徐傳婕 許文峰 施志鵬 孟賢坤 曲明芹 莊立杰 韓曉翠 周曉燕

摘 ? ?要：以‘山農(nóng)24為試材，100 mg·L-1的硫酸銅模擬銅脅迫環(huán)境，采用營(yíng)養(yǎng)液盆栽法，設(shè)硝酸鑭和亞硒酸鈉兩個(gè)因素浸種，研究了鑭、硒浸種對(duì)冬小麥種子萌發(fā)率及銅鹽脅迫下小麥幼苗干物質(zhì)含量、抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性、可溶性蛋白含量的影響。結(jié)果表明，銅脅迫處理降低了小麥地上干物質(zhì)含量、抗氧化酶活性，提高了可溶性蛋白的含量。其中，50 mg·L-1鑭元素（La3+）、30 mg·L-1硒元素（Se4+）提高冬小麥發(fā)芽率效果最佳;50 mg·L-1 La3+、20 mg·L-1 Se4+水平處理銅脅迫小麥幼苗地上干物質(zhì)含量恢復(fù)最明顯，較原來(lái)水平顯著提高129.12%（P<0.05）;100 mg·L-1 La3+、30 mg·L-1 Se4+水平處理使小麥SOD活性較原來(lái)水平提高126.75%;100 mg·L-1 La3+、10 mg·L-1 Se4+水平處理使小麥POD活性較原有水平顯著提高282.43%（P<0.05）;100 mg·L-1La3+、20 mg·L-1 Se4+水平處理使小麥CAT活性較原有水平顯著提高123.85%（P<0.05）;100 mg·L-1 La3+、10 mg·L-1 Se4+處理使小麥可溶性蛋白較原有水平處理組降低86.09%。綜合而言，鑭、硒共同作用可有效提高冬小麥細(xì)胞清除活性氧的能力，抑制銅離子脅迫對(duì)小麥幼苗的毒害作用。

關(guān)鍵詞：小麥;鑭;硒;萌發(fā);干物質(zhì)含量;抗氧化酶;可溶性蛋白

中圖分類號(hào)：S512.1 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.11.002

Abstract： Using 'Shannong 24' as test material， 100 mg·L-1 copper sulphates simulated copper stress environment， using nutrient liquid potting method， Lan thanum nitrate and sodium selenite were used to soak seed， ?and its effects on germination rate and dry matter content in the dry matter content， antioxidant enzymes （SOD， POD， CAT） activity and soluble protein content of wheat seedlings under copper stress were studied. The results showed that copper stress treatment cut the dry matter content， antioxidant enzyme activity and soluble protein content of wheat， and the wheat was poisoned by H2O2. Among them， 50 mg·L-1 La3+ and 30 mg·L-1 Se4+ improved the germination rate of winter wheat; with 50 mg·L-1 La3+， 20 mg·L-1 Se4+ level treatment of copper-stressed wheat seedlings， the recovery of dry matter content on the ground was the most obvious， and it was significantly increased by 129.12%（P<0.05）. The treatment of 100 mg·L-1 La3+ and 30 mg·L-1 Se4+ increased the SOD activity of wheat by 126.75%. The treatment of 100 mg·L-1 La3+ and 10 mg·L-1 Se4+ significantly increased the POD activity of wheat by 282.43% compared with the original level; 100 mg·L-1 La3+， 20 mg·L-1 Se4+ ?treatment significantly increased the CAT activity of wheat by 123.85% compared with the original level; the treatment of 100 mg·L-1 La3+ and 10 mg·L-1 Se4+ reduced the soluble protein of wheat by 86.09% compared with the original treatment group. In general， the combination of strontium and selenium can effectively remove the ability of winter wheat cells to scavenge reactive oxygen species and inhibit the toxic effects of copper ion stress on wheat seedlings.

Key words： wheat; lanthanum; selenium; germination; dry matter content; antioxidant enzyme; soluble protein

我國(guó)是一個(gè)耕地資源極為短缺的國(guó)家，人均耕地面積小[1]。隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，農(nóng)田重金屬污染的情況十分嚴(yán)重，在生產(chǎn)活動(dòng)中含銅除草劑、殺蟲(chóng)劑的過(guò)度使用以及廢液、廢氣的大量排放，使得農(nóng)田當(dāng)中積累了大量的銅元素，對(duì)農(nóng)業(yè)安全造成了嚴(yán)重影響。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截至2013年我國(guó)受到重金屬污染農(nóng)田的面積約2 000萬(wàn)hm2，約占我國(guó)農(nóng)田總面積的五分之一[2]。土壤中積累過(guò)多的重金屬會(huì)導(dǎo)致農(nóng)作物的產(chǎn)量及品質(zhì)降低，并且可以通過(guò)食物鏈關(guān)系在生物體內(nèi)積累，嚴(yán)重威脅食品安全[3]，農(nóng)田受重金屬污染問(wèn)題已成為不可忽視的環(huán)境問(wèn)題。

