談小龍 張黎 張佳 鄭龍龍

摘要?為了解山西某規(guī)模化豬場5月齡豬群副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）的敏感藥物情況，采集病死豬胸腔積液5份，通過細菌染色、形態(tài)觀察、PCR檢測，從胸腔積液樣品中檢測出5株Hps，根據(jù)其藥物敏感特性推測其為同一菌株，將其命名為Hps-SX19。此次試驗獲得的Hps菌株為超級耐藥株，該菌對β-內(nèi)酰胺類、截短側耳素類、林可胺類藥物敏感，對氨基糖苷類、氯霉素類、喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性，給生產(chǎn)上敏感藥物的選擇帶來了巨大的困擾，降低了豬群的整體健康情況，為非洲豬瘟進場提供了便利，可能會帶來巨大損失。

關鍵詞?Hps;K-B法;敏感藥物;超級細菌

中圖分類號?S859文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）22-0085-03

Abstract?In order to understand the sensitive drug situation of Haemophilus parasuis（Hps） in a 5monthold pig herd of a largescale pig farm in Shanxi Province，5 samples of pleural effusion were collected from sick and dead pigs. 5 strains of Hps were detected in pleural effusion samples by using bacterial staining， morphological observation and PCR detection. Based on its drug sensitivity characteristics， it was speculated to be the same strain，named as HpsSx19. Hps strain obtained in this experiment was a super drugresistant strain， which was sensitive to lacta mines， pleurotropin and lincomyla mine， and it was resistant to a minoglycosides， chloramphenicol and quinolones， which brought great troubles to the selection of sensitive drugs in the production， reduced the overall health status of swine herd， facilitated the occurrence of African swine fever， and brought huge losses.

Key words?Hps;KB method; Sensitive drugs;Super bacteria

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）常引起纖維素性肺炎、關節(jié)炎為主要癥狀的一種細菌性傳染病，以高發(fā)病率和高死亡率為特征，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴重損失，因此應對此病引起高度重視。38.9%～77.8%的健康豬攜帶Hps致病菌[1-2]，2～8周齡的青年豬易感，發(fā)病率一般為10%～20%，嚴重時死亡率在50%以上[3-4]。

2019年3月山西省一家規(guī)?；蕡?月齡開始發(fā)病，精神沉郁、食欲廢絕，體溫 41?℃，呼吸困難，呈腹式呼吸。胸腔、心包及腹腔有多量纖維性滲出物，可見絨毛心;全身淋巴結腫大、暗紅色，切面呈大理石花紋樣。筆者對豬高熱病副豬嗜血桿菌的感染進行了初步研究，分離、鑒定了5株副豬嗜血桿菌，并進行了藥敏試驗，旨在為指導豬場合理用藥、控制和治療高熱病繼發(fā)感染該病提供依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?樣品來源。2019年3月無菌采集來自山西省某規(guī)?；B(yǎng)殖場出現(xiàn)急性死亡、纖維素性心包炎豬的胸腔積液及肺臟5份。

1.1.2?試驗材料。巧克力瓊脂、血瓊脂、Hps陽性菌株、金黃色葡萄球菌、麥氏比濁管等，由山西農(nóng)業(yè)大學病理實驗室提供。

1.2?方法

1.2.1?分離培養(yǎng)及培養(yǎng)特性檢查。參考GB/T 34750—2017 《副豬嗜血桿菌檢測方法》，無菌采集肺臟、胸腔積液接種于巧克力瓊脂平板、血瓊脂平板， 37?℃ 5 %～10 % CO2 培養(yǎng) 36 h 后，觀察其在培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)、菌落特征以及在血瓊脂平板上的溶血性等培養(yǎng)特性。

1.2.2?衛(wèi)星現(xiàn)象檢查。將鮮血瓊脂平皿用無菌棉簽均勻涂布此次分離的細菌，在其中一部分劃線接種金黃色葡萄球菌， 37?℃下培養(yǎng)36 h，觀察其是否在葡萄球菌周圍出現(xiàn)“衛(wèi)星現(xiàn)象”。

