張偉 徐晨 屠鈺 李款 陳仲達(dá) 劉澤玉 李龍 武國華

摘要?以家蠶為模式生物，研究了2種不同粒徑的銀納米顆粒[Ag NPs，直徑分別為（23.2±2.8）nm和（47.6±5.2） nm，分別記為Ag NPs-23.2 nm及Ag NPs-47.6 nm]在家蠶體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、分布和代謝。在家蠶5齡的第3天，將不同濃度的Ag NPs（60 μg/頭、120 μg/頭、180 μg/頭）通過腹足注射的方式導(dǎo)入家蠶體內(nèi)，分別于注射后24、48、72 h解剖家蠶，獲得家蠶血液、絲腺和中腸，同時(shí)收集蠶砂，結(jié)繭后收集蠶絲，然后用微波消解結(jié)合電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）測定各組織及蠶砂、蠶絲中Ag的濃度。結(jié)果表明，不同組織中Ag的濃度隨時(shí)間的變化趨勢差異較大。120 μg/頭Ag NPs注射24 h后，血液中Ag的濃度分別為（23.87±3.00）μg/mL（Ag NPs-23.2 nm）、6.54±0.33 μg/mL（Ag NPs-47.6 nm），中腸對(duì)應(yīng)的Ag濃度分別為（200.34±12.11）μg/g（Ag NPs-23.2 nm）、（20.12±1.60）μg /g（Ag NPs-47.6 nm）。血液中Ag的濃度隨著時(shí)間的推移而降低，而中腸中Ag的濃度則持續(xù)升高;蠶砂中Ag濃度也隨時(shí)間而降低。由此可見，注射進(jìn)入血液中的Ag NPs會(huì)向中腸轉(zhuǎn)運(yùn)，再通過代謝進(jìn)入蠶砂而被排出體外。小粒徑的Ag NPs更容易被家蠶吸收并在體內(nèi)富集，而大粒徑的Ag NPs更容易被代謝進(jìn)入蠶砂。通過對(duì)不同粒徑Ag NPs在家蠶體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、分布和代謝的研究，可為Ag NPs的毒理研究提供了一定的支持。

關(guān)鍵詞?納米銀顆粒;家蠶;電感耦合等離子體質(zhì)譜;尺寸效應(yīng)

中圖分類號(hào)?S881文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2019）22-0103-04

Abstract?Taking silkworm as model organism，this paper studied the transport，distribution and metabolic of two different sizes of nanosilver particles （Ag NPs with particle size of （23.2±2.8） and （47.6±5.2） nm，respectively，denoted Ag NPs-23.2 nm and Ag NPs-47.6 nm） in silkworm.On the 3rd day of the 5thinstar silkworm，different concentrations （60，120，180 μg per silkworm） of Ag NPs were introduced into silkworm by gastropod injection.Silkworm blood，silk gland and midgut were obtained by dissecting silkworm 24，48 and 72 h after injection respectively.And silkworm feces was collected at the same time，silk was collected after cocooning，and then the concentration of Ag in various tissues and silkworm feces，silk was determined by microwave digestion combined with inductively coupled plasma mass spectrometry （ICP-MS）.The results showed that the concentration of Ag in different tissues varied greatly with time. After injecting120 μg Ag per silkworm 24 h，the concentration of Ag in blood was （23.87±3.00） μg/mL （Ag NPS-23.2 nm） and （6.54±0.33） μg/mL （Ag NPS-47.6 nm） respectively， and the concentrations of Ag in midgut were （200.34±12.11） （Ag NPS-23.2 nm） and （20.12±1.60）μg/g （Ag NPS-47.6 nm），respectively.The concentrations of Ag in the blood decreased with the time，while the concentration of Ag in the midgut continued to increase.Ag concentration in silkworm feces also decreased with time.Therefore，Ag NPs injected into the blood would be transported to the midgut and then excreted out of the body through metabolism into silkworm feces.Smallsized Ag NPs was easier to be absorbed by silkworm and enriched in vivo，while largesized Ag NPs was easier to be metabolized into silkworm feces.The research on the transport，distribution and metabolism of Ag NPs with different sizes in silkworm body provided some supports for toxicological research of Ag NPs.

