郭 悅，楊 軍，郭俊娒*，楊俊興，鄭國(guó)砥，李志濤，陳同斌，于 豹，倪 蕾，溫 倩，柏志賢

（1 成都理工大學(xué)旅游與城鄉(xiāng)規(guī)劃學(xué)院，成都 610059；2 中國(guó)科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所環(huán)境修復(fù)中心，北京 100101；3 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4 生態(tài)環(huán)境部環(huán)境規(guī)劃院，北京 100012；5 石家莊市環(huán)境保護(hù)局欒城區(qū)分局，河北 051430）

鉛 (Pb) 是自然環(huán)境中最具毒性的重金屬元素之一，是一種不可降解的環(huán)境污染物質(zhì)，采礦、電鍍、冶煉等工業(yè)活動(dòng)排放的三廢、農(nóng)田污水灌溉以及化肥、農(nóng)藥不合理施用等因素導(dǎo)致我國(guó)土壤Pb 污染問題較為嚴(yán)重[1-3]。據(jù)《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示，我國(guó)土壤中Pb 點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)1.5%，并且直接或間接通過食物鏈威脅我國(guó)糧食安全和人體健康。土壤重金屬污染的治理已引起社會(huì)的廣泛關(guān)注[1-3]。植物修復(fù)技術(shù)以其修復(fù)成本低、操作簡(jiǎn)單、不造成二次污染等優(yōu)點(diǎn)而成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，被認(rèn)為是最具應(yīng)用潛力的綠色修復(fù)技術(shù)。

利用植物修復(fù)重金屬污染土壤主要存在兩種策略，一種為利用Pb 超富集植物對(duì)土壤Pb 的超積累能力，在可移除部位富集高濃度的Pb，從而修復(fù)污染土壤。然而，目前對(duì)于鉛超富集植物的發(fā)現(xiàn)和研究仍然較少，僅羽葉鬼針草 (Bidens maximowicziana)、圓錐南芥 (Arabis paniculata L.)、園葉遏蘭菜 (Thlaspi rotundifolium) 等十余種，且多存在植株生長(zhǎng)緩慢、生物量較低等缺點(diǎn)，限制了其在土壤修復(fù)中的應(yīng)用價(jià)值[4]。另一種策略則為利用大生物量的耐性植物進(jìn)行修復(fù)，其生長(zhǎng)迅速，生物量較大，對(duì)土壤中重金屬具有一定的富集能力[5]。向日葵是常見的植物類型，分布廣泛，生長(zhǎng)迅速，具有悠久的栽培歷史[6-8]。有研究表明，向日葵對(duì)Pb 具有較強(qiáng)的耐性和富集能力，地上部Pb 含量可達(dá)200 mg/kg 以上，具有應(yīng)用于Pb 污染土壤修復(fù)的潛力。

然而，從修復(fù)效率角度與Pb 超富集植物相比，向日葵的Pb 富集能力仍相對(duì)較低，需進(jìn)一步促進(jìn)向日葵對(duì)Pb 的修復(fù)效率。施用化學(xué)肥料是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最重要的農(nóng)藝措施，肥料不僅可提高土壤肥力，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，還可改變土壤酸堿性，與土壤中重金屬離子發(fā)生沉淀、吸附、解吸和絡(luò)合等作用，從而影響重金屬的賦存形態(tài)和生物有效性[9-10]。郭勁君等[11]研究發(fā)現(xiàn)，施用氮磷鉀肥顯著促進(jìn)了波斯菊和硫華菊對(duì)Pb 的吸收。目前，關(guān)于施肥對(duì)向日葵根際土壤Pb 形態(tài)及向日葵對(duì)Pb 的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和修復(fù)效率的影響仍少見報(bào)道，對(duì)Pb 脅迫條件下不同向日葵品種對(duì)Pb 的耐性、解毒機(jī)理也尚不明晰。

鑒于此，本研究以三個(gè)向日葵品種為研究對(duì)象，研究鉛污染土壤中不同施肥措施對(duì)向日葵鉛吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)的影響并進(jìn)一步探索向日葵對(duì)鉛脅迫的耐性和解毒機(jī)制，以期探明提高向日葵鉛修復(fù)效率的合理施肥措施，為向日葵合理修復(fù)我國(guó)大面積中輕度鉛污染農(nóng)田土壤提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究采用盆栽實(shí)驗(yàn)，供試土壤采自河南省某鉛鋅冶煉企業(yè)周邊污染農(nóng)田表層(0—20 cm) 土壤。該地區(qū)農(nóng)田長(zhǎng)期受鉛鋅冶煉企業(yè)大氣沉降影響，導(dǎo)致表層土壤中平均Pb 含量達(dá)到174 mg/kg，超過《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)》(GB15618-2018) 的風(fēng)險(xiǎn)篩選值 (170 mg/kg，pH ＞7.5)，有效態(tài)Pb 含量達(dá)67.8 mg/kg。土壤樣品采集后自然風(fēng)干并過2 mm 篩，測(cè)定土壤基本理化性質(zhì)，供試土壤pH 為7.7，土壤全氮、全磷、全鉀含量分別為1.18 g/kg、0.860 g/kg 和26.6 g/kg，堿解氮83.7 mg/kg，有效磷23.0 mg/kg，速效鉀140 mg/kg，有機(jī)質(zhì)含量為19.4 g/kg，陽(yáng)離子交換量為20.1 mmol/kg。

