王海亮，錢 坤*

（1.天津市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會(huì)，天津 300061；2.天津市農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心，天津 300402）

丁酸梭菌是厭氧菌，革蘭氏染色后呈陽(yáng)性，顯微鏡下觀察為直桿狀、也見(jiàn)有彎曲狀，單雙均有、鏈不長(zhǎng)，偶爾發(fā)現(xiàn)絲狀菌體，中間隆起，呈煎蛋樣。細(xì)菌直徑約（0.5～1.7）×（2.4～7.6）μm，因周生鞭毛，能夠運(yùn)動(dòng)，內(nèi)生孢子?？梢岳脝翁腔蚨嗵堑忍妓衔锎x產(chǎn)酸，導(dǎo)致牛奶發(fā)酸、固化、產(chǎn)氣，但不消化[1]。

試驗(yàn)研究表明，丁酸梭菌在實(shí)驗(yàn)室平板上培養(yǎng)后，邊緣整齊，但不規(guī)則，略有酸臭味，并且其明顯特征之一是可以產(chǎn)淀粉酶，但無(wú)法水解纖維素和不能消化血清蛋白，碳水化合物被其水解后的終產(chǎn)物是丁酸、乳酸及醋酸等有機(jī)酸，同時(shí)有少許的丙酸、甲酸、硝酸鹽產(chǎn)生，對(duì)其進(jìn)行還原試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果都是陰性。有研究報(bào)道，丁酸梭菌耐受力較強(qiáng)，耐受外部的高溫，耐受外部的低pH濃度：在80 ℃熱源下加熱30 min后能夠全部存活，90 ℃熱源下加熱10 min 后仍能全部存活，保持活性，加熱20 min 后，存活率為95%；即使100 ℃加熱5 min，存活率為30%，pH 為1.0～5.0 依然可以存活，適宜存活的pH 范圍為4.0～9.8[2]。丁酸梭菌是益生菌之一，已作為抗生素替代品添加在實(shí)際生產(chǎn)中推廣使用[3]。

丁酸梭菌在動(dòng)物腸道內(nèi)的主要特性分別是：加快機(jī)體腸道中益生菌（乳酸桿菌，嗜酸乳桿菌等）的定植和繁衍，阻礙腸道中的條件性致病菌、腐敗菌等有害菌的繁衍，維持消化道內(nèi)微生態(tài)平衡，降低腸道中毒素的產(chǎn)生；可以在畜禽腸道中代謝得到多種促生長(zhǎng)因子，如維生素、淀粉酶等物質(zhì)，發(fā)揮保護(hù)畜禽健康的功效；丁酸是該菌的代謝營(yíng)養(yǎng)物，可促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞相關(guān)緊密連接蛋白的表達(dá)及組織的再生與修復(fù)；該菌對(duì)多類飼用抗生素而言擁有特別強(qiáng)的耐受性，且不受機(jī)體分泌的有機(jī)酸等物質(zhì)的影響，配伍禁忌少，使用方便。丁酸梭菌已成為一種新型抗生素替代品添加劑用于養(yǎng)殖業(yè)的實(shí)際生產(chǎn)中，可以減少抗生素的使用量，降低動(dòng)物產(chǎn)品中的藥物殘留及產(chǎn)生的耐藥性，維持動(dòng)物消化道中菌群平衡，提高動(dòng)物健康狀況，促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體的生長(zhǎng)和生產(chǎn)性能的充分發(fā)揮[4-6]。

本研究對(duì)丁酸梭菌制劑的試驗(yàn)室生物活性進(jìn)行分析，并通過(guò)測(cè)定相關(guān)的血清指標(biāo)、腸道微生物、腸道結(jié)構(gòu)和緊密連接蛋白表達(dá)來(lái)研究丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬腸道結(jié)構(gòu)發(fā)育和健康狀況的影響。

1 材料與方法

1.1 丁酸梭菌

丁酸梭菌制劑來(lái)源于仰韶生化工程（河南）有限公司，丁酸梭菌含量為2.0×109cfu·g-1，進(jìn)行倍比稀釋添加到基礎(chǔ)日糧中。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因子設(shè)計(jì)，選?。?8±2）日齡、健康狀況良好、平均體重為（7.26±0.42）kg的（杜×長(zhǎng)×大）斷奶仔豬16 頭，按完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分成2個(gè)處理，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2頭仔豬，飼養(yǎng)于專用代謝籠中，試驗(yàn)期為28 d。兩個(gè)處理組分別飼喂：陰性對(duì)照組：飼糧不添加丁酸梭菌；試驗(yàn)組：基礎(chǔ)飼糧添加丁酸梭菌制劑，濃度為1×105cfu·g-1。

