趙國(guó)超 王冬翼 張珍 王彤 吳雪源 曾文秀 李建粵

摘 要： 以“浦軟粳S”為轉(zhuǎn)育親本，利用分子標(biāo)記輔助常規(guī)育種技術(shù)成功培育出含有Pi9，Pita，Pib和Pigm稻瘟病抗性基因及軟米基因（Wxmq），同時(shí)表現(xiàn)柱頭外露率高的兩系不育系水稻新品系“2179S”.“2179S”不育系莖稈粗壯，矮桿大穗，株高為63.8 cm，柱頭外露率平均為60%.研究結(jié)果為今后培育具有稻瘟病抗性的優(yōu)質(zhì)兩系雜交水稻新組合提供不育系親本.

關(guān)鍵詞： 兩系不育系水稻; 稻瘟病抗性基因; 軟米基因; 分子標(biāo)記輔助選育

中圖分類號(hào)： S 511 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)： 1000-5137（2019）05-0591-06

Abstract： Using “Puruan Ging S” as the parent，we have bred new two-line male sterile rice cultivars “2179S” containing high exerted stigma phenotype as well as Pi9，Pita，Pib，and Pigm rice blast resistance genes and soft rice gene（Wxmq） by molecular marker-assisted selection.The “2179S” showed strong stalks，short stems，large panicle，and itsaverage plant height was 63.8 cm.The stigma exertion rate was about 60%.The results providing sterile line parents for developing new combination of high quality two-line hybrid rice with resistance to rice blast.

Key words： two-line male sterile rice; blast resistance gene; soft rice gene; molecular marker-assisted selection

雜交水稻產(chǎn)量大多高于常規(guī)培育的水稻[1].我國(guó)雜交水稻有三系法和兩系法2種類型.與三系法相比，兩系法具有配組自由、種子生產(chǎn)成本低、無(wú)不育細(xì)胞質(zhì)負(fù)效應(yīng)、易轉(zhuǎn)育新不育系等優(yōu)點(diǎn)[2].目前，兩系法雜交水稻配套、繁殖、制種等技術(shù)都已成熟，在我國(guó)水稻生產(chǎn)應(yīng)用上已大面積推廣.

稻瘟病是水稻種植的重要病害之一.在水稻生產(chǎn)中，提前使用農(nóng)藥可在一定程度上降低水稻稻瘟病病害的發(fā)生，但是會(huì)傷害生態(tài)環(huán)境.在生產(chǎn)中使用抗稻瘟病品種是最有效的措施.通過(guò)分子標(biāo)記輔助選育含有稻瘟病抗性基因的兩系不育系水稻，在我國(guó)已有一些成功報(bào)道[3-7]，這些品種都屬于秈型水稻.目前上海市水稻種植面積約有 87000 hm2，其中雜交稻種植占據(jù)了較大的比例.上海市及其周邊地區(qū)人們喜食粳型水稻，因此有必要培育適合在上海地區(qū)種植的抗稻瘟病雜交水稻.

本課題組利用分子標(biāo)記輔助常規(guī)選育技術(shù)，已成功培育了高柱頭外露率軟米型的兩系不育系水稻新品系“浦軟粳S”（暫定名）.本研究將利用分子標(biāo)記輔助常規(guī)育種技術(shù)進(jìn)一步選育含有抗稻瘟病基因和軟米基因，同時(shí)保持高柱頭外露率的兩系不育系水稻新品系.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

使用3種水稻作為親本材料：第一個(gè)是在培育“浦軟粳S”期間，曾獲得含有柱頭外露率高并含有純合軟米基因（Wxmq）的兩系不育系中間材料“2629S”;第二個(gè)是從 “浦粳06A/42S”雜交后代中選育的高柱頭外露、稻瘟病高抗性的可育水稻“B115”，該水稻含有抗稻瘟病基因Pi9，Pita，Pib和Pigm;第三個(gè)是“浦軟粳S”.這3種水稻均由上海市浦東新區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心自主選育.

1.2 軟米基因和抗稻瘟病基因鑒定

提取水稻葉片基因組DNA.按照謝米雪等[8]的報(bào)道對(duì)新選育的兩系不育系水稻進(jìn)行軟米基因檢測(cè).參考韓笑等[9]的報(bào)道，分析新選育的兩系不育系水稻的3種抗稻瘟病基因：Pi9，Pita，Pib.參考于苗苗[10]的報(bào)道，分析新選育的兩系不育系水稻抗稻瘟病基因Pigm.