通過前期田間試驗(yàn)，從29 種向日葵品種中篩選出Pb 富集能力較強(qiáng)的食用葵、油葵和觀賞葵各一個(gè)品種作為供試植物，分別為L(zhǎng)D5009 (食用葵)、T562(油葵) 和歡樂火炮竹 (觀賞葵)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用雙因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。因素1，LD5009、T562 和歡樂火炮竹三個(gè)不同向日葵品種；因素2，不施肥 (CK)、單施氮肥 (N)、氮磷配施 (NP) 和氮磷鉀配施 (NPK) 四個(gè)不同施肥處理。共設(shè)12 個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3 次重復(fù)。氮磷鉀肥料施用參考當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶施肥習(xí)慣，分別使用尿素、過磷酸鈣和氯化鉀，施肥量設(shè)為N 150 mg/kg、P2O5250 mg/kg、K2O 100 mg/kg。

盆栽試驗(yàn)于2017 年6 月進(jìn)行，采用25 cm × 20 cm 塑料花盆，將上述過篩土壤裝入盆中，每盆裝2 kg 土壤，按不同處理將所有肥料均作為基肥一次性施入土壤中，與土壤充分混合后平衡1 周，將向日葵種子播種到土壤中，待向日葵幼苗長(zhǎng)至10 cm左右時(shí)進(jìn)行間苗，每盆保留2 株幼苗。整個(gè)試驗(yàn)周期為40 天，期間晝夜溫度為20℃到35℃，保持土壤水分在田間持水量的70%左右。

1.3 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，將收獲的向日葵樣品分為地上部和根部樣品，地上部樣品取一部分新鮮葉片，儲(chǔ)存于-80℃冰箱中，待測(cè)葉片中Pb 的亞細(xì)胞分布。另一部分地上部與根部樣品先用清水洗凈再用去離子水沖洗3 遍，然后在105℃烘箱中殺青半小時(shí)，70℃烘干至恒重，測(cè)定生物量，并將地上部與根部樣品分別磨碎，過0.25 mm 篩待測(cè)。同時(shí)采用抖根法采集向日葵根際土壤，土壤樣品自然風(fēng)干后，研磨并過2 mm 和0.15 mm 篩備用。

土壤樣品消解方法依據(jù)美國(guó)環(huán)保局US EPA 3050B 方法，稱取過0.15 mm 篩的土壤樣品0.2 g 到50 mL 三角瓶中，采用HNO3-H2O2法進(jìn)行消解，定容至50 mL 容量瓶中，消解液中Pb 含量采用電感耦合等離子光譜儀 (ICP-OES，5300DV，Perkin Elmer，美國(guó)) 測(cè)定，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) (GBW07402) 進(jìn)行化學(xué)分析質(zhì)量控制 (95% ±5%)。土壤pH 值采用電極法 (ISO 10390 2005) 進(jìn)行測(cè)定。

土壤中Pb 形態(tài)分析采用改進(jìn)BCR 順序提取法測(cè)定[12]，分別采用0.11 mol/L HOAc、0.5 mol/L NH2OH·HCl、8.8 mol/L H2O2和1 mol/L NH4OAc 順序提取出弱酸提取態(tài)、可還原態(tài)、可氧化態(tài)三種形態(tài)，提取后殘?jiān)捎肏Cl-HNO3-HClO4法進(jìn)行消解，用ICP-OES 測(cè)定。

稱取0.5 g 過0.25 mm 篩的植物樣品到50 mL 容量瓶中，采用HNO3-HClO4(5∶1，v∶v) 法進(jìn)行消解，溶液澄清后定容至50 mL，消解液中Pb 含量采用電感耦合等離子光譜儀 (ICP-OES，5300DV，Perkin Elmer，美國(guó)) 測(cè)定，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) (GBW-07603) 進(jìn)行化學(xué)分析質(zhì)量控制(95% ± 5%)。