1.3 試驗(yàn)日糧

試驗(yàn)使用玉米-豆粕型基礎(chǔ)日糧，配制方法參照NRC（1998）豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（見(jiàn)表1）。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及其營(yíng)養(yǎng)水平

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在河北省定州市海豐養(yǎng)殖有限公司完成。試驗(yàn)期間豬只封閉飼養(yǎng)，自由采食干粉料，飲水不限，豬舍環(huán)境溫度穩(wěn)定在25～28 ℃。預(yù)試期為3 d，試驗(yàn)期為28 d。試驗(yàn)期內(nèi)每日觀察仔豬的健康狀況，記錄死淘仔豬數(shù)以及腹瀉、用藥情況，其他飼養(yǎng)管理和免疫按照常規(guī)程序進(jìn)行。試驗(yàn)完成時(shí)，2 個(gè)處理的4 個(gè)重復(fù)各分別隨機(jī)選擇1 頭正常的斷奶仔豬實(shí)施屠宰試驗(yàn)，采取所需樣品。剖殺前12 h 禁食，屠宰前用真空促凝管進(jìn)行采血，然后立即使用頸靜脈放血的辦法將其處死，消毒、剖開(kāi)腹腔，立即結(jié)扎噴門瓣、幽門瓣、直腸遠(yuǎn)端，無(wú)菌取十二指腸、空腸、回腸、盲腸等內(nèi)容物，放于液氮速凍后，轉(zhuǎn)放到-80 ℃冰箱中凍存以待分析。取十二指腸、空腸、回腸、盲腸等中段各兩份約5 cm 腸管，用PBS 沖洗，1 份置于液氮速凍，然后轉(zhuǎn)放到-80 ℃冰箱中凍存以待分析，1 份存放至10%中性福爾馬林固定液中，搖勻，待做組織切片。

2 檢測(cè)指標(biāo)和方法

2.1 腸道微生物

在無(wú)菌條件下稱取所采各腸道樣品內(nèi)容物1 g，用9 mL無(wú)菌生理鹽水溶解，并將其充分混勻，并進(jìn)行10倍逐級(jí)梯度稀釋，直至10-7，選擇10-5、10-6及10-73個(gè)稀釋度，吸取稀釋液0.1 mL，接種到培養(yǎng)基上進(jìn)行乳酸桿菌和厭氧菌培養(yǎng)。選取稀釋度為10-2～10-5的不同梯度，吸取稀釋液0.2 mL至相應(yīng)的平板培養(yǎng)基上完成大腸桿菌與好氧菌的計(jì)數(shù)。大腸桿菌計(jì)數(shù)采用麥康凱瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨20.0 g·L-1，乳糖10.0 g·L-1，膽鹽5.0 g·L-1，氯化鈉5.0 g·L-1，中性紅0.075 g·L-1，瓊脂12.0 g·L-1，pH（7.4±0.2）。總好氧菌用腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基：牛腦浸液12.5 g·L-1，牛心浸液5.0 g·L-1，蛋白胨10.0 g·L-1，氯化鈉5.0 g·L-1，葡萄糖2.0 g·L-1，磷酸氫二鈉2.5 g·L-1，瓊脂10.0 g·L-1，pH（7.4±0.2）。乳酸桿菌計(jì)數(shù)采用Rogosa 瓊脂：胰蛋白胨10.0 g·L-1，酵母膏5.0 g·L-1，葡萄糖20.0 g·L-1，吐溫80 1.0 mL·L-1，磷酸二氫鉀6.0 g·L-1，檸檬酸銨2.0 g·L-1，乙酸鈉17.0 g·L-1，硫酸鎂0.575 g·L-1，硫酸錳0.12 g·L-1，硫酸 亞 鐵 0.034 g · L-1， 瓊 脂 20.0 g·L-1，pH（5.4±0.2）?？倕捬蹙?jì)數(shù)采用Wilkinschalgren 厭氧瓊脂：胰蛋白胨10.0 g · L-1，明膠胨10.0 g·L-1，酵母膏5.0 g·L-1，葡萄糖1.0 g·L-1，氯化鈉5.0 g·L-1，精氨酸1.0 g·L-1，丙酮酸鈉1.0 g·L-1，VK30.000 5 g·L-1，氯化血紅素0.005 g·L-1，瓊脂18.0 g·L-1，pH（7.1±0.2）。研究的厭氧菌與乳酸桿菌的瓊脂培養(yǎng)基制成Hungates滾管，使用平板培養(yǎng)好氧菌及大腸桿菌。將全部培養(yǎng)基放于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h后計(jì)數(shù)。所有稀釋度均做2 個(gè)滾管或平板，用30～300 個(gè)菌落的滾管或平板的稀釋度來(lái)計(jì)數(shù)。

