黎曉英 李俊威 劉勝貴 田玉橋 陳三春 方偉 鄒娟 邱小燕 伍賢進(jìn)

摘要?以天麻塊莖為供試材料，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和紫外分光光度含量測(cè)定技術(shù)，比較改良CTAB法和SDS-CTAB法提取天麻塊莖基因組 DNA 的效果。結(jié)果表明，改良CTAB 法提取天麻塊莖基因組 DNA的產(chǎn)量高于 SDS-CTAB法，純度略次于SDS-CTAB法，二者提取的基因組 DNA，DNA 結(jié)構(gòu)完整、大片段的 DNA 分子含量高。該研究為天麻基因組DNA提取方法的選擇提供了參考依據(jù)，為天麻種質(zhì)資源的分子遺傳研究奠定了一定的科學(xué)與技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞?天麻;基因組 DNA;SDS-CTAB法;改良CTAB 法

中圖分類號(hào)?Q943文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2019）22-0111-02

Abstract?Taking Gastrodia elata B1.tuber as material，agarose gel electrophoresis and ultraviolet spectrophotometry were used to compare the effects of improved CTAB and SDSCTAB on genomic DNA from rhizoma tuber of G.elata.The results showed that the yield of genomic DNA extracted from G.elata tubers by improved CTAB method was higher than that by SDSCTAB method，and the purity was slightly lower than that by SDSCTAB method.The results provided a reference for selecting genomic DNA extraction methods of G.elata and laid a scientific and technical foundation for the molecular genetic research of G.elata germplasm resources.

Key words?Gastrodia elata B1.;Genomic DNA;SDSCTAB method;Improved CTAB method

天麻為常用名貴中藥，是蘭科植物天麻（Gastrodia elata B1.）的莖塊，植株生長(zhǎng)于海拔400～3 200 m的林下、林中空地、林邊緣及灌叢邊緣，為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物。其根莖入藥用以治療頭暈?zāi)垦！⒅w麻木、小兒驚風(fēng)癲癇抽搐等癥，同時(shí)還具有刺激神經(jīng)系統(tǒng)、健腦、延緩衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和預(yù)防骨質(zhì)疏松等作用[1-2]。因天麻特殊的生物學(xué)特性——沒有一般植物所具有的葉片，加上含豐富的蛋白質(zhì)、較高的多糖和酚類、酶類及其他次生代謝物，使得其基因組DNA的提取比較困難。傳統(tǒng)的提取方法常常導(dǎo)致基因組DNA產(chǎn)量過(guò)低、雜質(zhì)較多、DNA不純、質(zhì)量較難控制等許多問(wèn)題，提取物僅可滿足普通的分子生物學(xué)試驗(yàn)分析的需要，因此眾多學(xué)者對(duì)中藥材基因組DNA提取方法進(jìn)行過(guò)探討[3-5]。關(guān)萍等[6] 對(duì)天麻基因組 DNA 提取方法進(jìn)行了比較研究，認(rèn)為SDS-CTAB 法是較理想的提取方法;張弦等[7]證明SDS-CTAB法提取DNA完整、純度高、重復(fù)性好;程紀(jì)倫等[8]應(yīng)用CTAB 法和改良的CTAB法提取天麻基因組 DNA，結(jié)果表明改良 CTAB 法提取的天麻基因組 DNA 產(chǎn)量高、純度高。但是，提取天麻基因組DNA究竟采用改良 CTAB 法效果好還是SDS-CTAB法好，還有待考證。

基于天麻基因組DNA提取方法的研究現(xiàn)狀，筆者將應(yīng)用改良 CTAB 法和SDS-CTAB法對(duì)天麻基因組DNA提取效果進(jìn)行比較研究。