向日葵葉片中Pb 的亞細(xì)胞分布采用差速離心方法進(jìn)行測(cè)定[13-15]，稱取0.2 g 新鮮向日葵葉片在液氮條件下研磨，加入10 mL pH 7.5 的緩沖液 (0.25 mol/L 蔗糖、50 mmol/L Tris-HCl 和1.0 mmol/L 二硫赤蘚糖醇) 攪拌均勻，均漿在不同離心力條件下可分離為5 個(gè)亞細(xì)胞組分。首先在15000 × g 離心15 min，所得上清液在100000 × g 繼續(xù)離心1 h，所得沉積物即為細(xì)胞器組分 (organelle)，上清液80℃水浴10 min 后冰冷卻1 h，然后在50000 × g 繼續(xù)離心15 min，獲得上清液和沉積物分別為熱穩(wěn)定蛋白(heat stable protein，HSP) 和熱敏感蛋白組分 (heat denatured protein，HDP)。15000 × g 離心后所得沉積物加入2 mL超純水再懸浮，于100℃水浴2 min，再加入2 mL 1.0 mol/L NaOH 于70℃水浴1 h，然后在10000 × g 離心15 min，獲得上清液和沉積物分別為細(xì)胞碎屑 (cellular debris) 和金屬富集顆粒體組分(metal rich granule，MRG)，以上離心步驟均在4℃條件下進(jìn)行。所獲得的5 個(gè)亞細(xì)胞組分均按照植物樣品消解方法進(jìn)行消解，采用電感耦合等離子質(zhì)譜儀 (ICP-MS，Elan DRC-e，Perkin Elmer，USA) 測(cè)定其Pb 含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的相關(guān)計(jì)算，試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS Statistics 19 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，不同處理間采用最小顯著差數(shù)法 (LSD 法) 進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn) (P ＜ 0.05)，采用OriginPro 2016 軟件進(jìn)行作圖。

轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù) (transfer factors，TF) 為植物地上部重金屬與地下部重金屬濃度的比值，可用于評(píng)價(jià)植物將重金屬?gòu)牡叵虏肯虻厣喜窟\(yùn)輸和富集的能力。

重金屬富集量 (heavy mental accumulation) 為植物各部位 (地上部、根部) 生物量與其重金屬濃度的乘積，表示植物各部位富集重金屬的總量。

2 結(jié)果與分析

2.1 施肥對(duì)向日葵生物量的影響

由施肥對(duì)向日葵地上部和根部生物量的影響(圖1)可知，3 個(gè)向日葵品種地上部生物量在0.60～2.73 g/株之間，地下部生物量在0.15～0.36 g/株之間。雙因素方差分析結(jié)果表明，向日葵地上部和根部生物量受品種和施肥的極顯著影響 (P ＜ 0.001)，不同品種向日葵地上部與根部生物量具有顯著差異，且在各施肥處理下均遵循LD5009 ＞ T562 ＞ 歡樂火炮竹。同時(shí)，不同施肥處理均顯著提高了向日葵地上部和根部生物量，且對(duì)3 個(gè)品種生物量的促進(jìn)效果一致，均為NPK ＞ NP ＞ N ＞ CK，與對(duì)照相比，施NPK 處理下LD5009、T562、歡樂火炮竹品種地上部生物量分別提高了152%、126%和80%，同時(shí)，NPK 處理顯著高于N 和NP 處理 (P ＜ 0.05)。

2.2 施肥對(duì)向日葵Pb 吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

圖 1 不同施肥處理下三種向日葵的生物量Fig. 1 Biomass of three sunflower cultivars under different fertilization treatments

由表1 可知，向日葵對(duì)Pb 的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)受不同品種和施肥措施的極顯著影響 (P ＜ 0.001)，LD5009、歡樂火炮竹和T562 地上部Pb 富集濃度分別可達(dá)43.77～67.41、60.71～83.10 和62.37～72.67 mg/kg，歡樂火炮竹在各施肥處理下地上部Pb 富集濃度均高于LD5009 和T562。不同施肥處理均提高了向日葵地上部和根部Pb 富集濃度，且對(duì)3 個(gè)品種的促進(jìn)效果趨勢(shì)一致，均為NPK ＞ NP ＞ N ＞ CK。與對(duì)照相比，NPK 處理下LD5009、T562 和歡樂火炮竹地上部Pb 富集濃度分別提高了54.0%、36.9%和16.5%，同時(shí)，NPK 處理顯著高于N 和NP 處理 (P ＜ 0.05)。