2.2 腸道結(jié)構(gòu)

將在10%中性福爾馬林液中固定24 h 后的標(biāo)本取出，按順序進(jìn)行洗滌、脫水、透明、透蠟、包埋后，將其修剪成1 cm×1 cm×1 cm 樣品塊，用萊卡切片機(jī)制成石蠟切片，HE 染色、封片后低倍鏡（5×）下觀測(cè)，選擇代表性視野，用Leica Qwin圖象分析系統(tǒng)對(duì)切片圖像進(jìn)行分析，各個(gè)樣品均觀察3張以上非連續(xù)切片，每張切片觀察15～20 根完整、長(zhǎng)并且直的腸絨毛及相對(duì)應(yīng)的隱窩，測(cè)量后計(jì)算出絨毛高度及隱窩深度的平均值用于試驗(yàn)測(cè)定數(shù)據(jù)。

2.3 血清D-乳酸和二胺氧化酶（DAO）

ELISA法測(cè)定各組仔豬血清中D-乳酸和DAO，ELISA法檢測(cè)按照說(shuō)明書操作。D-乳酸ELISA試劑盒為上海酶聯(lián)生物科技有限公司產(chǎn)品。

2.4 RT-PCR檢測(cè)腸上皮細(xì)胞緊密連接mRNA表達(dá)

設(shè)計(jì)ZO-1、Occludin、Claudin-1 和Gapdh 共4對(duì)引物（均由上海生工合成），利用T165-48多樣品組織研磨機(jī)（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，中國(guó)）對(duì)定量空腸樣品破碎，tacoTMRNA 萃取試劑盒提取RNA，利用All-in-OneTMFirst-cDNA Synthesis 試劑盒和PCR 儀（Eppendorf 384 梯度PCR 儀），將空腸RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用SYBR⑩Premix Ex Taq TM 熒光定量試劑盒和熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems）檢測(cè)ZO-1、Occludin和Claudin-1[7-10]。

用tacoTMRNA 試劑盒提取斷奶仔豬空腸和回腸腸段上皮細(xì)胞中總RNA，利用All-in-OneTMFirstcDNA Synthesis 試劑盒，按照其說(shuō)明書步驟分別將空腸和回腸RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用SYBR⑩Premix Ex TaqTM熒光定量試劑盒，按照其說(shuō)明步驟，以1ulcDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，實(shí)時(shí)定量PCR樣品反應(yīng)體系采用SYBR Green I，其最終反應(yīng)體系為15 μL，每個(gè)基因4 個(gè)平行。反應(yīng)條件為

Hold stage：95 ℃10 min；Cycling stage：95 ℃10 s，61 ℃20 s；72 ℃10 s，40 cycles；Melt curve：72 ℃10 s，95 ℃10 s。每個(gè)樣品均設(shè)置相應(yīng)未經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的模板作為陰性對(duì)照，同時(shí)每個(gè)樣品均設(shè)置相應(yīng)的內(nèi)參作為對(duì)照，得到各自的熒光閾值循環(huán)數(shù)（Ct 值），采用相對(duì)定量法2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。定量PCR引物見(jiàn)表2。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.1.3 的one-way ANOVA、LSD進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。