1?材料與方法

1.1?材料?供試天麻為采集于湖北、陜西等地區(qū)的新鮮天麻，由湖南省博世康中醫(yī)藥有限公司提供。

1.2?主要試劑

1.2.1?改良 CTAB 法主要試劑。CTAB，氯仿∶異戊醇（24∶1），RNase A，異丙醇，無(wú)水乙醇，TE。

1.2.2?SDS-CTAB法主要試劑。

β-巰基乙醇，蛋白酶K，SDS， CTAB，氯仿∶異戊醇（24∶1），RNase A，NaAc，無(wú)水乙醇， TE。

1.3?方法

1.3.1?改良 CTAB 法。

取天麻細(xì)小塊狀物約0.5 g放入研缽中，加入1 mL預(yù)熱的 CTAB提取液，研磨;將細(xì)粉末轉(zhuǎn)移到1.5 mL的Eppendorf管中，再加CTAB提取液至1.5 mL，置于65 ℃水浴中保溫1 h;從水浴中取出離心管，冷卻至室溫，再12 000 r/min離心10 min，然后吸取上清液放至另一干凈已滅菌的1.5 mL Eppendorf管中，同時(shí)加入同樣體積的氯仿∶異戊醇（24∶1），輕緩顛倒混勻，12 000 r/min離心5 min，然后吸取上清液放至另一干凈已滅菌的1.5 mL Eppendorf管中，同時(shí)加入同樣體積的異丙醇，混勻，放置在-20 ℃冰箱中60 min;12 000 r/min離心15 min獲得DNA沉淀，70%乙醇洗2次，沉淀自然干燥;加入30 μL TE緩沖液或者去離子水（含有10 μg/mL RNase A）溶解DNA，并貯存在4 ℃冰箱中。

1.3.2?SDS-CTAB法。

將1.5 mL的Eppendorf管中裝70 μL β-巰基乙醇，置于-20 ℃冰箱中預(yù)冷，取天麻細(xì)小塊狀物約0.5 g，置于預(yù)冷的離心管中，同時(shí)快速加入40 μL 10 mg/mL蛋白酶K，混合;加入56 ℃預(yù)熱SDS 700 μL，混勻， 56 ℃水浴120?min，然后取出，冷卻至室溫，加入1/2體積100 g/L CTAB，56 ℃水浴30?min，取出，冷卻至室溫，再12 000 r/min離心10 min，然后吸取上清液放至另一干凈已滅菌的1.5 mL Eppendorf管中，同時(shí)加入同樣體積的氯仿∶異戊醇（24∶1），混合30 min，12 000 r/min離心12 min，取上清液重復(fù)操作一次。取上清液至另一無(wú)菌Eppendorf管中，加入-20 ℃預(yù)冷的1/10體積3 mol/L NaAc和2倍體積無(wú)水乙醇，置-20 ℃冰箱中沉淀60 min，12 000 r/min離心10 min。用70%冷乙醇洗滌沉淀2次，每次12 000 r/min離心10 min，沉淀自然干燥;加入30 μL TE緩沖液或者去離子水（含有10 μg/mL RNase A）溶解DNA，并貯存在4 ℃冰箱中。

1.4?基因組DNA的電泳檢測(cè)

1.4.1?配制 1%瓊脂糖凝膠。

用電子天平稱取瓊脂糖粉1 000 mg，置于錐形瓶中，加入1×TBE溶液100 mL，充分搖勻，將該錐形瓶直接加熱至TBE溶液沸騰，煮沸20 s，視覺判斷瓊脂糖粉完全溶解，取出加入一滴EB（約20 μL），緩慢搖勻后，自然降溫至55 ℃左右（以不燙手背為宜）。然后，放置好制膠器，插好擋板，按要求在固定處放好梳子，再將溶液緩緩倒入膠槽，室溫下放置1 h左右，待凝膠冷卻凝固后，輕輕移去梳子，去掉擋板，將凝膠板置于含有TBE緩沖液的水平電泳槽中。

1.4.2?上樣。取2 μL上述2種方法提取的DNA混入少量的溴酚藍(lán)（大約是樣品量的1/10），混勻后全部點(diǎn)入梳子孔內(nèi)，注意留出第一孔位置加入等量的DNA分子量標(biāo)記。

1.4.3?恒壓電泳。

接通電源后，調(diào)節(jié)電壓至100 V，啟動(dòng)電泳，恒壓電泳1.5～2.0 h，根據(jù)溴酚藍(lán)距離點(diǎn)樣孔的位置來(lái)判斷電泳進(jìn)程。

1.4.4?拍照。將凝膠從凝膠板上取下，采用凝膠成像儀拍照。

1.5?DNA的紫外檢測(cè)

蛋白質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)為280 nm，核苷酸為 260 nm，測(cè)波長(zhǎng)分別為 260、280 nm 時(shí)的 OD 值進(jìn)行比較，分析DNA的濃度和純度。先用2 mL雙蒸水校正紫外分光光度計(jì)的零點(diǎn)，用微量移液器取DNA樣品2 μL，加雙蒸水稀釋10倍并充分混勻后，全部轉(zhuǎn)入專用比色皿中，分別讀出其在不同波長(zhǎng)下的OD值，然后計(jì)算DNA樣品的濃度。DNA樣品濃度（μg/μL）=OD260×核酸稀釋濃度×50/1 000。