施肥對(duì)向日葵Pb 富集量的影響如圖2 所示，三個(gè)品種向日葵Pb 均主要富集在地上部，分別是地下部的7.2～8.3 倍、7.3～13.0 倍和3.8～5.7 倍。雙因素方差分析結(jié)果表明，向日葵地上部和根部Pb 富集量受品種和施肥處理的極顯著影響 (P ＜ 0.05)，三個(gè)向日葵品種地上部和根部Pb 富集量均為L(zhǎng)D5009 ＞T562 ＞ 歡樂火炮竹。不同施肥處理均顯著提高了向日葵地上部和根部Pb 富集量，其中NPK 處理對(duì)向日葵Pb 富集量提高效應(yīng)最顯著，與對(duì)照相比，NPK處理下LD5009、T562 和歡樂火炮竹地上部Pb 富集量分別提高了2.9、2.1 和1.1 倍，且顯著高于N 和NP 處理 (P ＜ 0.05)。

表 1 施肥對(duì)三種向日葵鉛吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)的影響Table 1 Effect of fertilizers on the Pb uptake and translocation in three sunflower cultivars

2.3 施肥對(duì)向日葵植物葉片中Pb 亞細(xì)胞分布的影響

圖3 表明，向日葵葉片中Pb 在不同亞細(xì)胞組分的濃度由高到低為金屬富集顆粒 ＞ 細(xì)胞碎屑 ＞ 熱穩(wěn)定蛋白 ＞ 細(xì)胞器組分 ＞ 熱敏感蛋白。施肥顯著增加了金屬富集顆粒和細(xì)胞碎屑中Pb 含量，而對(duì)熱穩(wěn)定蛋白、細(xì)胞器和熱敏感蛋白組分中Pb 含量沒有顯著影響。

NPK 施肥處理下，LD5009 和T562 葉片金屬富集顆粒中Pb 含量較對(duì)照分別顯著提高了30.8% 和30.5%，而歡樂火炮竹品種則顯著降低了21.8%(P ＜0.05)。同時(shí)，NPK 肥料配施處理使LD5009 和歡樂火炮竹細(xì)胞碎屑中Pb 含量顯著提高了2.5 倍和2.1倍 (P ＜ 0.05)，而對(duì)T562 則沒有顯著影響。

三種向日葵葉中Pb 均主要分布在金屬富集顆粒組分 (56.1%～86.4%)，細(xì)胞碎屑次之 (8.1%～38.3%)，而在其他三個(gè)亞細(xì)胞組分 (熱穩(wěn)定蛋白、熱敏感蛋白和細(xì)胞器組分) 中的分布比例僅為3.75%～8.66% (圖4)。施肥顯著影響了Pb 在亞細(xì)胞組分中的分布比例，以NPK 配施處理作用最顯著。與對(duì)照相比，NPK 施肥處理下LD5009 和歡樂火炮竹品種Pb 在金屬富集顆粒組分的分布比例分別降低了11.5%和30.5%，而在細(xì)胞碎屑組分分別提高了134% 和172% (P ＜ 0.05)。與之相反，T562 品種中Pb 在金屬富集顆粒組分的分布比例提高了13.4%，而在細(xì)胞碎屑組分的分布比例略有下降。NPK 施肥處理下，LD5009 葉中Pb 在生物解毒組分 (金屬富集顆粒+熱穩(wěn)定蛋白) 中的分布比例顯著高于歡樂火炮竹和T562，且歡樂火炮竹葉中Pb 在生物解毒組分的分布比例與對(duì)照相比顯著降低30.7%，而在金屬敏感組分(細(xì)胞器+熱敏感蛋白) 中的分布比例則顯著提高了75.9% (P ＜ 0.05)。

2.4 施肥對(duì)土壤Pb 形態(tài)的影響

圖 2 不同施肥處理下三種向日葵Pb 的富集量Fig. 2 Pb accumulation in three sunflower cultivars under different fertilization treatments

表2 顯示，向日葵根際土壤pH 值在7.70～7.76之間，各施肥處理對(duì)向日葵根際土壤pH 的影響均未達(dá)顯著水平。土壤中Pb 主要以弱酸提取態(tài)存在，達(dá)38.0%～47.9%，其次是可還原態(tài) (19.0%～25.9%) 和可氧化態(tài) (15.7%～27.5%)，殘?jiān)鼞B(tài)賦存比例最低(11.5%～17.8%)。雙因素方差分析結(jié)果表明，向日葵根際土壤Pb 形態(tài)受施肥處理和向日葵品種的顯著影響，與對(duì)照相比，各施肥處理均顯著降低了弱酸提取態(tài)Pb 的含量，而顯著增加了可氧化態(tài)Pb 的含量。施NPK 肥處理下，LD5009、歡樂火炮竹和T562 根際土壤弱酸提取態(tài)Pb 含量較不施肥處理分別顯著降低了14.6%、17.0%和7.5%(P ＜ 0.05)，可氧化態(tài)Pb 含量分別顯著提高了49.1%、23.5% 和38.5%。向日葵根際土壤可還原態(tài)Pb 含量受施肥處理影響較小，而受向日葵品種的顯著影響，LD5009根際土壤可還原態(tài)Pb 含量達(dá)52.5～54.7 mg/kg，顯著高于歡樂火炮竹 (40.0～44.2 mg/kg) 和T562(42.1～47.3 mg/kg)。

