陳頁(yè) 張小軍 曾軍杰 嚴(yán)忠雍 宗靖靖

摘要?以有毒的河豚魚(yú)肝臟和無(wú)毒蝦肉飼喂半褶織紋螺，定期取樣，通過(guò)免疫親和柱凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析織紋螺體內(nèi)河豚毒素含量的變化。結(jié)果表明，半褶織紋螺對(duì)河豚毒素的耐受力高，投喂有毒河豚魚(yú)肝臟后，其體內(nèi)毒素含量迅速增加。當(dāng)投喂無(wú)毒蝦肉后，其體內(nèi)的河豚毒素初期會(huì)呈現(xiàn)減少趨勢(shì)，此后又快速增加。處理組和對(duì)照組幾乎在同一時(shí)間段內(nèi)出現(xiàn)毒素升高。因此，推斷半褶織紋螺能自身產(chǎn)生河豚毒素，也能從食物鏈獲得河豚毒素。

關(guān)鍵詞?織紋螺;河豚毒素;富集;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）

中圖分類(lèi)號(hào)?S917.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2019）22-0097-03

Abstract?The common snails of Nassarius semiplicatus were fed with toxic pufferfish liver and nontoxic shrimp meat in laboratory environment.The samples were taken regularly to analyze the changes of TTX content by UPLCMS/MS based on immunoaffinity column （IAC） purification.The results showed that Nassarius semiplicatus had high tolerance to toxin.After feeding toxic puffer fish liver，the toxin content in the body increased rapidly.When the nontoxic shrimp meat was fed，the accumulated TTX tended to decrease initially，but then the toxin content increased rapidly.In the same time period，there was an increase of toxin in the treatment group and the control group.Therefore it could be hypothesized that TTX in Nassarius semiplicatus might be produced by themselves.At the same time，Nassarius semiplicatus could enrich TTX through the food chain.

Key words?Nassarius spp.;Tetrodotoxin;Enrichment;UPLCMS/MS

織紋螺（Nassarius spp.）是一類(lèi)海洋腹足類(lèi)動(dòng)物，是沿海地區(qū)常見(jiàn)的螺種，大多生活在潮間帶灘涂上，腐食性，在我國(guó)從南到北都有分布，主要在浙江、江蘇、廣東、福建一帶，其中最常見(jiàn)的是半褶織紋螺（Nassarius semiplicatus）。調(diào)查顯示，我國(guó)東南沿?？椉y螺按帶毒情況大致分為無(wú)毒織紋螺、有毒織紋螺和季節(jié)性有毒織紋螺[1]3類(lèi)，如圖1所示。

我國(guó)沿海部分地區(qū)居民因食用織紋螺中毒事件時(shí)有發(fā)生，甚至出現(xiàn)人員死亡[2]。由于織紋螺食物中毒死亡率高，規(guī)模大，范圍廣，2012年國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)《關(guān)于預(yù)防織紋螺食物中毒的公告》已明令禁止銷(xiāo)售、經(jīng)營(yíng)和食用織紋螺。目前已有大量研究表明織紋螺的主要致毒成分為河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）及其衍生物[3-6]。

關(guān)于織紋螺體內(nèi)河豚毒素來(lái)源一直存在爭(zhēng)議，主要分為外源性和內(nèi)源性，其中外源性分為食物鏈來(lái)源與微生物起源。織紋螺是腐食性動(dòng)物，可能攝食了環(huán)境中有毒動(dòng)物尸體或有毒藻類(lèi)，導(dǎo)致毒素在體內(nèi)蓄積。此外，也有研究表明織紋螺體內(nèi)及其生活環(huán)境中均能分離培養(yǎng)出產(chǎn)生河豚毒素的細(xì)菌，但這些細(xì)菌的毒素含量很低，可能與毒素的產(chǎn)生或累積關(guān)系不大[7]，或是并非所有細(xì)菌都能在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng);內(nèi)源性來(lái)源可能是織紋螺像有些特定物種一樣能夠自身產(chǎn)生河豚毒素[8-9]。研究表明，攜帶河豚毒素的動(dòng)物本身對(duì)其毒性有較強(qiáng)的耐受性[10-11]，這些動(dòng)物食用有毒物質(zhì)后，不會(huì)出現(xiàn)中毒癥狀，反而會(huì)將吸收的毒素轉(zhuǎn)變?yōu)轶w內(nèi)的一部分蓄積起來(lái)，停止攝入有毒物質(zhì)后則毒性減少[12]。目前，在攜帶TTX的多種生物中，進(jìn)行了廣泛的餌料飼喂研究，為T(mén)TX的食物來(lái)源提供了依據(jù)[13-15]。盡管TTX的最終來(lái)源仍不確定，但這些物種從食物中獲取TTX以及用它來(lái)增加自身的適應(yīng)性是確定的。筆者開(kāi)展高毒性半褶織紋螺的室內(nèi)飼養(yǎng)試驗(yàn)，以投喂有毒餌料的方式，考察毒素在織紋螺體內(nèi)富集和消除的情況，進(jìn)而探討半褶織紋螺體內(nèi)毒素的可能來(lái)源。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

