李小梅 張景濤

摘要：為掌握引進(jìn)芫荽種質(zhì)資源遺傳情況，選用23條引物對(duì)96份芫荽資源進(jìn)行分析，在此基礎(chǔ)上分析其遺傳多樣性與性狀之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明，供試群體的Simpson指數(shù)為0.098～0.505，Shannon指數(shù)為0.085～0.301，種質(zhì)特異指數(shù)為69.964～208.694。53個(gè)RAPD標(biāo)記中有17個(gè)標(biāo)記與15個(gè)性狀相關(guān)聯(lián)。與抽薹天數(shù)（DSE）、始花期（DSF）、終花期（DEF）、收獲天數(shù)（DH）、最長(zhǎng)基生葉長(zhǎng)（LLBL）、花期（FR）、莖中花青素（ANST）、株高（PH）、基生葉數(shù)（NBL）、植株有葉狀態(tài)（LP）、基生葉生長(zhǎng)習(xí)性（HBL）、分枝數(shù)（NB）、果實(shí)形狀（SF）、千粒重（W1000F）和果實(shí)裂果趨勢(shì)（TSF）關(guān)聯(lián)的多態(tài)性位點(diǎn)分別有1、2、2、2、2、3、2、2、2、2、4、2、6、2和2個(gè)。其中，4個(gè)位點(diǎn)同時(shí)與兩個(gè)或2個(gè)以上性狀相關(guān)聯(lián)。

關(guān)鍵詞：芫荽;RAPD標(biāo)記;遺傳多樣性;關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號(hào)：S573+.2 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）21-0107-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.21.022

Abstract： In order to understand the genetic information of the introduced Coriander germplasm resources， 23 random primers were selected for the polymorphism detection of 96 materials， and the relationship between genetic diversity and traits was analyzed. The results showed that the Simpson's index of the population was 0.098～0.505， and the shannon's index was 0.085～0.301， and the specialty index was 69.964～208.694. 17 of the 53 RAPD markers were associated with 15 traits. The numbers of polymorphic markers associated with days with convulsions （DSE）， initial flowering stage （DSF）， flowering stage （DEF）， days of harvest （DH）， longest basal leaf length （LLBL）， flowering stage （FR）， anthocyanins （ANST）， strain High （PH）， basal leaf number （NBL）， plant leafy state （LP）， basal leaf growth habit （HBL）， number of branches （NB）， fruit shape （SF）， 1000-grain weight （W1000F） and fruit cracking Trend （TSF） were 1，2，2，2，2，3，2，2，2，2，4，2，6，2 and 2. Among them， 4 sites are associated with two or more traits at the same time.

Key words： Coriandrum sativum; RAPD makers; genetic diversity; association analysis

芫荽（Coriandrum sativum L.）是世界常用的香料[1]，又名香菜、鹽荽、胡荽，是傘形科草本植物，常作綠葉蔬菜，莖葉有特殊芳香味。由于其生育期短，可四季栽培，以春秋兩季栽培品質(zhì)為好。芫荽具有藥用價(jià)值，根莖葉及種子均可入藥，在中東地區(qū)特別是伊朗，芫荽用于預(yù)防抽搐、失眠、焦慮等癥;在歐洲，其被作為一種治療糖尿病的藥，種子可用于助消化、輔助治療風(fēng)濕病[2-10]。研究表明，芫荽具有抑菌、抗氧化、抗炎及抗糖尿病功效[11]，對(duì)緩解某些食物中毒也有一定的作用[12]。