2?結(jié)果與分析

2.1?改良 CTAB 法提取的天麻基因組DNA產(chǎn)量及純度分析

2.1.1?基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

運(yùn)用改良 CTAB 法提取的天麻基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1，DNA條帶亮度高，無(wú)明顯雜帶。

2.1.2?DNA產(chǎn)量及純度分析。該方法提取 DNA的OD260/OD280比值為 1.756，<1.8，表明 DNA 中存在少量的雜質(zhì);根據(jù) OD260計(jì)算所提取的 DNA 濃度為 1.513 μg/μL。

2.2?SDS-CTAB 法提取的天麻基因組DNA產(chǎn)量及純度分析

2.2.1?基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

運(yùn)用SDS-CTAB 法提取天麻基因組DNA后，取樣2 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2，DNA條帶亮度好，無(wú)雜帶。

2.2.2?DNA產(chǎn)量及純度分析。

該法提取 DNA的OD260/OD280比值為1.822，接近1.80，表明 DNA純度比較高，污染比較少;根據(jù) OD260計(jì)算所提取的天麻基因組 DNA 濃度為 1.296 μg/μL。

3?討論

2種方法提取的天麻基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，改良 CTAB 法的條帶亮度明顯優(yōu)于SDS-CTAB法。SDS-CTAB法使用了β-巰基乙醇、蛋白酶K、SDS，這些試劑的共同作用均可分解蛋白質(zhì)，便于DNA解離，但是β-巰基乙醇為高毒試劑，且氣味難聞。SDS-CTAB法耗時(shí)較改良 CTAB 法長(zhǎng)，操作步驟較多，操作過(guò)程難免造成DNA損失。因此，SDS-CTAB法得到的DNA純度比改良 CTAB 法高，產(chǎn)量比改良 CTAB 法低。

天麻塊莖多糖類和酚類物質(zhì)的含量相當(dāng)高，在試驗(yàn)中有效篩選和改進(jìn)不同的基因組DNA的提取方法對(duì)獲得高質(zhì)量的基因組DNA十分重要，也是對(duì)天麻物種進(jìn)行分子生物學(xué)研究的重要前提[9]。通過(guò)改良CTAB法和SDS-CTAB法提取天麻基因組DNA的比較研究表明，改良CTAB法提取天麻塊莖基因組DNA的產(chǎn)量?jī)?yōu)于SDS-CTAB法，雖然改良CTAB法提取的DNA純度略差，但是二者提取的 DNA 片段完整無(wú)斷裂，主要原因是2種方法都使用了CTAB，CTAB具有從大量產(chǎn)生黏多糖的有機(jī)體中制備純化DNA的特性。CTAB屬于一種帶陽(yáng)離子的表面活性劑，具有較好的化學(xué)特性，即在溶液中離子強(qiáng)度低的情況下，可以沉淀核酸和酸性多聚糖，在溶液中離子強(qiáng)度高的情況下，CTAB與蛋白質(zhì)和非酸性多聚糖形成復(fù)合物而不能沉淀DNA和RNA[10]。提取基因DNA必須考慮后續(xù)的分子生物學(xué)研究，傾向于選擇無(wú)雜質(zhì)且DNA 片段完整的提取方法。

在天麻塊莖基因組DNA提取過(guò)程中務(wù)必始終注意以下幾點(diǎn)：①研缽、吸頭、配制的試劑要按照要求進(jìn)行滅菌，運(yùn)用SDS-CTAB法時(shí)，研缽和部分試劑要在低溫冰箱中預(yù)冷，盡可能地減少外來(lái)污染和DNA 降解;②研磨材料的力度應(yīng)該適當(dāng)，太小造成細(xì)胞破裂不充分，影響DNA得率，過(guò)大可能損壞DNA分子，所以在整個(gè)研磨過(guò)程中，應(yīng)該保持用力均勻且方向一致;③操作過(guò)程避免劇烈振蕩，以減少DNA斷裂，動(dòng)作盡量溫和，保持DNA完整;④操作要規(guī)范，在制備瓊脂糖凝膠時(shí)要避免產(chǎn)生氣泡，上樣電泳時(shí)移液器吸頭不能插入膠中或劃破膠孔，電泳時(shí)先高電壓再低電壓;⑤紫外分光光度計(jì)測(cè)定 DNA 樣品時(shí)，使用TE 緩沖液作為溶解 DNA 的溶液比較好，是由于TE 緩沖液保持了低離子濃度，可以保證讀數(shù)準(zhǔn)確。

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