表2 定量PCR引物

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 飼糧添加丁酸梭菌對(duì)仔豬腸道微生物的影響

當(dāng)飼糧中丁酸菌添加量為0時(shí)，仔豬腸道十二指腸中單好氧菌、乳酸桿菌、大腸桿菌的值分別為4.85、5.78、3.89 cfu·g-1；空腸中單好氧菌、乳酸桿菌、大腸桿菌的值分別為5.01、6.38、3.52 cfu·g-1；回腸中單好氧菌、乳酸桿菌、大腸桿菌的值分別為4.86、6.62、3.92 cfu·g-1；盲腸中單好氧菌、乳酸桿菌、大腸桿菌的值分別為5.34、7.15、4.15 cfu·g-1。當(dāng)飼糧中丁酸菌添加量為1×105cfu·g-1時(shí)，仔豬腸道十二指腸中，單好氧菌、乳酸桿菌、大腸桿菌的值分別為4.72、6.02、3.92 cfu·g-1；空腸中，單好氧菌、乳酸桿菌、大腸桿菌的值分別為5.13、6.74、3.40 cfu·g-1；回腸中，單好氧菌、乳酸桿菌、大腸桿菌的值分別為4.69、6.95、3.67 cfu·g-1；盲腸中，單好氧菌、乳酸桿菌、大腸桿菌的值分別為5.19、7.32、3.96 cfu·g-1。

飼糧添加丁酸梭菌1×105cfu·g-1組與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組的十二指腸、回腸和盲腸的總好氧菌分別降低了2.68%、3.50%和2.81%，但差異均不顯著（P＞0.05），而試驗(yàn)組的空腸總好氧菌提高了2.40%，差異不顯著（P＞0.05）；試驗(yàn)組的十二指腸、空腸、回腸和盲腸的乳酸桿菌分別提高了4.15%、5.64%、4.98%和2.38%，其中十二指腸和盲腸的乳酸桿菌數(shù)量與對(duì)照組相比，差異不顯著（P＞0.05），空腸和回腸的乳酸桿菌數(shù)量與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，十二指腸大腸桿菌的數(shù)量提高0.77%（P＞0.05），空腸、回腸和盲腸的大腸桿菌數(shù)量分別降低3.41%（P＞0.05）、6.38%（P＞0.05）和4.58%（P＞0.05）。

3.2 飼糧添加丁酸梭菌對(duì)仔豬腸道結(jié)構(gòu)的影響

當(dāng)飼糧中丁酸菌添加量為0時(shí)，仔豬腸道十二指腸中絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度∕隱窩深度的值分別為420μm、303μm和1.39；空腸中絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度∕隱窩深度的值分別為325 μm、189 μm、1.72；回腸中絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度∕隱窩深度的值分別為280 μm、168μm、1.67。當(dāng)飼糧中丁酸菌添加量為1×105cfu·g-1時(shí)，仔豬腸道十二指腸中絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度∕隱窩深度的值分別為432μm、288μm和1.50；空腸中絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度∕隱窩深度的值分別為368μm、172μm 和2.14；回腸中絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度∕隱窩深度的值分別為305μm、145μm和2.10。

與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組的十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度分別提高了2.86%、13.23%和8.93%，而十二指腸和回腸的絨毛高度差異不顯著（P＞0.05），空腸的絨毛高度差異顯著（P＜0.05）；試驗(yàn)組的十二指腸、空腸和回腸的隱窩深度分別降低了4.95%、8.99%和13.69%，但差異不顯著（P＞0.05）；試驗(yàn)組十二指腸的絨毛高度∕隱窩深度提高了7.91%，但差異不顯著（P＞0.05），空腸的絨毛高度∕隱窩深度較對(duì)照組提高了24.42%，差異顯著（P＜0.05），回腸的絨毛高度∕隱窩深度較對(duì)照組提高了25.75%，差異顯著（P＜0.05）。

3.3 飼糧添加丁酸梭菌對(duì)仔豬血清D-乳酸和DAO的影響

當(dāng)飼糧中丁酸菌添加量為0 cfu · g-1時(shí)，仔豬血清D-乳酸和DAO 的值分別為235 mmol · L-1和3.48 U·mL-1；當(dāng)飼糧中丁酸菌添加量為1×105cfu·g-1時(shí)，仔豬血清D-乳酸和DAO 的值分別為221 mmol · L-1和3.05 U · mL-1。飼糧添加1×105cfu·g-1的丁酸梭菌，與對(duì)照組相比，D-乳酸降低5.96%，但差異不顯著（P＞0.05），而二胺氧化酶DAO顯著降低12.36%，差異顯著（P＜0.05）。

3.4 飼糧添加丁酸梭菌對(duì)仔豬腸道緊密連接蛋白表達(dá)的影響

當(dāng)飼糧中丁酸菌添加量為0 時(shí)，仔豬空腸中ZO-1、Occludin、Claudin-1 的值都為1.00 cfu ·g-1；當(dāng)飼糧中丁酸菌添加量為1×105cfu·g-1時(shí)，仔豬空腸中ZO-1、Occludin、Claudin-1 的值分別為1.05、1.35、1.12 cfu·g-1。