大量研究表明，銅是常見(jiàn)的重金屬元素之一，同時(shí)也是作物生長(zhǎng)過(guò)程中必需的微量元素。銅參與作物體內(nèi)多種生理生化代謝過(guò)程，可影響作物的生長(zhǎng)、發(fā)育以及作物品質(zhì)[4]。然而，植物中積累過(guò)量的銅會(huì)抑制其光合作用、干擾細(xì)胞的代謝過(guò)程、打亂植物體中離子的平衡，導(dǎo)致植物生理紊亂，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[5]。

硒是植物體中的一種微量元素，微量的硒對(duì)植物的生長(zhǎng)具有重要作用[6]。大量研究發(fā)現(xiàn)，硒元素在植物體中具有拮抗重金屬的作用[7]。它對(duì)植物體內(nèi)一些生化反應(yīng)（如抗逆境脅迫、抗氧化）及生理過(guò)程（如某些蛋白代謝、呼吸作用、光合過(guò)程）有重大影響[8]。

近年來(lái)，人們對(duì)稀土農(nóng)用做了大量的研究，相關(guān)結(jié)果表明，一定量的稀土元素可促進(jìn)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收、轉(zhuǎn)化和利用[9]，如鑭能夠提高并促進(jìn)水稻和小麥等禾本科植物的分蘗能力，增加其單位產(chǎn)量和結(jié)實(shí)率，從而提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[10];Zhao等[11]的研究表明，一定濃度的硝酸鑭處理可以明顯緩解重金屬對(duì)植物的負(fù)面影響，從而促進(jìn)大豆生長(zhǎng)發(fā)育;陳遠(yuǎn)孟等[12]的研究表明，鑭能夠提高植物干物質(zhì)的積累量;Shi等[13]的研究表明，鑭可以增強(qiáng)植物的耐受性;蘭雅茜[14]的研究表明，鑭可增大植株葉面積、增強(qiáng)抗氧化酶的活性、減少質(zhì)膜上丙二醛（MDA）的積累等。

雖然前人對(duì)硒和鑭在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用有較多的研究，但是絕大多數(shù)研究多集中在用噴灌或施固體肥等方式探究單一的鑭或硒對(duì)作物的影響，鮮有將鑭和硒結(jié)合起來(lái)以浸種的方式探究二者對(duì)小麥影響的研究。因此，本文以鑭、硒浸種的方式探究了鑭和硒對(duì)銅脅迫小麥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，旨在為相關(guān)的理論研究和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小麥品種為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)提供的‘山農(nóng)24;供試試劑為硝酸鑭（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，AR）、亞硒酸鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，CP）和五水硫酸銅（天津光復(fù)化學(xué)試劑廠，AR）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用營(yíng)養(yǎng)液盆栽的方法，基質(zhì)為蛭石，培養(yǎng)器皿為10 cm×10 cm×12 cm的聚乙烯塑料盆，營(yíng)養(yǎng)液為1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液[15]。設(shè)硝酸鑭浸種和亞硒酸鈉浸種2個(gè)因素，其中硝酸鑭浸種處理水平分別為0（L0），50（L50），100 mg·L-1（L100）;亞硒酸鈉處理水平分別為0（S0），10（S10），20（S20），30 mg·L-1（S30）;分別設(shè)為CK*、T1*、T2、T3、T4、T5、T6、T7處理組。上述試劑濃度均以成品計(jì)。試驗(yàn)設(shè)置平行的無(wú)銅脅迫組作為對(duì)照，共計(jì)8個(gè)處理，重復(fù)3次，每次重復(fù)10株。

1.3 試驗(yàn)方法

選取胚完整且飽滿均勻的小麥種子，自來(lái)水沖洗2遍，用0.1% HgCl2溶液浸泡消毒10 min后，將種子取出并用蒸餾水將溶液殘留沖洗干凈，按上述濃度設(shè)計(jì)作浸種處理24 h，然后將種子移入鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，在暗處（25±2） ℃條件下催芽48 h，待種子露白后，選取大小、長(zhǎng)勢(shì)一致的種子移入裝有蛭石的聚乙烯塑料盆，每盆30粒種子置于光照培養(yǎng)箱，在（25±2） ℃、光照強(qiáng)度6 000 Lx條件下培養(yǎng)。待幼苗長(zhǎng)至一葉一心期時(shí)選取長(zhǎng)勢(shì)相近的10株幼苗，用1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，20 d后，采用1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+100 mg·L-1硫酸銅溶液對(duì)T1至T7組的幼苗進(jìn)行脅迫處理，處理72 h后進(jìn)行苗期指標(biāo)測(cè)定。

