劉 焱 陳青宇, 趙曉霞 高 翔 高俊武 王靖宇

1 內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭醫(yī)學(xué)院口腔學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭市 014060； 2 內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院；3 內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市第一醫(yī)院

牙周炎發(fā)病率高，是成人失牙最主要的原因。能否有效控制感染并爭取病損部位最大限度地組織再生和重建是控制牙周炎病程進(jìn)展的重要評價(jià)指標(biāo)。隨著組織工程材料和技術(shù)的日新月異及生物信號分子研究的快速進(jìn)步，牙周組織再生進(jìn)入了蓬勃發(fā)展的時(shí)代[1]。存在于牙周韌帶組織的人牙周膜干細(xì)胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)增殖能力旺盛且具有多向分化潛能，經(jīng)誘導(dǎo)可形成牙骨質(zhì)/牙周膜樣結(jié)構(gòu)[2]。hPDLSCs被認(rèn)為是牙周組織工程中最理想的種子細(xì)胞，已成為牙周組織的再生、種植體周圍缺損的修復(fù)以及正畸牙齒微環(huán)境改建過程中重要的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[3]。hPDLSCs主要來源于健康的乳牙及年輕恒牙，然而成年人中約80%罹患慢性牙周炎，其中20%為重度牙周炎。對于這些患者，能否從炎癥狀態(tài)下的牙周韌帶中成功分離得到自體健康的hPDLSCs；長期慢性炎癥對hPDLSCs的細(xì)胞表型、增殖能力及干細(xì)胞生物學(xué)特性有無改變[4-6]都影響著i-hPDLSCs的臨床應(yīng)用。常規(guī)方法分離和純化i-hPDLSCs的成功率較低。本實(shí)驗(yàn)采用改良酶消化組織塊蓋玻片培養(yǎng)法結(jié)合有限稀釋克隆法分離和篩選i-hPDLSCs，獲得單細(xì)胞克隆i-hPDLSCs，并在擴(kuò)增后鑒定其生物學(xué)特性，以期為組織工程牙周再生治療的種子細(xì)胞的篩選與培養(yǎng)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 30～45歲慢性牙周炎患者因重度牙周炎需拔除的患牙，由包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科提供；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco，美國)；青、鏈霉素(華北制藥)；Ⅰ型膠原酶(Sigma，美國)、0.25%胰蛋白酶-EDTA(Hyclon，美國)；小鼠抗人角蛋白、小鼠抗人波形絲蛋白、小鼠抗人STRO-1單克隆抗體(Dako，美國)、羊抗小鼠IgG-FITC熒光二抗、羊抗小鼠IgG-TRITC熒光二抗(Sigma，美國)、熒光染料Hoechst33258(Sigma，美國)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma，美國)、二甲基亞砜(DMSO，Amresco，美國)。倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympas，日本)；熒光顯微鏡(BX61+DP-71，Olympus，日本)；酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀(SpectraMax M2，Molecular Devices，美國)。

1.2 改良法分離培養(yǎng)i-hPDLSCs

1.2.1 標(biāo)本納入標(biāo)準(zhǔn)：30～45歲慢性牙周炎患者因嚴(yán)重的牙周炎需要拔除的患牙，無明顯齲壞、牙髓和根尖周病變，無黏膜疾患，且所有納入個(gè)體均無全身系統(tǒng)性疾病。嚴(yán)重慢性牙周炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)(需拔牙的指征):X線片顯示牙槽骨吸收達(dá)根長的2/3，牙齒Ⅲ度松動。患者知情同意，簽署知情同意書。

1.2.2 通過酶消化組織塊蓋玻片法培養(yǎng)獲得人牙周膜細(xì)胞：75%乙醇消毒牙齒周圍組織，牙拔除后2h內(nèi)取材。在超凈臺內(nèi)以PBS沖洗牙根3～5次，刮除根中1/3部位的牙周韌帶組織，剪碎成1mm3大小，用3mg/ml的Ⅰ型膠原酶37℃下振蕩消化1h，離心吹勻后移入6孔板中。輕柔地覆蓋上蓋玻片，保持蓋玻片和組織塊之間有培養(yǎng)基充盈，補(bǔ)加2ml培養(yǎng)基，每3d換液。細(xì)胞融合達(dá)到80%時(shí)傳代。

1.2.3 有限稀釋法克隆化分離純化i-hPDLSCs：將P1代對數(shù)生長期的牙周韌帶細(xì)胞調(diào)整密度至10～15個(gè)細(xì)胞/ml，每孔100μl接種于96孔板。培養(yǎng)8～12h后，觀察選取并標(biāo)記單個(gè)細(xì)胞孔。每個(gè)孔中加入200μl含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，隔天換液。待標(biāo)記孔的細(xì)胞增殖達(dá)到孔底面積1/3～1/2 時(shí)，消化傳代，取P4代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 i-hPDLSCs的生物學(xué)性狀鑒定