種質(zhì)資源是遺傳研究和品種改良的基礎(chǔ)[13]，通過對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，可以指導(dǎo)育種，提高育種效率。在分析遺傳多樣性基礎(chǔ)上，挖掘有利基因，對(duì)于后期分子標(biāo)記輔助選擇具有重要意義。關(guān)聯(lián)分析是以連鎖不平衡原理為基礎(chǔ)，鑒定群體內(nèi)目標(biāo)性狀與遺傳標(biāo)記或候選基因關(guān)系的分析方法，已成為基因發(fā)掘研究的主要方法。關(guān)聯(lián)分析無需花費(fèi)較多時(shí)間和精力去構(gòu)建作圖群體，能夠有效分析等位基因?qū)π誀畹呢暙I(xiàn)率[14-16]。已報(bào)道芫荽相關(guān)研究主要集中在種植、成分分離和功能驗(yàn)證方面，相關(guān)功能因子及作用機(jī)制的研究多集中于成分分析，在分子水平上有關(guān)芫荽的研究鮮見報(bào)道。L？仵pez等[17]對(duì)芫荽表型、生化及分子多樣性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，李小梅等[18]對(duì)芫荽進(jìn)行了遺傳多樣性的RAPD分析。RAPD標(biāo)記應(yīng)用于芫荽農(nóng)藝性狀關(guān)聯(lián)分析的研究鮮見報(bào)道。本研究以96份芫荽種質(zhì)資源為材料，對(duì)19個(gè)性狀進(jìn)行測(cè)定與分析[19]，基于自然群體的連鎖不平衡作圖策略，進(jìn)行RAPD分子標(biāo)記與其農(nóng)藝性狀關(guān)聯(lián)分析，旨在為后期芫荽新品種選育及分子標(biāo)記輔助選擇提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? ?供試材料及生物學(xué)性狀測(cè)定

供試96份芫荽種質(zhì)材料為國(guó)外資源庫(kù)引進(jìn)，具體見表1。

所有材料連續(xù)兩個(gè)生長(zhǎng)季種植于哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)。對(duì)生物學(xué)性狀進(jìn)行調(diào)查與測(cè)定[19]，兩個(gè)生長(zhǎng)季各測(cè)1次，測(cè)定及賦值標(biāo)準(zhǔn)[20]見表2。需要計(jì)數(shù)的采用重復(fù)計(jì)數(shù)取平均值。

1.2? ?RAPD標(biāo)記分析

采用改良CTAB法提取DNA。使用Eppendorf 公司PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系（20 μL）為1.0 ng/μL 模板DNA、0.45 mmol/L dNTP、1.3 μmol/L隨機(jī)引物、0.6 U Taq酶、2.0 mmol/L Mg2+。94 ℃預(yù)變性4 min，40個(gè)循環(huán)（94 ℃變性30 s，39 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s）;72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色拍照。從300條隨機(jī)引物中篩選出多態(tài)性高的引物做3次重復(fù)。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

使用Genetics Statistics 3.0（2007SR11872）計(jì)算引物的Simpson多樣性指數(shù)和Shannon多樣性指數(shù)，分析種質(zhì)特異性指數(shù)。

群體結(jié)構(gòu)分析：使用Structure軟件對(duì)96份芫荽種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行基于數(shù)學(xué)模型的類群劃分，并計(jì)算材料相應(yīng)的Q。Q為該品種基因型變異來源于某亞群的概率。

關(guān)聯(lián)分析：利用TASSEL軟件（Edward Buckler，2007）的GLM（General linear model）程序，將各個(gè)體Q作為協(xié)變量，將19個(gè)性狀的表型數(shù)據(jù)分別對(duì)標(biāo)記變異進(jìn)行回歸分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? RAPD標(biāo)記掃描分析

300條引物對(duì)具有代表性的48份芫荽資源進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過復(fù)篩，得到23條擴(kuò)增性強(qiáng)、清晰度高、穩(wěn)定性好的引物，用此23條引物對(duì)96份芫荽種質(zhì)進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，共擴(kuò)增53條帶，其中34條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性比例為64.2%。每個(gè)引物檢測(cè)到的等位基因個(gè)數(shù)分布在2～10，平均為4.61，引物檢測(cè)的等位基因數(shù)越多，引物在資源鑒別中的作用就越大。芫荽基因組PCR擴(kuò)增，不同引物在擴(kuò)增總條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)、條帶亮度等方面均表現(xiàn)出差異。