1.3 育性及農(nóng)藝性狀考察

采用顯微鏡觀察兩系不育系水稻花粉類型，同時(shí)通過(guò)套袋考察植株自交結(jié)實(shí)率.在兩系不育系水稻開(kāi)花時(shí)進(jìn)行株高、穗數(shù)、穗長(zhǎng)、柱頭外露率等數(shù)據(jù)的考察.

2 結(jié)果與分析

2.1 選育過(guò)程及育性考察

2016年年初，以“2629S”為母本，“B115”為父本進(jìn)行雜交，收獲F1種子.F1植株再自交收獲F2種子.對(duì)F2植株進(jìn)行田間農(nóng)藝性狀考察，用顯微鏡觀察其花粉的育性，選擇矮桿大穗、柱頭外露率高、花粉完全呈典敗類型的單株，進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，篩選含有抗稻瘟病基因的植株，繼續(xù)與“浦軟粳S”兩系不育系進(jìn)行持續(xù)回交三代，得到BC3F1.在每次回交前都先采用分子標(biāo)記對(duì)回交親本進(jìn)行抗稻瘟病基因檢測(cè)，選取含有抗稻瘟病基因的植株再進(jìn)行回交.隨后在上海、海南兩地以每年2～3代的速度進(jìn)行穿插加代.在對(duì)自交后代篩選中，繼續(xù)選擇矮桿大穗，柱頭外露率高，花粉完全為典敗類型的單株，進(jìn)行軟米基因和抗稻瘟病基因檢測(cè)，于2018年初獲得軟米基因純合、抗稻瘟病基因純合、其他農(nóng)藝性狀也基本穩(wěn)定的兩系不育系水稻新品系“2179S”（圖1）.

“2179S”為光溫敏核不育系，在長(zhǎng)日照、高溫時(shí)不育，在短日照、低溫時(shí)可育.通過(guò)分期播種進(jìn)行育性觀察，“2179S”不育系均具有較長(zhǎng)的穩(wěn)定不育期，最早如4月30日播種，8月5日始穗;6月20日播種，9月10日始穗，植株均表現(xiàn)不育.如播期再推遲，在9月15日后始穗，植株開(kāi)始轉(zhuǎn)為可育.無(wú)論在上海還是海南，在可育期植株的結(jié)實(shí)率都較低.由此推測(cè)，“2179S”不育系具有較低的育性轉(zhuǎn)換臨界溫度，育性較穩(wěn)定.

2.2 軟米基因檢測(cè)

在蠟質(zhì)（Wx）基因第4外顯子+693處發(fā)生堿基替換突變，將導(dǎo)致水稻稻米合成直鏈淀粉含量降低[11-12]，使稻米呈現(xiàn)軟米特征.利用謝米雪等[8]在Wx基因第4外顯子+693處突變建立檢測(cè)軟米特性的CAPS（NlaIII）分子標(biāo)記操作方法，Wx基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增產(chǎn)物總長(zhǎng)度為557 bp，含有+693位點(diǎn)突變的Wx基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)內(nèi)切酶NlaIII消化后，成為380 bp和177 bp 2條帶，而沒(méi)有+693位點(diǎn)突變的Wx基因擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度保持557 bp（圖2）.

2.3 抗稻瘟病基因鑒定

對(duì)于Pi9基因檢測(cè)，DNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后含有397 bp和291 bp 2種相對(duì)分子質(zhì)量不同的條帶，其中僅僅含有291 bp條帶的為純合抗病植株，只含有397 bp條帶的為感病植株，同時(shí)含有2種條帶的為雜合植株，如圖3（a）所示.對(duì)于Pita基因，DNA擴(kuò)增產(chǎn)物如含有467 bp條帶的為抗病植株，如圖3（b）所示.Pib基因擴(kuò)增產(chǎn)物也有2種條帶，只含有803 bp條帶的為感病植株，只有365 bp條帶的為純合抗病植株，同時(shí)有2種條帶的為雜合植株，如圖3（c）所示.對(duì)于Pigm基因2種DNA擴(kuò)增產(chǎn)物中，只有1800 bp條帶的為感病植株，同時(shí)有2種條帶的為雜合植株，只有750 bp條帶的為純合抗病植株，如圖3（d）所示.

