條帶等現(xiàn)象，同時PCR依賴于熱循環(huán)儀等造價高、體積大的變溫儀器，使得其在現(xiàn)場檢測中的應(yīng)用受到限制[33]。

滾環(huán)擴增(rolling circle amplification，RCA)是借鑒微生物環(huán)狀DNA分子的滾環(huán)復(fù)制方式而建立的一種體外等溫擴增技術(shù)，以1條大小范圍為26～74個核苷酸的單鏈環(huán)狀DNA模板和高度持續(xù)的DNA或RNA聚合酶完成短鏈DNA或RNA的擴增。RCA產(chǎn)物為重復(fù)的單鏈DNA或RNA，長度可高達9 000個核苷酸，可用于核酸序列擴增，也可用于信號放大。根據(jù)RCA的引物結(jié)構(gòu)可分為單引物RCA和雙引物RCA，單引物RCA最高可擴增到105倍，而雙引物RCA最高可擴增到109倍。盡管RCA的設(shè)備要求和反應(yīng)機制簡單，但是也存在著對雙鏈DNA樣品變性處理和環(huán)化處理復(fù)雜以及操作時間長等缺點[33]。在DNA水凝膠的構(gòu)建中，Lee等[38]通過酶催化的RCA和多引物鏈擴增(multi-primed chain amplification，MCA)2種方式組裝形成功能核酸DNA水凝膠。MCA是一種在RCA過程后通過添加多條引物發(fā)生的連續(xù)擴增反應(yīng)。首先進行RCA反應(yīng)獲得長ssDNA，并以此作為MCA的模板，通過調(diào)整RCA和MCA的擴增時間使得最終產(chǎn)物均為長ssDNA和雙鏈DNA(double-strand DNA，dsDNA)，從而以非共價鍵物理編織成具有鳥巢結(jié)構(gòu)的DNA水凝膠(圖1)。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)作為一種高靈敏度的等溫核酸擴增技術(shù)，能夠在等溫條件下直接擴增特定的DNA序列[39]。通過在內(nèi)部和外部設(shè)計4條引物以特異性識別靶序列上的6個區(qū)域，在鏈置換活性DNA聚合酶作用下恒溫擴增DNA。相比于RCA，LAMP操作簡單，不需要變性的DNA模板結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄，同時產(chǎn)物中會生成大量白色焦磷酸鎂沉淀，因此可快速、高效地通過肉眼或濁度儀判斷擴增產(chǎn)物，便于即時檢測。然而，LAMP的高靈敏度也使結(jié)果易產(chǎn)生假陽性。此外，鏈置換、鏈取代反應(yīng)的限制使得產(chǎn)物dsDNA片段長度一般在200～300 bp。

圖1 DNA水凝膠的掃描電子顯微鏡圖[38]Fig.1 Scanning electron microscopy images of DNA hydrogel[38]

HCR和DNA超級三明治結(jié)構(gòu)的最大優(yōu)勢都是無酶參與。HCR是通過ssDNA作為引發(fā)劑觸發(fā)2條帶有粘性末端的發(fā)夾分子，依次不斷暴露新的單鏈區(qū)域直至發(fā)夾全部打開，最終得到多個重復(fù)單元的DNA聚合物。DNA超級三明治結(jié)構(gòu)則是在靶標(biāo)DNA存在時使用含有粘性末端的信號探針與靶標(biāo)結(jié)合，殘余粘性末端繼續(xù)與下一個靶標(biāo)雜交形成超級結(jié)構(gòu)[35]。這2種無酶擴增方式都可以觸發(fā)DNA自組裝，當(dāng)靶標(biāo)存在時會釋放引發(fā)劑誘導(dǎo)發(fā)生HCR反應(yīng)或形成多標(biāo)記的DNA超級三明治結(jié)構(gòu)，由此導(dǎo)致帶切口的雙螺旋用來交聯(lián)不同的功能核酸序列。在組裝功能化DNA水凝膠時，功能核酸序列可以插入DNA超級三明治結(jié)構(gòu)信號探針的任何位置和HCR的2個發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，從而實現(xiàn)熒光信號、電化學(xué)信號等的可視化輸出。如在形成富含腺嘌呤鏈(poly-A鏈)和富含胸腺嘧啶鏈(poly-T鏈)的X-DNA基序后，使每條poly-A鏈和多條poly-T鏈在50 ℃至4 ℃的連續(xù)退火過程中發(fā)生X-DNA單體間的HCR后便能形成DNA水凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)[26]。Song等[40]報道了一種通過適配體觸發(fā)發(fā)夾結(jié)構(gòu)HCR反應(yīng)，用于制備識別并直接捕獲活性循環(huán)腫瘤細(xì)胞的DNA水凝膠。在正常情況下，發(fā)夾分子H1和H2的二級結(jié)構(gòu)自由能為負(fù)值，從而阻止凝膠系統(tǒng)的自發(fā)雜交。當(dāng)DNA引發(fā)劑存在時，H1被打開導(dǎo)致雜交反應(yīng)的自由能明顯降低，使得發(fā)夾間的自由能總和能夠驅(qū)動H1和H2交替發(fā)生HCR反應(yīng)，導(dǎo)致dsDNA的形成。其中，設(shè)計H1為二聚體以橋接dsDNA，設(shè)計H2形成柔性單鏈區(qū)域以在HCR產(chǎn)物中促進3D DNA網(wǎng)絡(luò)的形成。HCR的組裝策略在生物傳感分析中顯示出一定的放大效率，實現(xiàn)了目標(biāo)DNA的皮摩爾(pmol)水平檢測[41]。