3 討論

圖 3 施肥對(duì)三種向日葵葉片亞細(xì)胞組分中鉛含量的影響Fig. 3 Effect of fertilizers on Pb concentrations of different subcellular fractions in leaves of t hree sunflower cultivars

利用大生物量的重金屬耐性植物修復(fù)污染土壤是植物修復(fù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[5]。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)許多農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物的植物修復(fù)應(yīng)用潛力進(jìn)行了探索。向日葵具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)迅速和生物量大等特點(diǎn)，被認(rèn)為是修復(fù)重金屬污染土壤的理想材料[16-18]。Niu 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，向日葵對(duì)Cd、Pb、Cu 等重金屬的耐性和富集能力均高于玉米、蓖麻、苜蓿和芥菜等作物。此外，Nehnevajova等[20]對(duì)15 個(gè)向日葵品種進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)Salut 品種對(duì)Cd、Pb、Zn 的萃取效率顯著高于其他向日葵品種。本研究中，三種向日葵對(duì)Pb 的富集能力差異明顯，這與前人的研究結(jié)果一致。

圖 4 施肥對(duì)三種向日葵葉片中Pb 的亞細(xì)胞分布的影響Fig. 4 Effect of fertilizers on subcellular distribution of Pb in leaves of three sunflower cultivars

施肥是傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最重要的農(nóng)藝措施之一，不僅可以提供植物生長(zhǎng)所需的養(yǎng)分，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，還會(huì)對(duì)土壤理化性質(zhì)產(chǎn)生不同的影響，從而進(jìn)一步影響土壤中重金屬形態(tài)和有效性[9-10]。施用氮磷鉀肥使硫華菊和波斯菊地上部Pb 富集量顯著提高了2.8 倍和4.4 倍[11]。修復(fù)植物的生物量是決定其重金屬富集總量的重要因素[21]。本研究中，各施肥處理對(duì)三種向日葵生長(zhǎng)均有明顯的促進(jìn)作用，其中NPK 配施處理對(duì)地上部和根部生物量的提高最為顯著，且顯著高于N 和NP 施肥處理。這與Li 等[22]研究結(jié)果一致，添加氮磷鉀肥料顯著促進(jìn)了Cd 脅迫下籽粒莧的生長(zhǎng)。Pankovic 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，添加7.5 mmol/L 的氮可提高向日葵葉片的光合效率，土壤中添加可溶態(tài)或難溶態(tài)的磷均可使向日葵地上部和根部生物量顯著增加[24]，曹柳等[25]研究認(rèn)為鉀是影響向日葵生物量的關(guān)鍵因子。在重金屬脅迫下，植物可能因?yàn)橹亟饘俚霓卓棺饔糜绊懫錉I(yíng)養(yǎng)元素的吸收[26]，本研究中，添加N、P、K 化學(xué)肥料后通過協(xié)同作用[11]，促進(jìn)葉綠素合成、提高光合效率，促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)和提高植物抗逆性，從而降低Pb 對(duì)向日葵的脅迫，促進(jìn)向日葵生長(zhǎng)。盡管施肥對(duì)三個(gè)向日葵品種生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用，但在相同施肥處理下，對(duì)LD5009 生物量的提高效應(yīng)顯著高于歡樂火炮竹和T562，可知向日葵不同品種自身生長(zhǎng)特性以及Pb 脅迫下對(duì)N、P、K 養(yǎng)分的響應(yīng)具有顯著差異[27]。