1.2.3?PCR鑒定。將分離純化的菌株用接種環(huán)挑取菌落接種于含5 mL無菌不含瓊脂的巧克力液體培養(yǎng)基玻璃管中，37 ℃ 5 %～10 %CO2 培養(yǎng) 36 h 后，使用麥氏比濁管調整菌液濃度至1.5×108個/mL，取1 mL菌液10 000 r/min離心5 min，棄去上清液，沸水中水浴10?min，10 000 r/min離心5 min取上清作為PCR模板。根據(jù)副豬嗜血桿菌OmpP5基因（M75065）序列設計引物[5]，由上海生工生物技術公司合成。P1為5′-GTGATGAGGAAGGGTGGGT-3′，P2為5′-GGCI'CGACCCTCTGT-3′;其中10×PCR Buffer 2.5?μL，dNTP Mixture 1?μL，上游和下游引物終濃度為0.2 μmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 μL，模板300 ng（1.5～2.0 μL），加水補足25 μL。PCR條件如下：94 ℃5 min;94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃60 s，30個循環(huán);72 ℃30 s。取8 μL PCR產(chǎn)物與適量上樣緩沖液混合后，在120 V電壓條件下用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳30 min后，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結果。

1.2.4?動物致病性試驗。將分離菌株接種到營養(yǎng)肉湯中37 ℃恒溫培養(yǎng)36 h，取1.0 mL接種于2月齡小鼠腹腔中，設置空白對照組。接種后連續(xù)7 d，每天3次觀察小鼠狀況。

1.2.5?藥敏試驗。將分離菌株接種到營養(yǎng)肉湯中37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，使用麥氏比濁管調整菌液濃度至1.5×108個/mL。按照常規(guī)細菌接種方法取100 μL菌液均勻涂抹在巧克力瓊脂培養(yǎng)基上，并貼上標準藥敏紙片（直徑6 mm），在4 ℃條件下放置30 min。然后，再移入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，觀察并測量抑菌圈直徑，最后根據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）標準判定結果。

2?結果與分析

2.1?分離菌株的培養(yǎng)特性?分離菌株在巧克力培養(yǎng)基上培養(yǎng)36 h后生長良好，形成針尖大小菌落，釣取菌落進行染色并鏡檢，發(fā)現(xiàn)分離菌株符合副豬嗜血桿菌的形態(tài)和染色特征。在普通肉湯和營養(yǎng)瓊脂，37 ℃培養(yǎng)36 h后未見細菌生長。在血平板上培養(yǎng) 36 h后，可見有針尖大小、圓形、邊緣整齊、灰白色半透明的小菌落生長，不表現(xiàn)溶血現(xiàn)象。

2.2?致病性試驗結果?小鼠接種菌液16～36 h 內(nèi)全部死亡，對照組無異常，取其胸腔積液接種于巧克力瓊脂培養(yǎng)基上，分離到同樣的細菌。

2.3?PCR鑒定結果?豬場分離到的致病性Hps基因進行

PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳獲得大小約380 bp的特異性目的條帶（圖1），與預期結果相符。

2.4?藥敏試驗結果?此次獲得的Hps-SX19菌株為超級耐藥株。藥敏試驗結果表明，該分離菌株對β-內(nèi)酰胺類第三代頭孢類藥物頭孢曲松和頭孢噻肟、截短側耳素類（泰妙菌素）、林可胺類（大觀霉素）藥物敏感，對β-內(nèi)酰胺類氨芐西林和阿莫西林、氨基糖苷類（新霉素）、四環(huán)素類（土霉素、強力霉素）、氯霉素類（氟苯尼考）、喹諾酮類（恩諾沙星、環(huán)丙沙星）藥物產(chǎn)生耐藥性（表1）。

3?結論與討論

我國養(yǎng)豬環(huán)境差，疾病防控壓力大，因此常選用抗生素廣泛應用于獸醫(yī)臨床保健，已經(jīng)是治療豬疾和保障生產(chǎn)的重要工具;由于抗生素的頻繁使用，導致大量細菌耐藥菌株的持續(xù)出現(xiàn)，給養(yǎng)豬生產(chǎn)帶來了巨大危害，但目前尚未發(fā)現(xiàn)完全耐藥的超級細菌[6-10]，處于可控范圍內(nèi)，因此持續(xù)跟蹤當前敏感藥物及回顧性研究耐藥性，對于提高生產(chǎn)成績、食品安全具有十分重要的意義。