Key words?Ag NPS;Silkworm;ICP-MS;Size effect

銀是一種儲(chǔ)量相對(duì)豐富、價(jià)格低廉且物理性能良好的貴金屬，可被應(yīng)用于表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）檢測[1]、化學(xué)分析及單分子檢測等領(lǐng)域。此外，銀在所有金屬中具有最好的電導(dǎo)和熱導(dǎo)性能，可作為理想的電氣元件和極好的催化劑[2]。隨著納米科技的不斷發(fā)展，銀納米（AgNPs）良好的抗菌性能、光學(xué)性能以及其他特殊性能也被不斷開發(fā)應(yīng)用。AgNPs釋放的Ag離子已被證實(shí)具有抗菌作用，這也是納米毒理學(xué)關(guān)注的焦點(diǎn)之一[3]。目前，Ag NPs已被廣泛應(yīng)用于光電學(xué)、能源采集、催化材料、化工、生物傳感、成像以及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。吳源[4]報(bào)道Ag NPs對(duì)生物有一定的毒性，但Ag NPs進(jìn)入生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)方式、分布情況以及代謝機(jī)制仍不清楚。

家蠶（Bombyx mori L.）是一種完全變態(tài)的鱗翅目昆蟲，其蠶絲可應(yīng)用于紡織、制藥以及醫(yī)療等領(lǐng)域，具有重要的藥用及食用價(jià)值，同時(shí)亦可作為模式生物用于科學(xué)研究[5-7]。家蠶作為新興的模式生物，具有世代短、子代多、遺傳資源豐富以及基因與人類基因相似性高等優(yōu)勢[8]。

電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）是一種優(yōu)異的元素分析技術(shù)，與傳統(tǒng)的原子吸收光譜法（AAS）、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP-OES）[9]相比，具有高靈敏度、譜線干擾少、分析速度快、所需的檢測樣品量少等特點(diǎn)[10]。

筆者以檸檬酸鈉和單寧酸2種還原劑的組合還原硝酸銀，合成了高度分散的2種不同粒徑的Ag NPs[3]，并以家蠶作為模式生物，對(duì)Ag NPs進(jìn)入家蠶體內(nèi)后的轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝及分布情況進(jìn)行了研究。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料與試劑

試驗(yàn)用家蠶品種為菁松×皓月，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所提供。硝酸銀（AgNO3）、檸檬酸鈉（Na3C6H5O7）和單寧酸（C76H52O46）均購自國藥公司;電子級(jí)硝酸購自阿拉丁試劑有限公司;質(zhì)譜調(diào)諧液（Ba、Be、Bi、Ce、Co、In、Li、Ni、Pb、U濃度均為10 mg/L）;銀標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為1 000 mg/L）和銦標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為1 000 mg/L，配制成5 μg/L 使用）均購自阿拉丁試劑上海有限公司;高純氬氣、氮?dú)猓兌葹?9.999%），購自蘇州金宏氣體股份有限公司;超純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。

1.2?主要儀器?HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋，為中國金壇市醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品;臺(tái)式離心機(jī)（Multifuge XIR），為美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品;超聲波清洗器（KH-700DE），為昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司產(chǎn)品;透射電子顯微鏡（Tecnai 12），為荷蘭Philips公司產(chǎn)品;磁力攪拌器（C-MAG HS10），為德國IKA公司產(chǎn)品;電子天平（MS204S），為瑞士METTLER公司產(chǎn)品;紫外光度儀，型號(hào)UV-2450產(chǎn)于日本;ICP-MS X Series 2型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，為美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品;MARS Xpress微波消解儀，為美國CEM公司產(chǎn)品;BHW-09C恒溫加熱趕酸儀，為上海博通化學(xué)科技有限公司產(chǎn)品;超純水機(jī)，為法國Millipore公司產(chǎn)品。

1.3?Ag NPs的合成與表征

將玻璃儀器用硝酸浸泡、超純水清洗3遍后，放入60 ℃烘箱中備用。在含有轉(zhuǎn)子的三口燒瓶中加入100 mL蒸餾水，再加入5 mmol/L的檸檬酸鈉和適量的單寧酸，加熱攪拌至沸騰后，加入1 mL 25 mmol/L的AgNO3溶液，該無色溶液立即變?yōu)榱咙S色，加熱保持沸騰反應(yīng)30 min。反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，11 000 r/min離心（去除過量的單寧酸）20 min 3次，將離心后的銀納米分散在蒸餾水中。

參照文獻(xiàn)[3]方法控制單寧酸濃度分別為0.25和 5.00 mmol/L，生成粒徑分別為23和47 nm的Ag NPs。Ag NPs的大小通過調(diào)節(jié)單寧酸的濃度來控制。

取0.01 g Ag NPs置于20 mL燒杯中，加入10?mL超純水，將其用磁力攪拌器攪拌30 min，隨后將懸濁液倒入離心管中，100 Hz、25 ℃條件下超聲10 min，使得Ag NPs均勻、充分地混合在水中。將混合液滴加在銅網(wǎng)支持膜上，然后將其放置在紅外燈下干燥30 min，置于透射顯微鏡上觀測。透射電鏡結(jié)果表明，Ag NPs的實(shí)際粒徑分別為（23.2±2.8）和（47.6±5.2）nm（圖1），與預(yù)期結(jié)果基本相符。