3 DNA水凝膠的交聯(lián)方式

3.1 物理交聯(lián)方式

物理交聯(lián)的功能核酸DNA水凝膠是DNA鏈通過氫鍵、靜電作用和分子間作用力等非共價鍵高度交聯(lián)形成的三維網(wǎng)絡(luò)。由于DNA水凝膠的機械性能易受環(huán)境影響，如i-motif結(jié)構(gòu)的pH依賴性、PCR擴增DNA鏈的溫度依賴性等，整個成膠過程會依賴外部物理刺激促進相變從而顯示出可切換的宏觀變化。

DNA水凝膠接入具有pH依賴性的功能核酸結(jié)構(gòu)時能夠觸發(fā)水凝膠對pH的快速響應(yīng)，如Cheng等[42]利用i-motif結(jié)構(gòu)特性制備了隨環(huán)境pH變化可迅速成膠的功能核酸DNA水凝膠(圖2)。在堿性環(huán)境下，由i-motif參與形成的互鎖區(qū)呈無規(guī)則卷曲狀態(tài)，而Y-DNA單體由于靜電排斥被隔離而處于液態(tài)；當(dāng)pH降低為微酸性環(huán)境時，胞嘧啶部分質(zhì)子化，與未質(zhì)子化的胞嘧啶之間形成C···CH+三重氫鍵。因此，呈現(xiàn)出在pH 5.0條件下形成水凝膠，而在pH 8.0條件下水凝膠轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài)的可逆相變過程，可以幫助DNA水凝膠簡單地利用環(huán)境pH變化以控制包埋物的捕獲和釋放。除引入pH響應(yīng)型的功能核酸外，根據(jù)pH變化進行物理纏結(jié)的水凝膠多數(shù)是利用質(zhì)子化的核酸鏈上酸堿性基團電荷性質(zhì)的變化，當(dāng)pH達到等電點(即pH 5.0左右)時，電荷數(shù)量接近0，鏈上弱鍵間的作用穩(wěn)定，易達到平衡，從而能發(fā)生組裝成膠[43]。

注：Y-DNA單體的3條DNA鏈的序列(不同的區(qū)域用不同的顏色表示)是：a—5′-CCCCTAACCCCTGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAG-3′；b—5′-CCCCTAACCCCCTTACGGCGAATGACCGAA-TCAGCCT-3′；c—5′-CCCCTAACCCCAGGCTGATTCGGTTCATGC-GGATCCA-3′。圖2 pH響應(yīng)型DNA水凝膠形成示意圖[42]Fig.2 Schematic illustration of the formation of the pH-responsive DNA hydrogel[42]