2.4 農(nóng)藝性狀分析

2018年8月考察新培育的兩系不育系水稻“2179S”的主要農(nóng)藝性狀：植株莖稈粗壯，矮桿大穗;平均株高為 （63.8±2.2）cm，平均每穴有效穗12.0±2.1，平均穗長(zhǎng)為 （16.4±1.1）cm，千粒重（質(zhì)量）約26.0 g，平均柱頭外露率為60%.

3 討 論

改良稻瘟病抗性是當(dāng)前雜交水稻育種的主要目標(biāo)之一[13].在水稻生長(zhǎng)的任何一個(gè)時(shí)期都有可能發(fā)生稻瘟病.稻瘟病防控不當(dāng)有可能會(huì)造成水稻大面積減產(chǎn).預(yù)防具有高產(chǎn)或超高產(chǎn)的雜交稻發(fā)生稻瘟病，對(duì)于保障水稻產(chǎn)量及我國(guó)糧食安全具有重要意義.

本研究涉及4個(gè)抗稻瘟病基因：Pi9，Pita，Pib和Pigm.李婷等[14]報(bào)道Pi9是已克隆的基因中抗譜最廣的抗性基因.有學(xué)者采用分子標(biāo)記輔助將Pi9抗性基因?qū)氩煌謴?fù)系水稻，均發(fā)現(xiàn)含有Pi9抗性基因的恢復(fù)系水稻與母本配制的雜交種對(duì)稻瘟病抗性比沒(méi)有導(dǎo)入Pi9抗性基因的恢復(fù)系配組的雜交種有顯著提高[15-17].王軍等[18]報(bào)道同時(shí)攜帶Pita和Pib基因這2個(gè)抗性基因可以大大提高江蘇省粳稻對(duì)穗頸瘟的抗性.廖常青等[7]將抗稻瘟病基因Pigm和Pi40分別導(dǎo)入兩系不育系水稻“創(chuàng)5S”中，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)含有Pigm和Pi40基因的水稻對(duì)稻瘟病的抗性都有顯著提高，并且含有Pigm抗病基因的“創(chuàng)5S”水稻比含有Pi40抗性基因的水稻對(duì)于稻瘟病的綜合抗性更強(qiáng).

對(duì)將Pi9抗性基因?qū)牖謴?fù)系并與母本配組后的雜交稻種進(jìn)行稻瘟病抗性研究，結(jié)果表明：Pi9抗性基因?qū)儆陲@性基因[15-17].還有一些研究也表明：水稻許多抗稻瘟病基因都屬于顯性基因[19-23].對(duì)于雜交稻而言，只要兩個(gè)親本中有一個(gè)親本具有抗稻瘟病基因，后代植株就具有抗稻瘟病特性.孟秋成等[20]在雜交稻配組實(shí)踐中也發(fā)現(xiàn)：當(dāng)母本為抗病品種，無(wú)論配組所使用的父本品系對(duì)稻瘟病菌株表現(xiàn)抗、感或高感性，雜種F1代植株都表現(xiàn)出高抗病性.

張羽等[24]在研究抗稻瘟病基因位點(diǎn)數(shù)目多少與水稻品種抗病性的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)：隨著水稻抗性基因位點(diǎn)數(shù)目的增多，品種的抗病性呈上升趨勢(shì)，由此認(rèn)為稻瘟病抗性需要多個(gè)抗性基因的共同作用.本研究培育的3個(gè)兩系不育系水稻新品系正是含有多個(gè)抗性基因的類型.由此推測(cè)，今后利用本研究培育的兩系不育系水稻與恢復(fù)系制種獲得的后代植株，對(duì)稻瘟病也可能具有較強(qiáng)的抗性.

近年來(lái)，隨著市場(chǎng)對(duì)于稻米品質(zhì)要求的提高，在兩系不育系水稻育種中也有一些涉及軟米選育方面的研究[25-26]，但是目前還未見(jiàn)進(jìn)行稻瘟病抗性和米質(zhì)同時(shí)改良方面的報(bào)道.本研究選育的新兩系不育系除了具有多個(gè)抗稻瘟病基因外，還含有軟米基因.今后使用這些兩系不育系配組的雜交稻種，不僅可能抵抗稻瘟病，同時(shí)商品米的口感也會(huì)較好.

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（責(zé)任編輯：顧浩然）