1.4?Ag NPs注射試驗(yàn)

通過標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)技術(shù)將家蠶飼養(yǎng)至5齡第3天，挑選體重（2.00±0.2）g、體長（2.5±0.2）cm的家蠶用于后續(xù)試驗(yàn)研究。將挑選好的家蠶隨機(jī)分成30組，每組數(shù)量為30頭。

準(zhǔn)確稱取體重1.8 g、不同粒徑的Ag NPs粉末置于100?mL容量瓶中，用超純水定容，得到18 mg/mL的Ag NPs懸浮液。100 Hz、25 ℃條件下超聲10 min，制得混合均勻的Ag NPs水混合液，再分別稀釋至12和6 mg/mL。利用微量注射器將混合液通過腹足注射進(jìn)家蠶體內(nèi)，每頭10 μL，注射前需對(duì)家蠶進(jìn)行饑餓處理12 h，接受注射后的家蠶用新鮮桑葉正常飼養(yǎng)。

家蠶5齡第4、5、6天（即注射后24、48、72 h）每組分別隨機(jī)取出5頭進(jìn)行解剖，依次取家蠶的血液、中腸、絲腺，并對(duì)蠶砂進(jìn)行收集，取家蠶組織時(shí)，應(yīng)盡量保持組織的完整性，血液要事先加入苯基硫脲，去除中腸上可能黏附的桑葉。選取絲腺時(shí)，保證前、中、后部絲腺被完整采集。解剖出的各組織用超純水涮洗干凈后與血液均置于-20 ℃冰箱中保存待用。

將每組剩余家蠶正常飼養(yǎng)至結(jié)繭，收集蠶繭。蠶繭用碳酸鈉水溶液進(jìn)行脫膠處理，烘干待測。

1.5?微波消解

將血液取出常溫放置一段時(shí)間解凍，組織樣品放置于烘箱中80 ℃干燥至恒重，然后將其研磨成粉末，準(zhǔn)確取血液0.1?mL、組織樣品、蠶絲和蠶砂均取0.1 g，對(duì)照組加入等體積的超純水，將其放入消解罐中，隨后加入5 mL的電子級(jí)硝酸，放置過夜后再向消解罐中加入3?mL的電子級(jí)硝酸，擰緊蓋后將其放置在微波消解儀中進(jìn)行消解，消解的參數(shù)見表1。消解后的樣品需移入趕酸儀中進(jìn)行趕酸，趕酸儀溫度設(shè)置為145 ℃，時(shí)間70 min，等趕酸后的樣品冷卻至室溫后，將樣品倒入25?mL的容量瓶中，用1%稀硝酸定容，待測。

1.6?ICP-MS參數(shù)的選擇與優(yōu)化

按照優(yōu)化后的質(zhì)譜測定條件，選用銦為內(nèi)標(biāo)元素對(duì)標(biāo)準(zhǔn)濃度組、對(duì)照組和樣品組進(jìn)行測定。儀器參數(shù)的選擇與優(yōu)化如表2所示。

Ag濃度的計(jì)算公式如下：

固體組織：ω1=C×V×10-3m（1）

血液：ω2=C×V×10-3V0（2）

式中，ω1為固體組織中銀元素的濃度，單位為μg/g;ω2為血液中銀元素濃度，單位為μg/mL;C表示質(zhì)譜測得的樣品中的元素濃度，單位為μg/L;m表示固體樣品取樣量，單位為g;V表示消解后樣品定容的體積，單位為 mL;V0表示血液取樣的體積，單位為 mL。

2?結(jié)果與分析

2.1?精密度試驗(yàn)

為評(píng)估ICP-MS方法的精密度，使用家蠶的血液作為樣品，制備組織勻漿，并稀釋一定的倍數(shù)以獲得高、中、低3種濃度水平。經(jīng)檢測分析可知，精密度為3.69%～5.24%，說明該方法具有較好的重現(xiàn)性。