1.4 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.4.1 形態(tài)指標(biāo) 按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，在浸種處理后的第3天測(cè)定種子的發(fā)芽勢(shì)，浸種處理后第7天測(cè)定種子發(fā)芽率。在進(jìn)行銅脅迫72 h后測(cè)定幼苗株高及根長(zhǎng)。

1.4.2 干物質(zhì)含量 銅脅迫處理72 h后，每個(gè)處理隨機(jī)選取5株幼苗，用蒸餾水清洗后，將幼苗的地上和地下部分分開(kāi)，105 ℃殺青30 min，85 ℃烘干2 h，稱質(zhì)量。

1.4.3 其他生理指標(biāo)的測(cè)定 超氧化物歧化酶（SOD）采用NBT法測(cè)定，過(guò)氧化物酶（POD）采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，過(guò)氧化氫酶（CAT）采用紫外吸收法測(cè)定，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。以上方法均參照楊淑慎等[16]的方法進(jìn)行，稍作改進(jìn)。

酶液提取方法如下：稱取小麥幼苗倒二葉0.2 g，加入2 mL提取液（提取液的配制：稱取0.018 6 g EDTA，5 g聚乙烯吡咯烷酮，用50 mmol·L-1磷酸緩沖液溶解后定容至500 mL），加入少量石英砂后液氮研磨，勻漿倒入EP管，在12 000 g，4 ℃條件下離心20 min，上清液即為酶提取液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用WPS表格對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，使用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Origin 9.5繪圖。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）對(duì)各處理進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，以篩選出最佳處理并采用最小顯著差異法（LSD）法進(jìn)行多重比較（α=0.05）。結(jié)果用平均值（mean）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鑭、硒浸種對(duì)冬小麥種子萌發(fā)的影響

不同處理下小麥種子的發(fā)芽率見(jiàn)表1。從表1可以看出，與CK*組相比，一定濃度的鑭、硒浸種提高了小麥種子的發(fā)芽率。其中表現(xiàn)為，在同一Se4+濃度水平下隨著La3+濃度的增加，小麥種子的發(fā)芽率反而下降，說(shuō)明50 mg·L-1較100 mg·L-1時(shí)促進(jìn)小麥種子萌發(fā)效果更好;通過(guò)對(duì)比同一La3+濃度水平下不同Se4+水平的處理組表明，隨著Se4+濃度的升高，小麥種子的發(fā)芽率逐漸升高，在D5處理組，小麥種子發(fā)芽率達(dá)到最高，達(dá)到96%，較CK*組升高了8個(gè)百分點(diǎn)。

2.2 鑭、硒浸種對(duì)銅脅迫下小麥幼苗生長(zhǎng)的影響

從表2可以看出，除T2、T5、T7處理組與T1*處理組差異不顯著外，其他處理組均較T1*處理組顯著提高了小麥幼苗的干物質(zhì)含量（P<0.05），一定程度了緩解了銅脅迫對(duì)小麥干物質(zhì)含量的抑制作用。說(shuō)明一定程度的鑭、硒處理可以緩解銅離子對(duì)生長(zhǎng)的抑制作用。當(dāng)T4處理組，小麥幼苗地上部分干物質(zhì)含量恢復(fù)最明顯，且較T1*處理組顯著升高129.12%。

2.3 鑭、硒浸種對(duì)銅脅迫小麥幼苗抗氧化酶及可溶性蛋白含量的影響

鑭和硒對(duì)銅脅迫小麥幼苗抗氧化酶及可溶性蛋白含量的影響見(jiàn)圖1。從圖1可知，無(wú)論是增加Se4+或者La3+的含量，小麥幼苗的SOD活性總體呈現(xiàn)出先降低后上升趨勢(shì)，且T7處理組較T1*處理組升高126.75%。說(shuō)明鑭和硒的復(fù)合影響對(duì)小麥中重金屬毒性表現(xiàn)為拮抗作用。

各處理組小麥的POD活性都有不同程度的升高。說(shuō)明La和Se的共同作用可以緩解重金屬銅對(duì)小麥的毒害作用。其中T3處理組較T1*處理組升高282.43%，達(dá)到顯著水平。通過(guò)對(duì)比同一La3+濃度水平下的不同亞硒酸鈉水平的處理組可表明，隨著Se4+濃度的升高，小麥幼苗的POD活性表現(xiàn)為升高。隨著La3+濃度的升高，POD活性表現(xiàn)為整體降低。說(shuō)明硒離子提高了小麥對(duì)鑭的耐受能力。

一定程度的鑭、硒復(fù)合處理可以緩解銅元素對(duì)小麥CAT活性的抑制作用。通過(guò)T7處理組的數(shù)據(jù)可得，鑭、硒復(fù)合處理可稍緩解這一現(xiàn)象，但鑭、硒濃度過(guò)高時(shí)會(huì)加劇對(duì)小麥CAT活性的抑制影響。表現(xiàn)最顯著的是T5處理組，較T1*處理組小麥CAT活性升高123.85%。

