唐慶權(quán) 徐婷婷 陶敏慧 毛穎睿 張子涵 魯子怡 樊慧敏 許曉牧 彭開松 王黎明 鮑傳和 薛貴勝 朱若林 李明

摘要?為探明大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus）潰爛病的病原，并篩選有效的外用和內(nèi)服藥物，進(jìn)行了細(xì)菌分離鑒定、毒力基因檢測、人工感染、藥物篩選和治療試驗(yàn)。結(jié)果表明，分離菌N-1株為中間氣單胞菌，N-2株和N-3株為凡隆氣單胞菌，且攜帶氣溶素aerA、細(xì)胞毒性腸毒素Act、鞭毛Fla、酯酶Lip等毒力基因。N-1、N-2、N-3對應(yīng)的半數(shù)致死濃度分別為105.21、105.88、105.53 CFU/尾，外用和內(nèi)服藥分別優(yōu)先選擇優(yōu)力克和氟苯尼考。中間氣單胞菌和凡隆氣單胞菌可引起大鱗副泥鰍皮膚潰爛病，優(yōu)力克外潑和氟苯尼考內(nèi)服可治療該病。

關(guān)鍵詞?大鱗副泥鰍;皮膚潰爛;氣單胞菌;氟苯尼考

中圖分類號?S947文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）22-0088-03

Abstract?To identify the pathogen of Paramisgurnus dabryanus canker and screen effective drugs for external and internal use，bacterial isolation and identification，virulence gene detection，artificial infection，drug screening and treatment experiment were carried out.The results showed that N1 isolate was Aeromonas media，N2 and N3 were Aeromonas veronii，which carried virulence genes such as aerosol aerA，cytotoxic enterotoxin Act，flagellum Fla and esterase Lip.Half lethal concentrations of N1，N2 and N3 were 105.21，105.88 and 105.53 CFU/tail，respectively.The external and internal medicines were preferred to YouLike and florfenicol，respectively.Aeromonas rmedia and Aeromonas veronii could cause skin ulceration of P.dabryanus，which could be treated by external spraying of YouLike and oral administration of florfenicol.

Key words?Paramisgurnus dabryanus;Skin ulceration;Aeromonas spp.;Florfenicol

大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus）又稱臺灣泥鰍，隸屬鯉形目鰍科。隨著大鱗副泥鰍養(yǎng)殖密度的不斷增加，水產(chǎn)病害問題日益嚴(yán)重，且以溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）[1]、創(chuàng)傷弧菌（vibrio vulnificus）[2]、泥鰍氣單胞菌（Aeromonas misgurnus）[3]、凡隆氣單胞菌（Aeromonas veronii）[4]等細(xì)菌感染最為嚴(yán)重。然而，迄今為止尚未見中間氣單胞菌感染大鱗副泥鰍的報道。

氣單胞菌屬（Aeromonas）成員廣泛分布于淡水、污水、淤泥、土壤等自然環(huán)境，也是重要的人類條件致病菌，能夠引起腸道、血液、皮膚和軟組織的感染[5]。2017年4月安徽省定遠(yuǎn)縣的某工廠化養(yǎng)殖場的大鱗副泥鰍繁殖親本發(fā)生大面積皮膚潰瘍。筆者對該病例的病因分離和治療進(jìn)行了報道，以期為類似疾病防控提供參考。

1?材料與方法

1.1?臨床診斷分析?對發(fā)病前后的水質(zhì)、寄生蟲和飼養(yǎng)管理進(jìn)行分析。

1.2?細(xì)菌分離純化及鑒定

無菌取患病大鱗副泥鰍（全長10～15 cm）肝胰臟、脾臟截面涂布于營養(yǎng)瓊脂，28 ℃下培養(yǎng)16 h，觀察菌落形態(tài);參照杭州微生物試劑有限公司的操作手冊進(jìn)行革蘭氏染色、氧化酶試驗(yàn)、細(xì)菌生理生化鑒定。參照朱若林等[6]的方法進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增、系統(tǒng)進(jìn)化分析和毒力基因檢測。