本研究中，三個(gè)向日葵品種間Pb 富集能力表現(xiàn)出較大差異，其可能由不同向日葵品種Pb 耐性機(jī)制的差異而導(dǎo)致的[28]。不同施肥處理均提高了其地上部和根部Pb 濃度，且NPK 配施處理對(duì)向日葵Pb 吸收的促進(jìn)作用最為顯著，且顯著高于N 和NP 處理。Zaccheo 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，施用銨態(tài)氮肥后，植物吸收NH4+引起H+的分泌，造成根際土壤pH 下降，從而提高了根際土壤中Pb 的有效性，促進(jìn)向日葵地上部和根部Cd 吸收。而本研究中施氮處理均未對(duì)土壤pH 值產(chǎn)生顯著影響，其原因可能由于本研究供試土壤為北方褐土，pH 達(dá)7.7，對(duì)酸性肥料有較強(qiáng)的緩沖性能，而本試驗(yàn)設(shè)置的施氮量參照當(dāng)?shù)剞r(nóng)民習(xí)慣施肥量添加，不足以使土壤pH 發(fā)生顯著變化。一般研究結(jié)果認(rèn)為施用含磷化合物可有效降低植物體內(nèi)Pb 吸收和向木質(zhì)部的運(yùn)輸[24]，其作用機(jī)理主要為兩個(gè)途徑，一個(gè)是磷酸鹽類化合物加入土壤中導(dǎo)致土壤顆粒表面負(fù)電荷增加進(jìn)而對(duì)Pb 的吸附作用增強(qiáng)，另一個(gè)是H2PO4-與土壤中Pb2+形成低溶解度的磷酸鉛鹽[30]。而本研究中NP 處理下三種向日葵品種地上部和根部Pb 含量與施氮處理相比沒有顯著差異，其可能是由于本試驗(yàn)供試土壤Pb 活性較高，DTPA提取態(tài)鉛含量達(dá)67.8 mg/kg，占總量的39.1%，本試驗(yàn)中磷肥施用量難以使土壤中Pb 活性明顯下降。祁由菊等[31]研究發(fā)現(xiàn)在石灰性潮土上單施鉀肥降低了植株P(guān)b 的遷移總量，而鉀肥與氮肥配施則顯著提高了植物對(duì)Pb 的吸收，這與本研究結(jié)果一致，本研究中施肥處理對(duì)向日葵Pb 吸收的促進(jìn)作用可能是，一方面氮磷鉀肥配施促進(jìn)向日葵根系生長(zhǎng)，增加了根系與土壤中Pb 的接觸面積；另一方面肥料中NH4+、Ca2+、K+可與Pb2+競(jìng)爭(zhēng)黏土礦物、有機(jī)質(zhì)及氧化物表面的吸附點(diǎn)位，從而改變了土壤中Pb 的賦存形態(tài)，進(jìn)一步增加了向日葵對(duì)Pb 的吸收[32]。

各施肥處理均顯著提高了向日葵地上部和根部Pb 富集量，氮磷鉀肥配施對(duì)其促進(jìn)作用最顯著。盡管各施肥處理下歡樂火炮竹地上部Pb 含量均顯著高于LD5009 和T562，但由于其地上部生物量相對(duì)較低，其Pb 富集量反而顯著低于LD5009 和T562。因此，施肥對(duì)向日葵Pb 修復(fù)效率的提高作用可通過促進(jìn)向日葵對(duì)Pb 的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)以及提高生物量?jī)蓚€(gè)方面實(shí)現(xiàn)，其中，促進(jìn)向日葵生長(zhǎng)可能是提高其修復(fù)效率的主要因素[25]。

表 2 施肥對(duì)三種向日葵根際土壤pH 及Pb 形態(tài)的影響Table 2 Effect of fertilizers on the pH and Pb species in the rhizosphere soil of three sunflower cultivars