利用遺傳統(tǒng)計(jì)軟件Genetics Statistics3.0分析引物的多樣性指數(shù)（表3）。引物的Simpson多樣性指數(shù)介于0.098～0.505，平均多樣性指數(shù)為0.344，多樣性指數(shù)大于平均指數(shù)的引物有14條;引物的Shannon多樣性指數(shù)介于0.085～0.301，平均多樣性指數(shù)為0.221，多樣性指數(shù)大于平均指數(shù)的引物與Simpson多樣性指數(shù)中一致。等位基因數(shù)與多樣性指數(shù)這兩類大于平均數(shù)的指數(shù)中，共同出現(xiàn)的引物有4對(duì)，說明在一定情況下，引物檢測(cè)到的等位基因數(shù)越多，其多樣性指數(shù)越高，表明區(qū)分品種的能力越強(qiáng)。

用資源遺傳統(tǒng)計(jì)軟件Genetics Statistics 3.0分析得到種質(zhì)的特異性指數(shù)（表4），可以看出，種質(zhì)特異指數(shù)介于69.964～208.694，平均為104.29。84號(hào)種質(zhì)的特異指數(shù)最高，77號(hào)種質(zhì)特異指數(shù)最低。其中，大于平均特異性指數(shù)的種質(zhì)編號(hào)有5、6、9、11、13、14、15、17、18、19、21、22、24、30、32、33、36、37、38、

44、45、52、54、60、64、65、67、68、71、76、79、81、83、84、

86、89、92。種質(zhì)特異指數(shù)越高，表示該種質(zhì)在檢測(cè)位點(diǎn)中含有特異等位基因數(shù)目越多，這可為種質(zhì)資源鑒定提供參考。

2.2? 群體結(jié)構(gòu)分析

群體結(jié)構(gòu)指一個(gè)群體內(nèi)亞群存在的情況。亞群的混合使整個(gè)群體的LD強(qiáng)度增強(qiáng)，導(dǎo)致虛假基因的多態(tài)性位點(diǎn)與性狀之間的相關(guān)性，從而提供假陽性結(jié)果。關(guān)聯(lián)分析前對(duì)群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和調(diào)節(jié)是必要的。通過Structure軟件對(duì)該群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行基于數(shù)學(xué)模型的類群劃分，計(jì)算材料相應(yīng)的Q分析，先設(shè)定群體數(shù)目（K）為4～15，并假定位點(diǎn)都是獨(dú)立的，進(jìn)行10次隨機(jī)抽樣分析，以獲得穩(wěn)定可靠的結(jié)果，然后依據(jù)分析選取一個(gè)合適的K。經(jīng)分析確定當(dāng)K=14時(shí)得到最穩(wěn)定、最可信的分類，即判斷該資源群體可以分為14個(gè)亞群。

2.3? 與性狀相關(guān)聯(lián)RAPD分析

群體結(jié)構(gòu)是造成關(guān)聯(lián)分析假陽性結(jié)果的主要原因，Buckler 等利用隨機(jī)標(biāo)記估算的各個(gè)個(gè)體相應(yīng)的Q作為協(xié)變量，對(duì)性狀的表型變異與標(biāo)記變異進(jìn)行回歸分析，消除參試材料的群體結(jié)構(gòu)引起的偽關(guān)聯(lián)，從而找到與性狀QTL真正相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記及其等位變異。利用TASSEL軟件的GLM（General Linear Model）程序，以各個(gè)體Q作為協(xié)變量進(jìn)行群體矯正，將19個(gè)性狀的表型數(shù)據(jù)分別對(duì)標(biāo)記變異進(jìn)行回歸分析，以此尋找影響芫荽性狀變異的主要變異位點(diǎn)（閾值選擇P<0.05為顯著，P<0.01為極顯著）。結(jié)果見表5。