半褶織紋螺采集自浙江溫嶺，另購(gòu)買(mǎi)暗紋東方鲀的肝臟，冷凍保存，作為投喂織紋螺的有毒餌料;使用蝦肉作為無(wú)毒餌料。采用免疫親和柱凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[16]測(cè)得暗紋東方鲀的肝臟毒素含量約125 mg/kg，而蝦肉中未檢出毒素。

1.2?主要儀器與試劑

1.2.1?主要儀器。ACQUITYTM型超高效液相色譜儀、Waters Xevo TQS四極桿質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源）;Centrifuge 5810高速離心機(jī);VisiprepTMDL固相萃取裝置;MS2漩渦混合器; N-EVAP112氮吹儀;超聲波清洗器;河豚毒素（TTX）免疫親和柱。

1.2.2?試劑。

河豚毒素（TTX）標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.0%）;乙酸、NaCl、Na2HPO4·12H2O、NaOH、NaH2PO4·2H2O、甲酸、乙酸銨、甲醇、乙腈;試驗(yàn)用水均為超純水。

1.3?試驗(yàn)設(shè)計(jì)

織紋螺清理干凈后，飼養(yǎng)在容積120 L的水箱內(nèi)，試驗(yàn)用水為沉淀、過(guò)濾后的海水，鹽度為（24±2）‰，連續(xù)充氧，每2 d更換1次海水，室溫控制在（24±1） ℃，靜水條件凈化馴養(yǎng)7 d，期間不投食;7 d后每隔2 d投喂1次蝦肉，后續(xù)選擇狀態(tài)良好、大小均一的個(gè)體進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)期間織紋螺活動(dòng)正常，健康無(wú)病，自然死亡率小于5%。

室內(nèi)模擬試驗(yàn)設(shè)置處理組和對(duì)照組，每組又分為3個(gè)小組。處理組試驗(yàn)分為暴露階段和凈化階段2個(gè)階段。暴露階段持續(xù)20 d，每天對(duì)織紋螺投喂有毒河豚魚(yú)肝臟。凈化階段持續(xù)50 d，每天投喂無(wú)毒蝦肉。整個(gè)試驗(yàn)期間，對(duì)照組的織紋螺始終投喂無(wú)毒蝦肉。攝食2 h后換水。定期分別從處理組和對(duì)照組中各取樣約40個(gè)，于-20?℃下保存，備用。取樣時(shí)間點(diǎn)設(shè)置為0、1、3、6、10、16、20、21、23、25、28、30、40、50、60和70 d。

1.4?溶液配制

①TTX 標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00 mg TTX 標(biāo)準(zhǔn)品，用含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈（1∶1，V/V）溶液溶解并定容至50 mL，避光4 ℃冷藏保存，保存期限為6個(gè)月;使用時(shí)將濃度稀釋至1.0 μg/mL。②磷酸鹽緩沖液（PBS）。分別稱(chēng)取NaCl 4.25 g，NaH2PO4·2H2O 1.09 g，Na2HPO4·12H2O 6.45 g，用超純水溶解并稀釋至500 mL。

1.5?樣品提取與凈化

1.5.1?樣品提取。

清洗并解剖織紋螺，將得到的所有軟體組織勻漿。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5～1.0 g已充分均質(zhì)的樣品置于50 mL離心管中，加入10 mL含有1%乙酸的甲醇溶液，渦旋振蕩3 min，60?℃水浴超聲提取15 min，冷卻至室溫后，6 000 r/min離心5 min。移取上清液1～2 mL，置于另一個(gè)10 mL離心管中，加入4倍體積的PBS 溶液稀釋?zhuān)? mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為6.9～7.5，待過(guò)柱凈化。

1.5.2?免疫親和柱凈化。

免疫親和柱待溫度回至室溫，放出柱內(nèi)保存液，取樣品液過(guò)柱。過(guò)柱結(jié)束后用8 mL 20%甲醇水進(jìn)行淋洗，淋洗完畢后擠干柱內(nèi)殘留液，并棄去以上全部流出液，最后用4 mL含2%乙酸的甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，60 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，? mL含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈（1∶9，V/V）溶解并定容，經(jīng)0.22 μm濾膜后供分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?TTX的UPLC-MS/MS分析方法?所用分析方法參照2015年實(shí)驗(yàn)室已完善的海洋生物中TTX的測(cè)定方法[16]。將濃度1.0 μg/mL的TTX標(biāo)準(zhǔn)使用液逐級(jí)稀釋成濃度分別為2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其線(xiàn)性回歸方程為y=4 037.18x+31 207.5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 534，TTX在2.0～100 ng/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性良好（圖2）。半褶織紋螺體內(nèi)TTX為主要毒素成分，色譜圖如圖3所示。由于缺少TTX同系物標(biāo)準(zhǔn)品，所以暫不討論其他同系物。