植物體內(nèi)重金屬的亞細(xì)胞區(qū)隔化是植物對(duì)重金屬耐性和解毒的重要機(jī)制，對(duì)向日葵葉中Pb 在不同亞細(xì)胞組分中分布的研究有助于闡明向日葵對(duì)Pb 的解毒和生物富集機(jī)制[14,33]。在本研究中，三種向日葵葉片亞細(xì)胞組分中Pb 含量分布依次為金屬富集顆粒 ＞細(xì)胞碎屑 ＞ 熱穩(wěn)定蛋白 ＞ 細(xì)胞器 ＞ 熱敏感蛋白。細(xì)胞壁是植物抵抗重金屬脅迫的第一道屏障，細(xì)胞壁上含有大量羥基和羧基等官能團(tuán)，提供大量帶負(fù)電荷的結(jié)合位點(diǎn)與Pb2+結(jié)合，從而限制Pb 的跨膜運(yùn)輸，保障植物正常的生理代謝[34]。本研究中，施肥處理促進(jìn)了向日葵對(duì)Pb 的吸收，隨著向日葵地上部Pb 含量的提高，其在細(xì)胞碎屑組分中的含量和分布比例也隨之顯著提高，其中歡樂火炮竹亞細(xì)胞組分中Pb 含量提高幅度最大，LD5009 次之，T562 則無顯著差異，其結(jié)果與三種向日葵Pb 富集能力差異的研究結(jié)果一致，進(jìn)一步說明了細(xì)胞壁是植物體內(nèi)Pb 的首要結(jié)合點(diǎn)位，是向日葵體內(nèi)重要的Pb 富集機(jī)制[33]。隨著進(jìn)入向日葵體內(nèi)Pb 濃度的升高，當(dāng)細(xì)胞壁上結(jié)合點(diǎn)位飽和后，過量的Pb 會(huì)跨膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與亞細(xì)胞組分結(jié)合，其中金屬富集顆粒組分Pb 分布比例在56.1%～86.4%，且不同施肥處理下，金屬富集顆粒組分中Pb 含量也隨之增加。金屬富集顆粒體為重金屬進(jìn)入細(xì)胞后發(fā)生沉淀作用而形成的不溶性結(jié)核，從而降低細(xì)胞中重金屬離子的活性和毒性，其主要儲(chǔ)存在液泡中，也可分布在其他細(xì)胞器組分[13-14]。研究表明，將過量的Pb 區(qū)隔在金屬富集顆粒組分可能是Pb 脅迫下向日葵在亞細(xì)胞水平上的重要解毒機(jī)制[35]。熱穩(wěn)定蛋白組分包括植物螯合肽(phytochelatins，PCs) 與金屬硫蛋白 (metallothioneins，MTs) 等，有研究表明，Pb 脅迫誘導(dǎo)植物體內(nèi)產(chǎn)生植物螯合肽，從而與進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)的Pb 進(jìn)行絡(luò)合以減輕其毒害[36]。而本研究中Pb 在向日葵熱穩(wěn)定蛋白中的分布比例僅占2.0%～6.6%，且施肥處理下向日葵體內(nèi)Pb 含量的提高也未引起熱穩(wěn)定蛋白中Pb 含量的顯著變化，這與Li 等[34]對(duì)小蓬草Pb 脅迫下亞細(xì)胞區(qū)隔化的研究結(jié)果一致，其原因可能是向日葵體內(nèi)Pb 與金屬硫蛋白結(jié)合是一個(gè)過渡機(jī)制，與金屬硫蛋白結(jié)合的Pb 被轉(zhuǎn)運(yùn)到金屬富集顆粒形成位點(diǎn)，從而增加了金屬富集顆粒組分中Pb 含量[37]。因此，金屬顆粒組分和熱穩(wěn)定蛋白等植物體內(nèi)重金屬低活性組分可以整合為一個(gè)綜合概念—生物解毒組分，而將對(duì)重金屬敏感的組分 (細(xì)胞器和熱敏感蛋白) 作為一個(gè)整體組分—金屬敏感組分來研究，將有助于揭示植物重金屬潛在毒性和解毒機(jī)制[38]。本研究中向日葵體內(nèi)Pb 在生物解毒組分中的分布比列為70.3%～89.6%，而在金屬敏感組分中僅占1.2%～3.3%，且在施肥促進(jìn)向日葵Pb 吸收的情況下，其金屬敏感組分中Pb 含量并沒有表現(xiàn)出顯著提高，可知向日葵體內(nèi)細(xì)胞碎屑和金屬富集顆粒中Pb 的分布是導(dǎo)致三個(gè)向日葵品種對(duì)土壤中Pb 富集能力差異的重要機(jī)制。