分析表明，53個(gè)RAPD標(biāo)記中有17個(gè)標(biāo)記與19個(gè)性狀中的15個(gè)性狀相關(guān)聯(lián)?？v向分析表5發(fā)現(xiàn)，與抽薹天數(shù)（DSE）相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有1個(gè)（S31-750），該標(biāo)記對(duì)此性狀的解釋率為0.042;與始花期（DSF）相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有2個(gè)（S31-1500、S31-750），2個(gè)標(biāo)記對(duì)該性狀的解釋率均為0.050;與終花期（DEF）相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有2個(gè)（S31-1500、S31-750），2個(gè)標(biāo)記對(duì)該性狀的解釋率均為0.050;與花期（FR）相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有3個(gè)（S183-2200、S183-1700、S2003-1500），對(duì)該性狀的解釋率分別為0.065、0.065、0.055;與收獲天數(shù)（DH）相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有2個(gè)（S31-1500、S31-750），對(duì)該性狀的解釋率均為0.049;與莖中花青素（ANST）相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有2個(gè)（S507-1800、S507-1500），對(duì)該性狀解釋率均為0.064;與基生葉數(shù)（NBL）相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有2個(gè)（S167-1500、S167-1100），對(duì)該性狀的解釋率均為0.048;與最長(zhǎng)基生葉長(zhǎng)（LLBL）相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有2個(gè)（S31-1500、S31-750），對(duì)該性狀的解釋率均為0.056;與基生葉生長(zhǎng)習(xí)性（HBL）相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有4個(gè)（S24-1800、S24-1600、S1260-1300、S2003

-1900），對(duì)該性狀的解釋率分別為0.084、0.084、0.074、0.074;與株高（PH）相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有2個(gè)（S507-1800、S507-1500），對(duì)該性狀解釋率均為0.067;與植株生葉狀態(tài)（LP）相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有2個(gè)（S167-1500、S167-1100），對(duì)該性狀的解釋率均為0.069;與分枝數(shù)（NB）相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有2個(gè)（S1-2200、S1-700），對(duì)該性狀的解釋率均為0.053、;與果實(shí)形狀（SF）相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有6個(gè)（S31-1500、S31-750、S1260-1300、S2003-1900、S2029-1000、S2029-700），對(duì)該性狀的解釋率分別為0.078、0.078、0.093、0.093、0.085、0.085;與千粒重（W1000F）相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有2個(gè)（S1260-1300、S2003-1900），對(duì)該性狀的解釋率均為0.104;與果實(shí)裂果趨勢(shì)（TSF）相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有2個(gè)（S1260-1300、S2003-1900）對(duì)該性狀的解釋率均為0.096。

橫向分析（表5）可以發(fā)現(xiàn)，同一標(biāo)記與多個(gè)性狀相關(guān)聯(lián)的情況在分析中出現(xiàn)，如S31-1500標(biāo)記與5個(gè)性狀有關(guān)聯(lián)（始花期、終花期、收獲天數(shù)、最長(zhǎng)基生葉長(zhǎng)、果實(shí)形狀）;S31-750標(biāo)記與6個(gè)性狀關(guān)聯(lián)（抽薹天數(shù)、始花期、終花期、收獲天數(shù)、最長(zhǎng)基生葉長(zhǎng)、果實(shí)形狀）;S167-1500與S167-1100標(biāo)記均與2個(gè)性狀關(guān)聯(lián)（基生葉數(shù)、植株生葉狀態(tài)）;S507-1800與S507-1500標(biāo)記均與（莖中花青素、株高）有關(guān)聯(lián);S1260-1300標(biāo)記與4個(gè)性狀關(guān)聯(lián)（基生葉生長(zhǎng)習(xí)性、果實(shí)形狀、千粒重、果實(shí)裂果趨勢(shì)）;S2003-1900標(biāo)記同樣與基生葉生長(zhǎng)習(xí)性、果實(shí)形狀、千粒重、果實(shí)裂果趨勢(shì)4個(gè)性狀關(guān)聯(lián)。