溫度依賴型功能核酸DNA水凝膠是在堿基間由最簡單的氫鍵經(jīng)物理交聯(lián)而成，故當(dāng)溫度上升到80～90 ℃時，DNA雙螺旋間的氫鍵會因為變性而斷裂成2個無規(guī)卷曲的ssDNA，隨著溫度緩慢冷卻又會恢復(fù)，因此在成膠過程中溫度應(yīng)在熔點以下。如Xing等[9]設(shè)計的以帶有粘性末端的Y-DNA與接頭為構(gòu)建單元彼此互補形成的功能核酸DNA水凝膠具有溫度依賴性。經(jīng)實驗測量，二者的熔解溫度(Tm)均保持在63 ℃以下，當(dāng)溫度設(shè)置在25～50 ℃之間可循環(huán)多次凝膠至溶膠的過程，表明功能核酸DNA水凝膠能以可逆的方式對熱量作出響應(yīng)。

磁響應(yīng)型DNA水凝膠在磁場的變化下可以被遠(yuǎn)程控制折疊成各種形狀或者發(fā)生移動。在2017年，Ma等[44]首次將ssDNA片段修飾的磁性納米粒子(magnetic nanoparticles，MNPs)分散在DNA水凝膠中誘導(dǎo)磁響應(yīng)的發(fā)生(圖3)。在外部磁場的作用下，DNA水凝膠的形狀從球形變?yōu)闄E圓形，并且可以被拖動或跳躍。此外，磁響應(yīng)型DNA水凝膠還可響應(yīng)溫度(40 ℃)和酶(內(nèi)切核酸酶)的多重刺激以實現(xiàn)在凝膠與溶膠狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換?？紤]到電子器件和藥物靶向運送時，設(shè)計包埋磁性顆?？梢餌NA水凝膠在磁場變化下的體積相變，最常用的是超順磁性的Fe3O4顆粒[45]。

A：經(jīng)ssDNA修飾的磁性納米顆粒；B：Y-DNA單體、與ssDNA互補的接頭和DNA-磁性納米顆粒形成的三組分水凝膠。圖3 DNA-磁性納米顆粒水凝膠形成示意圖[44]Fig.3 Schematic illustration of the formation of DNA-MNP hydrogel[44]

3.2 化學(xué)交聯(lián)方式

化學(xué)交聯(lián)的功能核酸DNA水凝膠不僅可以通過共價鍵連接DNA構(gòu)建單元來獲得更高的機械強度和環(huán)境穩(wěn)定性，還可以通過有效的酶促反應(yīng)實現(xiàn)DNA的交聯(lián)。如限制性內(nèi)切酶、內(nèi)切核酸酶均可以輔助切割DNA分子的特定位點，從而做到對特定序列的精確水解；HRP憑借自身的直接電化學(xué)和生物電催化能力，可迅速與H2O2結(jié)合發(fā)生氧化反應(yīng)以開發(fā)高效過氧化物生物傳感器；磷酸酶、激酶的可逆地去磷酸化和磷酸化作用是發(fā)揮DNA水凝膠準(zhǔn)確可逆性的選擇之一[46-48]。將功能性不同的酶摻入水凝膠中能夠影響DNA水凝膠的溶膠-凝膠狀態(tài)，這樣動態(tài)的自組裝過程極大地擴展了功能核酸DNA水凝膠的響應(yīng)范圍[44,49]?；瘜W(xué)成膠過程中可以通過調(diào)節(jié)堿基序列將約22 kDa的蛋白質(zhì)或小分子等其他生物制劑包封在DNA水凝膠中，隨后經(jīng)環(huán)境刺激發(fā)生酶促降解達到可控釋放[50]。Xiang等[26]在X-DNA、Y-DNA、T-DNA這3個構(gòu)建單元中通過酶介導(dǎo)交聯(lián)合成了生物響應(yīng)型功能核酸DNA水凝膠，使得包封的藥物喜樹堿(camptothecin，CPT)和豬胰島素(porcine insulin)在生理條件下穩(wěn)定地可控釋放。影響整個過程穩(wěn)定性的因素包括離子濃度、構(gòu)建單元的抗水解性能、藥物尺寸大小和結(jié)合能力、解鏈溫度等。