土壤中Pb 的遷移性和有效性受土壤pH、Eh、CEC、有機(jī)質(zhì)等理化因素的影響，其本質(zhì)直接影響土壤中Pb 的賦存形態(tài)，化學(xué)肥料的添加可引起土壤中這些性質(zhì)的變化，從而使土壤Pb 形態(tài)發(fā)生改變，進(jìn)一步影響植物對(duì)Pb 的吸收[39]。本研究通過BCR 逐步提取法將向日葵根際土壤中Pb 形態(tài)分為弱酸提取態(tài)、可還原態(tài)、可氧化態(tài)以及殘?jiān)鼞B(tài)，不同形態(tài)Pb 的生物有效性也不同，弱酸提取態(tài)主要包括可交換態(tài)和碳酸鹽結(jié)合態(tài)，在土壤環(huán)境中可移動(dòng)性和生物有效性最強(qiáng)，是土壤中植物可吸收利用的主要形態(tài)，受土壤pH 等因素的調(diào)控；可還原態(tài)主要為鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)，當(dāng)土壤環(huán)境中Eh 降低時(shí)，部分可被還原進(jìn)入土壤溶液中，具有潛在生物有效性，其有效性低于弱酸提取態(tài)；可氧化態(tài)主要為有機(jī)結(jié)合態(tài)，在土壤環(huán)境中較為穩(wěn)定，難以釋放到土壤溶液中被生物吸收利用，有效性僅高于殘?jiān)鼞B(tài)。本研究中，各施肥處理下向日葵根際土壤Pb 形態(tài)分布特征均表現(xiàn)為弱酸提取態(tài) ＞ 可還原態(tài) ＞ 可氧化態(tài) ＞ 殘?jiān)鼞B(tài)，弱酸提取態(tài)和可還原態(tài)總量占50%～70%，劉霞等[40]對(duì)潮土和潮褐土中Pb 形態(tài)的研究發(fā)現(xiàn)土壤中碳酸鹽結(jié)合態(tài)和鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，總和可達(dá)40%～80%，其研究結(jié)果與本文一致。本研究中，施肥處理對(duì)土壤pH 沒有顯著影響，而NP 和NPK 處理卻顯著降低了土壤弱酸提取態(tài)Pb 含量，其主要原因可能是施肥帶入的NH4+、Ca2+和K+等陽(yáng)離子將土壤膠體表面吸附的Pb2+置換出來，再通過H2PO4-與土壤中Pb2+形成低溶解度的磷酸鉛鹽，從而降低了弱酸提取態(tài)Pb 含量[30]。盡管如此，施肥處理下三種向日葵品種地上部Pb 積累量仍較對(duì)照有顯著增加，其原因可能有兩方面:其一，本研究供試土壤為鉛鋅冶煉廠周邊污染土壤，主要污染來源為大氣沉降，因而其土壤中Pb 活性較高。在NP 和NPK 處理下，三種向日葵根際土壤弱酸提取態(tài)Pb 含量盡管有所降低 (5.8%～17.0%)，但其土壤弱酸提取態(tài)Pb 含量仍處于較高水平 (81.36～92.71 mg/kg)，遠(yuǎn)高于其他形態(tài) (28.10～60.05 mg/kg)；其二，NP 和NPK 處理顯著促進(jìn)了三種向日葵根系生長(zhǎng) (22.2%～72.9%)，從而增加了根系與土壤顆粒表面的接觸面積，促進(jìn)了向日葵對(duì)根際土壤中Pb 的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)[32]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)不同向日葵品種根際可還原態(tài)Pb 含量有很大差異，且受施肥的影響較小，其可能是由于不同向日葵品種在Pb 脅迫下根系分泌物的總量和組成不同，導(dǎo)致了不同品種根際土壤pH、Eh 和有機(jī)酸的差異，從而反過來調(diào)節(jié)Pb 在根際土壤中的化學(xué)過程[41]?？傮w而言，本研究中，氮磷鉀配施處理下，三種向日葵根際弱酸提取態(tài)Pb 含量降低了7.5%～17.0%，而三種向日葵根部生物量則顯著提高了46.6%～72.9%?？芍?，盡管施肥處理，尤其是添加磷肥使土壤中Pb 有從生物可利用態(tài)向穩(wěn)定態(tài)轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)，但由于本研究供試土壤的Pb 污染特性，其土壤Pb 有效性降低并不顯著，而施肥對(duì)向日葵根系和地上部生長(zhǎng)的促進(jìn)作用遠(yuǎn)大于對(duì)土壤Pb 有效性的降低效果，增加了向日葵根系對(duì)土壤中Pb 的吸收面積，從而促進(jìn)土壤中Pb 向植物系統(tǒng)的遷移。

4 結(jié)論

1) 供試三種向日葵品種生物量和Pb 富集能力具有顯著差異，施肥顯著促進(jìn)了向日葵生長(zhǎng)和對(duì)Pb 的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，氮磷鉀肥料配施處理對(duì)三種向日葵地上部Pb 富集量的提高作用最強(qiáng)。雖然歡樂火炮竹和T562 地上部分Cd 含量相對(duì)較高，但LD5009 生物量較大，其地上部Pb 富集量反而最高。

2) 三種向日葵品種體內(nèi)細(xì)胞碎屑和金屬富集顆粒中Pb 的分布差異是導(dǎo)致其土壤Pb 富集能力差異的重要機(jī)制。氮磷鉀配施處理顯著提高了Pb 在供試三種向日葵葉片細(xì)胞碎屑和金屬富集顆粒組分的含量，可能是其促進(jìn)向日葵Pb 吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的重要機(jī)制。

3) 施肥處理對(duì)供試三種向日葵品種根際土壤Pb 形態(tài)有不同的影響，土壤中弱酸提取態(tài)為植物可吸收利用的主要形態(tài)，NP 和NPK 處理雖然降低了向日葵弱酸提取態(tài)Pb 含量，但其對(duì)向日葵根系和地上部生長(zhǎng)的促進(jìn)作用遠(yuǎn)大于對(duì)土壤Pb 有效性的降低效果，因而可促進(jìn)向日葵根系對(duì)土壤中Pb 的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，有效提高了向日葵對(duì)Pb 的修復(fù)效率。