從圖1可看出，除Se4+濃度為10 mg·L-1水平下，其他處理組的可溶性蛋白含量相較于CK*都不同程度地升高了。且隨著Se4+濃度的升高，相對(duì)應(yīng)的小麥可溶性蛋白含量也逐漸升高，說(shuō)明硒浸種可以促進(jìn)小麥可溶性蛋白的合成。而在T3處理組時(shí)，較CK*處理組降低86.09%。

3 結(jié)論與討論

銅離子是小麥生長(zhǎng)發(fā)育必需的營(yíng)養(yǎng)微量元素，是小麥中許多重要酶的輔基[18]。然而，過(guò)量銅離子對(duì)小麥的生長(zhǎng)發(fā)育以及生理都有一定的毒害作用，誘導(dǎo)能夠損傷小麥DNA和蛋白質(zhì)等主要生物大分子的自由基[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在鑭、硒浸種的條件下，小麥種子的發(fā)芽率有所提高。其中，D6處理組表現(xiàn)為最高，推測(cè)產(chǎn)生這種結(jié)果的機(jī)制是小麥種子在鑭、硒浸種的作用下，提高了小麥種子胚乳中α-淀粉酶活力。

一定濃度銅離子對(duì)小麥幼苗的生長(zhǎng)（地上干物質(zhì)含量）和生理（抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量）產(chǎn)生負(fù)作用，使小麥幼苗內(nèi)的代謝發(fā)生混亂。小麥的干物質(zhì)含量主要來(lái)源于光合作用有機(jī)物的積累，其地上部分的干物質(zhì)含量有90%以上來(lái)自于光合作用[19]，銅離子干擾小麥體內(nèi)電子傳遞過(guò)程，阻礙其光合作用過(guò)程[20]。在鑭、硒共同作用下，可緩解銅離子對(duì)小麥幼苗產(chǎn)生的負(fù)作用。在La3+的濃度為50 mg·L-1和Se4+的濃度為20 mg·L-1的共同作用下顯著提高了小麥幼苗地上部分的干物質(zhì)含量。盧嬌嬌等[21]研究證明，低濃度的硝酸鑭（La3+濃度<50 mg·L-1）可促進(jìn)小麥葉綠體電子傳遞速率和光合磷酸化水平，高濃度的硝酸鑭（La3+濃度>50 mg·L-1）則相反。低濃度的硝酸鑭促進(jìn)光合電子傳遞速率，進(jìn)而激活具有ATP酶活性的偶聯(lián)因子，光合速率增加，小麥體中有機(jī)物的積累量增加。本試驗(yàn)中，在Se4+濃度為20 mg·L-1水平下，不同La3+濃度處理組結(jié)果表現(xiàn)為“低促高抑”，這也為上述觀點(diǎn)提供了證據(jù)。

在100 mg·L-1的銅脅迫下，小麥幼苗的SOD、POD、CAT活性與CK*處理組相比都有較大幅度下降，同時(shí)可溶性蛋白含量升高。硒是谷胱甘肽過(guò)氧化酶的組成部分，可以利用GSH將對(duì)植物有危害的過(guò)氧化物還原成對(duì)植物無(wú)害的物質(zhì)。鑭可以促進(jìn)催化植物抗氧化酶活性[22]。適當(dāng)濃度的鑭（50～100 mg·L-1）和硒（10～30 mg·L-1）共同作用可以一定程度恢復(fù)銅離子對(duì)小麥幼苗生理（抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量）的毒害作用。其中T7處理組的小麥SOD活性達(dá)到最高，T3處理組的小麥POD較T1*處理顯著提高，T5處理組的小麥CAT活性達(dá)到最高，T3處理組小麥較T1*處理小麥可溶性蛋白含量顯著降低，說(shuō)明適當(dāng)濃度的鑭、硒浸種能夠提高銅脅迫下小麥的抗氧化能力，抑制細(xì)胞中活性氧增加，緩解脂膜過(guò)氧化，從而阻止產(chǎn)生大量可溶性蛋白。王蕊等[23]對(duì)豌豆的研究中也有類似報(bào)道，指出施用適量稀土可緩解重金屬銅的污染。推測(cè)其作用機(jī)理為：銅離子與小麥細(xì)胞膜蛋白及磷脂反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜構(gòu)象發(fā)生改變，小麥體內(nèi)的O2-的產(chǎn)生和清除打破了原有的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，小麥遭到過(guò)量H2O2毒害，鑭和硒的共同作用能夠抑制H2O2和O2-的產(chǎn)生，提高小麥抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性，從而抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，抑制銅離子對(duì)小麥幼苗的毒害作用。

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