1.3.1 細(xì)胞來源鑒定：取P4代i-hPDLSCs制備細(xì)胞載玻片，通過免疫熒光染色鑒定角蛋白和波形絲蛋白。其中一抗為小鼠抗人角蛋白(PCK)和小鼠抗人波形絲蛋白(vimitin)。PBS漂洗細(xì)胞爬片，多聚甲醛固定，牛血清白蛋白封閉，加入一抗后于濕盒中過夜。次日，避光條件下加入山羊抗小鼠IgG-TRITC熒光二抗繼續(xù)孵育1h，用Hoechst33258對細(xì)胞核復(fù)染，甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.2 早期間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物(STRO-1)的免疫熒光檢測：特異性一抗是小鼠抗人STRO-1單克隆抗體，二抗是山羊抗小鼠IgG-FITC熒光二抗，熒光染料Hoechst33258用于細(xì)胞核染色。具體方法同1.3.1。

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn) 將i-hPDLSCs調(diào)整密度為103個(gè)細(xì)胞/皿接種于直徑為90mm的培養(yǎng)皿。十字方向輕搖、混勻細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)14d后，通過倒置相差顯微鏡觀察和計(jì)數(shù)超過50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率(Colony forming unit-fibroblastic，CFU-F)。克隆形成率(%)= 克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 細(xì)胞增殖能力 取生長良好的P4代i-hPDLSCs，將密度調(diào)整為2×104/cm2，每孔100μl接種于96孔板中，分別培養(yǎng)1、3、5、7、9d，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。培養(yǎng)完成后，每孔加入20μl MTT溶液培養(yǎng)4h后，棄上清、向每孔加150μl DMSO，振蕩10～15min。通過酶聯(lián)免疫吸附測定490nm的波長下每孔OD值，以時(shí)間作為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.6 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期 取P4代i-hPDLSCs消化、計(jì)數(shù)并收集約3×106個(gè)吹散制成單細(xì)胞懸液，離心后加入70%乙醇吹打混勻，4℃過夜。離心棄去乙醇，避光加入50μg/ml的碘化丙錠1ml，4℃下染色30min，通過200目尼龍篩網(wǎng)，測定細(xì)胞周期。

2 結(jié)果

2.1 倒置相差顯微鏡觀察i-hPDLSCs的形態(tài) 培養(yǎng)7～14d，可見長梭或多邊形的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞出現(xiàn)，貼壁生長，較分散(圖1A)。21d后，細(xì)胞數(shù)量增多并逐漸融合，形態(tài)均一，呈長梭形，長滿孔底面積60%～70%(圖1B)。傳代后，細(xì)胞形態(tài)與原代相同，細(xì)胞胞體豐滿，胞漿均勻，束狀排布(圖1C)。

2.2 i-hPDLSCs的生物學(xué)性狀的檢測 i-hPDLSCs經(jīng)免疫熒光染色檢測顯示：vimitin陽性表達(dá)，細(xì)胞漿呈紅染，胞核呈藍(lán)染(圖2A)；PCK陰性表達(dá)，胞漿未染色，僅見細(xì)胞核呈藍(lán)染(圖2B)?？芍囵B(yǎng)細(xì)胞為間充質(zhì)來源，未有上皮細(xì)胞污染。STRO-1陽性表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)和胞核都呈綠染，同時(shí)胞核也被Hoechest33258復(fù)染，故呈藍(lán)綠色(圖2C)。

2.3 克隆形成情況 將103個(gè)細(xì)胞接種在90mm培養(yǎng)皿中，次日觀察到單個(gè)長梭形的細(xì)胞貼壁(圖3A)。培養(yǎng)10d后出現(xiàn)細(xì)胞克隆，為30～50個(gè)細(xì)胞形成的較小的克隆，細(xì)胞排列中央緊密、周圍松散；集落間細(xì)胞相距較遠(yuǎn)(圖3B)。繼續(xù)培養(yǎng)至第14天時(shí)，克隆狀生長的細(xì)胞集落變多且細(xì)胞量明顯增多，中央?yún)^(qū)域的細(xì)胞緊密接觸且邊界不清，呈放射狀或旋渦狀分布；外周區(qū)域細(xì)胞形態(tài)為長梭形或多邊形，排列較緊密(圖3C)。克隆形成率為31.87%，克隆形成能力較強(qiáng)。

圖1 倒置顯微鏡下觀察i-hPDLSCs

圖2 免疫熒光染色鑒定i-hPDLSCs的生物學(xué)性狀

2.4 細(xì)胞增殖情況 i-hPDLSCs的生長曲線呈“S”型：第1、2天時(shí)，OD值較??；細(xì)胞生長速度在第3天開始顯著增快，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長細(xì)胞數(shù)量和活性都逐漸增加；第7天時(shí)，OD值達(dá)峰值；在第9天,細(xì)胞增殖趨于平緩、進(jìn)入平臺期(圖 4)。

圖3 倒置顯微鏡下觀察有限稀釋克隆法分離純化的i-hPDLSCs

圖4 MTT法分析i-hPDLSCs的增殖情況

2.5 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期 大多數(shù)細(xì)胞處于G0/G1期(87.89%)，即靜止期和DNA合成前期；G2期細(xì)胞占比為2.08%，S期細(xì)胞占比為10.03%。上述結(jié)果表明炎癥來源的i-hPDLSCs具有慢周期性的特點(diǎn)(圖5)。