1.3?攻毒試驗(yàn)?健康大鱗副泥鰍，體長（8.5±1.1） cm，體重（5.1±0.2） g，飼養(yǎng)在曝氣自來水中，水溫28～31 ℃。每株菌的攻毒試驗(yàn)設(shè)6個劑量組：0（空白對照）、105、106、107、108和109 CFU/mL，每組20尾泥鰍。試驗(yàn)期間，按攝食狀況少量投餌，不排污。觀察14 d，取瀕死或剛死泥鰍，重新進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

根據(jù)上面測定的半數(shù)致死濃度，進(jìn)行混合攻毒試驗(yàn)，每組20尾大鱗副泥鰍，攻毒菌液濃度107 CFU/mL，單株菌注射時，劑量為0.1 mL/（尾·株）;2株菌混合感染時，每株菌注射0.05 mL/（尾·株）;3株菌混合時，每株注射0.033 mL/（尾·株）。

1.4?外用和內(nèi)服藥物篩選

參考商業(yè)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（SN/T 3229—2012）[7]，采用稀釋-中和法篩選外用消毒劑。參考?xì)W盟標(biāo)準(zhǔn)[8]，采用紙片法和微量肉湯稀釋法進(jìn)行內(nèi)服抗菌藥物（購自中國獸藥監(jiān)察所）的藥敏試驗(yàn)。

2?結(jié)果與分析

2.1?臨床診斷分析

發(fā)病池水溫在25～28 ℃，水質(zhì)指標(biāo)良好?；疾〈篦[副泥鰍體表黏液增多，體表的中部、尾部出現(xiàn)圓形潰爛。解剖發(fā)現(xiàn)脾臟暗紅，肝胰臟發(fā)黃，蒼白。水浸片鏡檢未見寄生蟲。

2.2?細(xì)菌形態(tài)學(xué)生理生化鑒定

從3尾患鰍肝胰臟分別分離純化得到3株優(yōu)勢菌，命名為N-1株、N-2株、N-3株。營養(yǎng)瓊脂平板上28 ℃培養(yǎng)16 h后，菌落呈乳白色，表面光滑，圓形凸起，邊緣整齊;3株菌均為革蘭氏陰性菌，且6% NaCl胨水和1 %NaCl枸櫞酸鹽試驗(yàn)均顯示陰性，而氧化酶、精氨酸、葡萄糖產(chǎn)氣、蔗糖、甘露醇試驗(yàn)均顯示陽性。此外，N-1株賴氨酸試驗(yàn)呈陰性，而N-2株、N-3株賴氨酸試驗(yàn)呈陽性。經(jīng)生化編碼鑒定，可判定3株細(xì)菌均為氣單胞菌屬成員。

N-1株、N-2株和N-3株的16S rRNA基因測序BLAST比對顯示，其分別與中間氣單胞菌、凡隆氣單胞菌的相似性最高，均為99 %，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。，綜上可確定N-1株為中間氣單胞菌，N-2株和N-3株為凡隆氣單胞菌。

使用 Mega 4軟件進(jìn)行多序列匹配分析后，采用鄰位相連法（Neighborjoining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，所構(gòu)建發(fā)育樹各分支的置信度由 Bootstrap 進(jìn)行 1 000 次循環(huán)檢驗(yàn)。

從中間氣單胞菌N-1株中檢出的毒力基因有氣溶素aerA、細(xì)胞毒性腸毒素Act、熱不穩(wěn)定性腸毒素Alt、鞭毛Fla、彈性蛋白酶ahyB、酯酶Lip（圖2）等6種毒力基因;從凡隆氣單胞菌N-2、N-3株中檢測出的毒力基因有氣溶素aerA、細(xì)胞毒性腸毒素Act、鞭毛Fla、酯酶Lip（圖2）等4種毒力基因。

2.3?攻毒試驗(yàn)

大鱗副泥鰍在攻毒后3～7 d相繼發(fā)病，采用簡化寇氏法計算LD50發(fā)現(xiàn)，中間氣單胞菌N-1株、凡隆氣單胞菌N-2株、凡隆氣單胞菌N-3株對應(yīng)的半數(shù)致死量（LD50）分別為105.21、105.88、105.53 CFU/尾。死亡的大鱗副泥鰍主要表現(xiàn)為皮膚點(diǎn)狀出血和鰭條出血，未見皮膚潰瘍。人工感染后發(fā)病泥鰍肝胰臟分離菌為攻毒所用菌株?；旌细腥舅劳雎室姳?。