Hps是豬上呼吸道的常見菌，該病的治療效果較差，預防才是上策，該病通常是作為繼發(fā)或并發(fā)感染發(fā)生的，常伴有支原體、附紅細胞體的混合感染。通常情況下，疫苗是疾病預防的首選，但對該菌作用甚微，有很多分離株不能被分型，目前已經(jīng)投入使用的疫苗對豬群免疫后雖然能夠提高豬群對副豬嗜血桿菌的抵抗力，大大降低了豬群暴發(fā)或繼發(fā)副豬嗜血桿菌的概率[11-14];但隨著非洲豬瘟的肆虐，疾病更加復雜化，豬群抵抗力可能因為過度消毒而降低，造成Hps防控壓力更大，因此需要多種方案共同作用。

該研究對分離到的Hps-SX19株進行了7類12種抗生素的藥物敏感性分析，結果表明致病性Hps-SX19株對β-內(nèi)酰胺類第三代頭孢類藥物、截短側耳素類泰妙菌素、林可胺類大觀霉素）藥物敏感，對β-內(nèi)酰胺類氨芐西林、阿莫西林、氨基糖苷類新霉素、四環(huán)素類土霉素、強力霉素、氯霉素類氟苯尼考、喹諾酮類恩諾沙星、環(huán)丙沙星產(chǎn)生耐藥性，呈現(xiàn)出多重耐藥性。

該研究從藥物敏感性的角度對Hps進行了初步研究，通過分離和鑒定發(fā)病豬場致病菌，并對分離株Hps-SX19進行敏感藥物性篩選，為進一步跟蹤山西規(guī)?；i場發(fā)生Hps的復雜病因和臨床用藥提供一定的科學參考。

參考文獻

[1] OLVERA A，PINA S，MACEDO N，et al.Identification of potentially virulent strains of Haemophilus parasuis using a multiplex PCR for virulenceassociated autotransporters （vtaA）[J].The veterinary journal，2012，191（2）：213-218.

[2] 高豐，羅毅，成軍，等.豬副嗜血桿菌感染的診斷與防治[J].動物醫(yī)學進展，2002，23（6）：101-103.

[3] 劉正飛，蔡旭旺，陳煥春，等.副豬嗜血桿菌研究進展[J].動物醫(yī)學進展，2003，24（5）：17-19.

[4] 白艷艷，張斌，劉健鵬，等.榆林市一起副豬嗜血桿菌病的診治[J].動物醫(yī)學進展，2018，39（10）：130-133.

[5] 王超，陳欣，張夢南，等.副豬嗜血桿菌的分離鑒定及其OmpP5基因序列分析[J].動物醫(yī)學進展，2018，39（1）：16-21.

[6] 李曦婷，董俏，李化生，等.副豬嗜血桿菌檢測技術及耐藥性研究進展[J].動物醫(yī)學進展，2016，37（10）：85-89.

[7] 王建，邵衛(wèi)星，呂占軍，等.2012年我國部分省市規(guī)?；i場副豬嗜血桿菌分離鑒定及菌株血清分型[J].動物醫(yī)學進展，2014，35（3）：48-52.

[8] ZHAO Y D，WANG Q，LI J，et al.Epidemiology of Haemophilus parasuis isolates from pigs in China using serotyping， antimicrobial susceptibility，biofilm formation and ERICPCR genotyping[J].PeerJ，2018，6：5040-5043.

[9] ZHANG L，LI Y，WANG Y，et al.Integration of pharmacokineticpharmacodynamic for dose optimization of doxycycline against Haemophilus parasuis in pigs[J].Journal of veterinary pharmacology and therapeutics，2018，41（5）：706-718.

[10] ZHAO Y D，GUO L L，LI J，et al.Characterization of antimicrobial resistance genes in Haemophilus parasuis isolated from pigs in China[J].PeerJ，2018，6：4613-4630.

[11] JIA A Q，ZHOU R Y，F(xiàn)AN H Y，et al.Development of serotypespecific PCR assays for typing of Haemophilus parasuis isolates circulating in southern China[J].J Antimicrob Chemother，2017，55（11）：3249-3257.

[12] WU X L，XIAO L，WANG Y，et al.Genetic variants and phylogenetic analysis of Haemophilus parasuis （HPS） OMPP2 detected in Sichuan， China from 2013 to 2015[J].J Vet Med Sci，2017，79（10）： 1648-1651.

[13] WANG Z H，ZHAO Q，WEI H L，et al.Prevalence and seroepidemiology of Haemophilus parasuis in Sichuan province， China[J].PeerJ，2017，5：3379-3384.

[14] LI Y F，KWOK A H，JIANG J W，et al.Complete genome analysis of a Haemophilus parasuis serovar 12 strain from China[J].PLoS One，2013，8（9）：683-685.