2.2?半褶織紋螺體內(nèi)毒素含量的變化?在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，織紋螺攝食活躍，未觀察到異常情況。使用Sigmaplot軟件對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖，如圖4所示。在暴露階段，投喂高毒性的河豚魚(yú)肝臟后，半褶織紋螺中的毒素含量迅速增加， 第20天升至最高（74.577 mg/kg）。當(dāng)投喂無(wú)毒蝦肉后，毒素含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，第25天短暫上升，此后繼續(xù)降低。第40天開(kāi)始毒素含量又迅速上升，第60天含量上升至僅次于投毒階段結(jié)束時(shí)的含量。60 d后毒素含量降低但仍維持在較高水平。

在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組半褶織紋螺投喂無(wú)毒蝦肉，剛開(kāi)始其毒素含量呈逐漸下降的趨勢(shì)，第16天毒素含量降至最低水平（0.14 mg/kg）。但此后至第25天毒素含量呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，第25天毒素含量達(dá)到1.14 mg/kg，接近第0天水平，此后又呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。第50～60天，毒素含量又迅速上升，第60天毒素含量大約是第0天時(shí)的4倍。試驗(yàn)后期又降至較低水平。由此可見(jiàn)，處理組和對(duì)照組幾乎在同一時(shí)間段內(nèi)出現(xiàn)了毒素升高的情況。

3?討論

河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）是一種小分子量非蛋白神經(jīng)毒素，劇毒，存在于織紋螺科的多種生物中。該研究發(fā)現(xiàn)，投喂高毒性餌料時(shí)處理組織紋螺并沒(méi)有中毒死亡，在行為上與對(duì)照組沒(méi)有任何區(qū)別，表明攜帶河豚毒素的生物對(duì)河豚毒素有較高的耐受性。在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境受控條件下，半褶織紋螺能夠通過(guò)食物鏈快速累積一定量的河豚毒素。當(dāng)改投無(wú)毒餌料時(shí)，體內(nèi)累積的河豚毒素剛開(kāi)始會(huì)呈現(xiàn)減少趨勢(shì)，但隨后幾乎在相同的時(shí)間段內(nèi)，處理組和對(duì)照組都出現(xiàn)了一個(gè)明顯的毒性高峰，因此很可能半褶織紋螺毒素由其自身產(chǎn)生。

張農(nóng)等[2]研究表明，織紋螺的毒性與其種類(lèi)、生長(zhǎng)季節(jié)、生活區(qū)域都有關(guān)系。通過(guò)監(jiān)測(cè)不同地區(qū)織紋螺毒性季節(jié)性消長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)每年4—9月是毒力較高的時(shí)期，與已報(bào)道的食物中毒的變化規(guī)律[2，17-18]相一致。半褶織紋螺雖然大多數(shù)情況下無(wú)毒，但因季節(jié)和棲息地不同有時(shí)會(huì)有毒[1]。此次樣品均采自浙江溫嶺塢根鎮(zhèn)伏嶼山外海涂，排除了種內(nèi)地域性差異。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在相同的生態(tài)環(huán)境下，半褶織紋螺相比于其他螺類(lèi)毒性更高，認(rèn)為可能與其有較高的富集毒素能力有關(guān)[19]。此外在其他一些攜帶TTX的動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，海星（Astropecten scoparius）毒性的季節(jié)變化規(guī)律與性成熟時(shí)期相關(guān)，9—11月為性成熟季節(jié)，毒性較高[20];河豚魚(yú)（T.niphobles）和（T.alboplumbeus）毒性的季節(jié)變化與他們的產(chǎn)卵季節(jié)有一定的相關(guān)性[21]。綜上所述，半褶織紋螺體內(nèi)高含量的河豚毒素可能通過(guò)食物鏈累積得到，同時(shí)在某些條件下其自身也會(huì)產(chǎn)生河豚毒素，并且體內(nèi)毒素的產(chǎn)生或累積遵循一定的生物節(jié)律，有可能與繁殖、產(chǎn)卵相關(guān)。

該研究表明織紋螺能夠通過(guò)食物鏈富集河豚毒素，但缺少對(duì)野外采樣環(huán)境中可識(shí)別的河豚毒素來(lái)源的調(diào)查，因此對(duì)織紋螺體內(nèi)河豚毒素食物鏈來(lái)源缺少有利的證據(jù)。后續(xù)將開(kāi)展進(jìn)一步的研究，選擇代表性地區(qū)進(jìn)行長(zhǎng)期采樣和毒性監(jiān)測(cè)，同時(shí)對(duì)采樣環(huán)境中其他生物等各種因子進(jìn)行密切觀測(cè)和調(diào)查，更全面闡明織紋螺體內(nèi)毒素來(lái)源的問(wèn)題。

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