2.2?家蠶不同組織及蠶砂中Ag的濃度

2.2.1?濃度為120 μg/頭Ag NPs不同尺寸的比較。給家蠶注射Ag NPs后，利用ICP-MS對(duì)家蠶的血液、蠶砂以及各組織的Ag元素濃度進(jìn)行測定，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，空白組（不注射Ag NPs）的測定值都小于0.1 μg/g，可認(rèn)為空白組家蠶體內(nèi)不含有Ag元素。血液中的Ag濃度第4～5天呈現(xiàn)明顯下降的趨勢，第5～6天維持在16.5 μg/g（Ag NPs-23.2 nm）和3.5 μg/g（Ag-NPs 47.6 nm）。與血液相比，中腸中Ag的濃度卻呈明顯上升的趨勢。絲腺中Ag的濃度變化并不明顯，第4～6天基本維持在同一水平，由此可推斷Ag進(jìn)入家蠶后會(huì)有部分轉(zhuǎn)運(yùn)到絲腺，24 h后絲腺中Ag濃度基本不變，說明不再進(jìn)一步累積。第4天蠶砂中Ag的濃度明顯高于第5～6天，第5～6天蠶砂中Ag的濃度維持在1 μg/g左右。由此可見，Ag NPs被注射進(jìn)家蠶體內(nèi)后進(jìn)入血液中，導(dǎo)致血液中Ag濃度升高，然后會(huì)隨著時(shí)間的推移向中腸轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)一部分會(huì)被代謝進(jìn)入蠶砂，從而排出體外。第5～6天蠶砂中Ag的濃度很少，說明Ag作為一種重金屬元素容易在體內(nèi)富集，然后緩慢被代謝出體外。Chang等[11]給家蠶喂食Ag NPs也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。

不同粒徑的Ag NPs在家蠶體內(nèi)的分布情況也有很大的差異。中腸和血液中小粒徑（23.2 nm）Ag NPs的濃度比大粒徑（47.6 nm）AgNPs的濃度高得多;蠶砂中卻正好相反，粒徑47.6 nm的Ag NPs濃度更高，說明大粒徑的Ag NPs更容易排出體外。由此可見，小粒徑的Ag NPs更容易被吸收在體內(nèi)富集，而大粒徑的Ag NPs更容易被代謝進(jìn)入蠶砂。

絲腺中Ag濃度隨著時(shí)間的變化并不明顯，而蠶繭和脫膠絲中都檢測到微量的Ag元素，說明絲腺中的Ag會(huì)在絲腺合成蠶絲的過程中進(jìn)入蠶絲。23.2 nm和47.6 nm AgNPs組蠶繭中Ag的濃度分別為脫膠絲的6.3倍和2.2倍。由此可見，粒徑23.2 nm的Ag進(jìn)入蠶絲后容易分布于絲膠。

2.2.2?注射不同濃度Ag NPs后第5天Ag濃度的比較。注射不同濃度的Ag NPs后家蠶5齡第5天絲腺和中腸中Ag濃度的變化見圖3。從圖3可以看出，對(duì)于粒徑為23.2 nm的Ag NPs組，當(dāng)Ag NPs濃度從60 μg/頭增加到120 μg/頭，絲腺和中腸中Ag濃度分別增加了0.98倍和0.99倍;當(dāng)Ag NPs濃度從120 μg/頭增加到180 μg/頭時(shí)，絲腺和中腸中Ag的濃度分別增加了1.07倍和0.31倍。對(duì)于粒徑為47.6 nm的Ag NPs組，當(dāng)Ag濃度從60 μg/頭增加到120 μg/頭時(shí)，絲腺和中腸中Ag濃度分別增加了1.01倍和1.00;當(dāng)Ag濃度從120 μg/頭增加到180 μg/頭時(shí)，絲腺和中腸中Ag濃度分別增加了0.15倍和0.79倍。由此可見，小粒徑的Ag NPs更容易在中腸中富集。

3?結(jié)論

該研究合成了2種不同粒徑的Ag NPs，然后將其注射到家蠶體內(nèi)，采用ICP-MS測定家蠶的血液、絲腺、中腸、蠶砂和蠶絲中Ag的濃度。結(jié)果表明，各組織中Ag的濃度隨時(shí)間的變化而變化。其中，血液中Ag的濃度隨時(shí)間的變化而逐漸降低;在注射后的24～72 h，中腸內(nèi)Ag的濃度持續(xù)升高，表明Ag會(huì)在中腸中富集;絲腺中Ag的濃度在24～72 h基本保持不變;蠶砂中Ag的濃度在注射后24 h較高，此后Ag的濃度都維持在較低水平，表明轉(zhuǎn)運(yùn)入中腸的Ag會(huì)參與代謝并隨著蠶砂排出體外，但這一過程在注射后大約24 h內(nèi)比較突出。注射的Ag NPs濃度越大，中腸和絲腺中Ag的濃度就越大。小粒徑的Ag NPs更容易被吸收、在體內(nèi)富集，而大粒徑的Ag NPs更容易被代謝進(jìn)入蠶砂。Ag NPs會(huì)通過絲腺進(jìn)入蠶絲，粒徑23 nm的Ag NPs在絲膠中有更多分布。該試驗(yàn)初步研究了Ag NPs進(jìn)入家蠶體內(nèi)后的轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝及分布情況，為Ag NPs的毒理研究奠定了基礎(chǔ)。

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