2.4?有效藥物篩選和治療結(jié)果

對市場上效果比較認(rèn)可的3種含碘制劑（優(yōu)力克、迪碘和蛋氨酸碘）進(jìn)行了非清潔條件和清潔條件下的最小抑菌濃度試驗(yàn)。3種碘制劑在清潔條件下的MIC大于500 μL/mL，但綜合比較3種碘制劑的效價比，以優(yōu)力克（嘉興綠望生物科技有限公司）最高，且考慮優(yōu)力克能促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，后續(xù)治療中選擇優(yōu)力克的池效果也最好。綜合紙片法測定敏感性定性結(jié)果（表2）和肉湯法測定的MIC定量結(jié)果（表3）可知，可使用的國標(biāo)漁藥中最優(yōu)選擇為氟苯尼考。

由于筆者介入此案例治療時，死亡已經(jīng)發(fā)生7 d，且部分（40%～70%）泥鰍的潰瘍面積已經(jīng)超過了體表面積的10%以上，且已經(jīng)爛到肌肉。外用優(yōu)力克（0.5 g/m3）3次，每隔1 d 1次;內(nèi)服氟苯尼考（25 mg/kg體重）和多維適量，連續(xù)7 d。7 d后死亡終止，創(chuàng)傷面積小于10%且僅真皮層沒有完全爛透的泥鰍也逐步恢復(fù)。但是，該病例介入治療已經(jīng)比較晚，導(dǎo)致部分池的死亡率高達(dá)90%。

3?討論

在泥鰍養(yǎng)殖過程中，皮膚相關(guān)疾病多發(fā)，一般最開始表現(xiàn)為多發(fā)性點(diǎn)狀出血病、如不及時治療會進(jìn)一步發(fā)展為赤皮、腐皮、潰爛、爛鰭等。引起這些癥狀的細(xì)菌以氣單胞菌科成員最為常見[3，9-10]。當(dāng)環(huán)境不良、體表損傷、應(yīng)激等均可誘發(fā)氣單胞菌感染[11]，該案例中的大鱗副泥鰍有不同程度的體表擦傷，是中間氣單胞菌和凡隆氣單胞菌繼發(fā)感染的誘因?；疾〈篦[副泥鰍是由中間氣單胞菌（N-1）和凡隆氣單胞菌（N-2、N-3）混合感染引起，其引起的死亡率要比單一菌株感染高。目前，有關(guān)大鱗副泥鰍凡隆氣單胞菌感染的報道已有2例，分別發(fā)生在撫州市[12]、遼寧省[13]，報道中患病大鱗副泥鰍癥狀以出血潰瘍?yōu)橹?，與該研究中情況相似。有關(guān)大鱗副泥鰍中間氣單胞菌感染的報道尚未發(fā)現(xiàn)，但關(guān)于中間氣單胞菌感染水產(chǎn)動物的研究報道已有2例，分別發(fā)生在成都[14]和湖南常德[15]，報道中患病魚癥狀均以出血為主。

氣單胞菌屬細(xì)菌可單獨(dú)或與其他病原菌混合感染[3]。其致病性與多種胞外水解酶（如脂肪酶和蛋白酶）和非酶類毒力因子（細(xì)胞毒性腸毒素、氣溶素等）有關(guān)，這毒力因子有助于細(xì)菌入侵和感染的建立[16-17]。

氣單胞菌的耐藥性日益嚴(yán)重，因此處理臨床病例時，需進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，才能科學(xué)用藥[18]。該案例的中間氣單胞菌和凡隆氣單胞菌對藥物的敏感性結(jié)果與上述報道菌株的藥敏結(jié)果差異明顯。綜合評價內(nèi)服以國標(biāo)漁藥氟苯尼考最優(yōu)，外用以新型創(chuàng)傷愈合促進(jìn)消毒劑優(yōu)力克最好。

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