圖5 i-hPDLSCs的細(xì)胞周期檢測結(jié)果

3 討論

牙周炎癥不可逆地侵襲和破壞牙周組織，引起附著喪失，最終導(dǎo)致牙齒松動、脫落。其治療的目的不僅是控制炎癥，更重要的是促進(jìn)已受損牙周組織的再生、形成新附著，從而保存牙齒和恢復(fù)咀嚼。在再生醫(yī)學(xué)中，組織工程理論和技術(shù)的廣泛應(yīng)用為牙周組織的修復(fù)和重建提供了新的思路。

hPDLSCs是從牙周韌帶分離出的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有高增殖能力和多重分化潛能。然而牙周韌帶中存在的干細(xì)胞數(shù)量較少且來源局限，自體獲取困難，尚難以滿足臨床應(yīng)用的需要。許多嚴(yán)重的慢性牙周炎患者，由于治療效果差、預(yù)后不良，患牙不得不拔除。這些炎癥來源的患牙是否可以分離出可供臨床應(yīng)用的i-hPDLSCs？如何使其體外培養(yǎng)、分離純化的成功率更高？干細(xì)胞的特征和多重分化潛能是否會發(fā)生變化？這些問題的答案對于牙周組織再生的研究至關(guān)重要。

Park JC等[7]和談珺等[8]分別從炎癥的牙周膜及牙槽窩炎性肉芽組織中分離出了干細(xì)胞，并證實(shí)其具有高增殖和克隆形成能力以及成骨和成脂分化能力。通過構(gòu)建大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎的模型，Ohta S等[9]發(fā)現(xiàn)大鼠的牙周缺損部位可被由牙周韌帶殘余遷移而來的干細(xì)胞修復(fù)，并驗(yàn)證了這些炎癥來源的干細(xì)胞具有成骨和成牙周膜的作用。牙周炎癥發(fā)生的區(qū)域是組織修復(fù)和破壞共存并互相轉(zhuǎn)化的復(fù)合環(huán)境，干細(xì)胞的培養(yǎng)、分離及純化方式尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。用于hPDLSCs的傳統(tǒng)體外培養(yǎng)方法包括酶消化和組織塊法，但兩者都存在一些缺點(diǎn)。酶消化獲得的hPDLSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特征，但細(xì)胞數(shù)量少；低貼壁率又限制著組織塊培養(yǎng)方法的成功率。一些研究結(jié)合組織塊法和酶消化法用于培養(yǎng)hPDLSCs，雖然成功率有所提高，但組織塊貼壁率低的問題尚未得到有效解決[10-11]。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上改良方法，用蓋玻片覆蓋酶消化的組織塊，結(jié)果證實(shí)組織塊不易游走、浮出，細(xì)胞貼壁率明顯提高。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)采用有限稀釋克隆法分離純化得到的i-hPDLSCs，為單純的間充質(zhì)細(xì)胞樣的梭形結(jié)構(gòu)(經(jīng)驗(yàn)證vimitin陽性表達(dá)，PCK陰性表達(dá))，顯著減少了上皮細(xì)胞混雜的情況。

目前尚無明確的研究結(jié)論給出一種或幾種特殊的hPDLSC標(biāo)志物。2004年，Seo等最早成功分離獲得hPDLSCs,并使用早期間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志物STRO-1[12]、CD146/MICU8作為PDLSCs的標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)通過免疫熒光染色證實(shí)了i-hPDLSCs的STRO-1呈陽性表達(dá)?？寺⌒纬赡芰Ψ从沉烁杉?xì)胞的自我更新能力，本實(shí)驗(yàn)中，i-hPDLSCs經(jīng)有限稀釋克隆法培養(yǎng)至第14天可見大量克隆狀生長的細(xì)胞集落，克隆形成率為31.87%，這表明在非常低密度的培養(yǎng)條件下，i-hPDLSCs也可表現(xiàn)出較強(qiáng)的自我復(fù)制能力。i-hPDLSCs的生長曲線呈“S”型，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長至3～7d，細(xì)胞生長速度增快，細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活性也隨之逐漸增加。細(xì)胞周期是衡量增殖動力學(xué)的重要指標(biāo)，本研究細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示，炎癥來源的i-hPDLSCs在G0/G1期居多，符合干細(xì)胞慢周期性的規(guī)律。

通過改良的酶消化組織塊蓋玻片培養(yǎng)法結(jié)合有限稀釋克隆，可以從慢性牙周炎患者離體牙的牙周韌帶中分離純化得到i-hPDLSCs，且該細(xì)胞具有強(qiáng)克隆形成能力和高增殖能力、具備成體干細(xì)胞所具有的細(xì)胞周期及表型。本實(shí)驗(yàn)為研究i-hPDLSCs的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，也充實(shí)和豐富了牙周組織工程種子細(xì)胞的培養(yǎng)和篩選方法。