與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組空腸ZO-1 mRNA 水平的表達(dá)提高5%（P＞0.05），Occludin mRNA 水平的表達(dá)顯著提高35%（P＜0.05），Claudin-1 mRNA 水平的表達(dá)提高了12%，但差異不顯著（P＞0.05）。

4 討 論

與對(duì)照組相比，飼糧添加丁酸梭菌濃度分別為5×104、1×105和5×105cfu·g-1的試驗(yàn)組在28～42 日齡階段和42～56日齡階段對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能影響較顯著；與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組在各日齡階段對(duì)仔豬的腹瀉影響極顯著；與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組有阻礙有害菌繁殖的趨勢(shì)，并且加快有益菌繁殖，增加有益菌數(shù)量；與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組空腸的絨毛高度、空腸的絨毛高度∕隱窩深度和回腸的絨毛高度∕隱窩深度差異顯著；與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組對(duì)仔豬血清D-乳酸的濃度影響不顯著，而對(duì)DAO 的活性顯著提高；與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組可提高仔豬空腸黏膜緊密連接蛋白mRNA水平的表達(dá)。

與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組的十二指腸、回腸和盲腸的總好氧菌數(shù)量均有降低趨勢(shì)，空腸和回腸的乳酸桿菌數(shù)量均顯著提高（P＜0.05），空腸、回腸和盲腸大腸桿菌數(shù)量均有降低趨勢(shì)。本次試驗(yàn)結(jié)果基本上符合前人的研究，當(dāng)然還有一定的誤差，在這次試驗(yàn)中我們沒(méi)有涉及到腸道內(nèi)pH 的測(cè)定，因此讓本次試驗(yàn)的結(jié)果產(chǎn)生誤差。但是在仔豬飼糧中添加丁酸梭菌確實(shí)降低了仔豬腸道內(nèi)的大腸桿菌數(shù)量，增加了乳酸桿菌即益生菌的數(shù)量。

本研究中，飼糧添加丁酸梭菌1×105cfu · g-1后，與對(duì)照組相比，D-乳酸降低5.96%，但差異不顯著（P＞0.05），而二胺氧化酶DAO 顯著降低12.36%（P＜0.05），血清中D-乳酸和DAO 的活性檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)一致。因此飼糧添加丁酸梭菌后，促進(jìn)了腸上皮細(xì)胞的增生，保護(hù)腸黏膜。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組空腸ZO-1和Claudin-1的表達(dá)均有提高趨勢(shì)，且Occludin 的表達(dá)顯著提高（P＜0.05）。因而，具有增強(qiáng)腸道黏膜屏障的功能。

空腸、回腸和盲腸中大腸桿菌的數(shù)量均有下降趨勢(shì)，分別降低3.41%、6.38%和4.58%。與對(duì)照組相比，十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度分別提高了2.86%、13.23%和8.93%，但十二指腸和回腸的絨毛高度與對(duì)照組相比，差異不顯著（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，十二指腸、空腸和回腸的隱窩深度均差異不顯著，分別降低4.95%、8.99%和13.69%?？漳c和回腸的絨毛高度∕隱窩深度顯著提高；與對(duì)照組相比，血清中DAO含量顯著降低，D-乳酸含量降低5.96%。與對(duì)照組相比，空腸緊密連接ZO-1和Claudin-1的表達(dá)分別提高5%和12%，Occludin的表達(dá)顯著提高。

5 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，丁酸梭菌對(duì)條件性致病菌大腸桿菌等病原菌擁有較強(qiáng)的抑制效果，在防治仔豬腹瀉方面療效顯著，并且不會(huì)導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn)。丁酸梭菌制劑作為飼料添加劑不僅活性高、穩(wěn)定性好，并且能夠產(chǎn)生多種益生物質(zhì)（丁酸、淀粉酶、維生素等），在動(dòng)物腸道內(nèi)頡頏或殺滅動(dòng)物病原菌，促進(jìn)腸道中優(yōu)勢(shì)菌群的生長(zhǎng)與繁殖，進(jìn)而維持和調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，同時(shí)提高動(dòng)物的免疫機(jī)能及機(jī)體的抗病力，促進(jìn)動(dòng)物對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)成分的消化吸收和利用，改善動(dòng)物生長(zhǎng)、生產(chǎn)性能和健康狀況，因而它可代替抗生素在畜牧業(yè)中廣泛應(yīng)用。