根據(jù)酶的專一性制備功能核酸DNA水凝膠時，既能利用連接酶交聯(lián)已設(shè)計序列的DNA分子，又能在化學(xué)交聯(lián)前通過聚合酶延長DNA分子。Lee等[38]在2012年的研究中選用了一種能使DNA鏈延伸和置換的細(xì)菌噬菌體聚合酶，在成膠前延長DNA鏈，結(jié)合RCA和MCA得到的DNA水凝膠在水中具有固體性質(zhì)，出水后具有類似液體性質(zhì)，通過不斷調(diào)節(jié)含水或無水環(huán)境實現(xiàn)DNA水凝膠形態(tài)的變化?；谶@類水凝膠在水中的穩(wěn)定可逆性質(zhì)，可被用于制造以水為開關(guān)的電路。

酶在溫和的條件下運作，在熱力學(xué)和動力學(xué)控制下都能誘導(dǎo)自組裝，這有助于通過特異位點調(diào)整反應(yīng)和反應(yīng)速率,建立更多無缺陷或臨時結(jié)構(gòu)，并且經(jīng)酶包封的DNA水凝膠在各種變性劑存在的條件下表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性和自主控制行為。目前，借助酶可精確催化活性位點從而精準(zhǔn)控制凝膠狀態(tài)(ON/OFF)切換的原理來發(fā)展新應(yīng)用，如軟機器人的自主形狀記憶行為[51-52]。

4 展望

DNA水凝膠的發(fā)展主要集中于近十年，而針對功能核酸DNA水凝膠的研究更是處于初級階段，尤其是在提高功能核酸DNA水凝膠的制備效率和降低成本2個方面仍然具有較大的發(fā)展空間。此外，在DNA瓦片和DNA折紙的組裝技術(shù)上開發(fā)其他DNA納米材料可以與水凝膠材料進行互補。

傳統(tǒng)功能核酸DNA水凝膠的制備一方面對核酸的濃度以及DNA鏈的長度要求較高，并且核酸片段多依賴于人工合成，導(dǎo)致成本升高。目前已有研究將PCR、RCA和HCR等核酸擴增方法引入DNA水凝膠的制備中，擴增方法的引入不僅極大降低了水凝膠的制備成本，提高了水凝膠元件之間的組裝效率，同時實現(xiàn)了靶標(biāo)物質(zhì)的引入和檢測信號的放大，以及更為直觀地判斷水凝膠的形成。然而，隨著DNA水凝膠多領(lǐng)域應(yīng)用需求的增多，引入更多恒溫擴增方法、降低擴增過程對變溫儀器的依賴性、進一步提高擴增反應(yīng)的效率、重復(fù)率與穩(wěn)定性已成為影響DNA水凝膠制備方法改進的關(guān)鍵因素。

除了積極研究利用簡便、高效的物理相互作用、化學(xué)修飾以及生物偶聯(lián)方式進行自組裝，還可大量開發(fā)雜化DNA水凝膠，比如以DNA作為鏈的分支而非主體，在水凝膠骨架上引入其他聚合物(如聚丙烯酰胺、多糖類和纖維素等)，或者加入其他納米材料(如磁納米顆粒、石墨烯、碳納米管、量子點、碳點、納米孔、二氧化硅微球等)。這樣在提高DNA水凝膠骨架機械性能、擴展功能核酸以外的響應(yīng)功能的同時，也極大地緩解了僅以DNA交聯(lián)合成水凝膠帶來的高成本問題，有助于功能核酸DNA水凝膠的大量制備，并將極大的推動其在生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境工程、地理探測中的應(yīng)用，因此，雜化DNA水凝膠將是未來發(fā)展中值得重點關(guān)注的內(nèi)容。

在功能核酸DNA水凝膠基礎(chǔ)上構(gòu)建具有生物學(xué)功能、高機械強度的納米材料是擴展DNA自組裝技術(shù)和實際應(yīng)用的有效策略，如在DNA水凝膠結(jié)構(gòu)中配置具有規(guī)則邊緣、優(yōu)異的酶耐受性和精確的溯源性、手性的DNA四面體剛性納米材料以彌補細(xì)胞成像和檢測應(yīng)用中所需的高效的跨膜能力和機械強度。隨著組裝技術(shù)進一步的發(fā)展和改進，DNA納米材料作為新型功能元件構(gòu)建多重功能化的DNA納米機器和納米器件，將在治療、診斷平臺以及材料科學(xué)、組織工程等學(xué)科領(lǐng)域中產(chǎn)生極大的影響。