其中，S167-1100與植株生葉狀態(tài)（LP）的關(guān)聯(lián)，S1260-1300、S2003-1900與果實(shí)裂果趨勢(shì)（TSF）的關(guān)聯(lián)，S1260-1300、S2003-1900與千粒重（W1000F）的關(guān)聯(lián)，S1260-1300、S2003-1900、S2029-1000與果實(shí)形狀（SF）的關(guān)聯(lián)，S24-1800與基生葉生長(zhǎng)習(xí)性（HBL）的關(guān)聯(lián)是極顯著水平的關(guān)聯(lián)。

從表5還可看出，多數(shù)同一引物的兩個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)與某一性狀關(guān)聯(lián)，其表型變異解釋率相同，如S31-1500、S31-750標(biāo)記與始花期相關(guān)聯(lián)，解釋率均為0.050;S507-1800、S507-1500與莖中花青素解釋率均為0.064。

利用關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，可根據(jù)育種目標(biāo)要求進(jìn)行育種設(shè)計(jì)，將不同標(biāo)記位點(diǎn)上的優(yōu)良等位變異聚合于一體，改良單性狀或綜合性狀。

3? 小結(jié)與討論

群體結(jié)構(gòu)的不均一性影響多態(tài)性位點(diǎn)的連鎖不平衡狀態(tài)，進(jìn)而影響關(guān)聯(lián)分析的準(zhǔn)確性。本研究通過多位點(diǎn)基因型數(shù)據(jù)的聚類來分析群體結(jié)構(gòu)，計(jì)算每一芫荽種質(zhì)歸入各亞群的概率（Q），并以每一芫荽種質(zhì)的Q作為協(xié)變量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，矯正亞群混合造成的偽關(guān)聯(lián)。在資料處理過程中，對(duì)不包括Q協(xié)變量與包括Q協(xié)變量的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)增加Q協(xié)變量后檢出的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)明顯少于不包括Q協(xié)變量所檢出的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，且在關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的表型變異解釋上二者也有明顯的區(qū)別。由此可見，將Q作為協(xié)變量納入計(jì)算，在一定程度上規(guī)避了亞群混合造成的偽關(guān)聯(lián)。

種質(zhì)資源是育種的基礎(chǔ)，遺傳基礎(chǔ)狹窄是制約優(yōu)良品種選育的主要因素之一。因此分析資源的遺傳多樣性，比較相互間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，對(duì)于育種工作的開展具有重要的指導(dǎo)意義。形態(tài)學(xué)分析與分子標(biāo)記分析表明本研究收集的資源遺傳多樣性較好。

形態(tài)學(xué)與分子標(biāo)記聚類結(jié)果均表現(xiàn)出分類與來源地不具有一定的相關(guān)性，說明資源間親緣關(guān)系與來源地之間關(guān)系不密切，可能與種質(zhì)的交換和廣泛的遺傳變異有關(guān)。形態(tài)學(xué)標(biāo)記是對(duì)各植物學(xué)和生物學(xué)性狀進(jìn)行鑒定并分類，揭示的是芫荽的外部表現(xiàn)，而分子標(biāo)記揭示的是芫荽堿基序列上的差異，從遺傳物質(zhì)上揭示芫荽的遺傳多樣性。關(guān)聯(lián)分析也稱關(guān)聯(lián)作圖，已應(yīng)用到許多植物上，如擬南芥、小麥、玉米、大麥、大豆等[21]。本研究利用TASSEL軟件對(duì)調(diào)查的表型性狀和分子標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，分析發(fā)現(xiàn)19個(gè)性狀中有15個(gè)性狀與標(biāo)記相關(guān)，與15個(gè)性狀相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有17個(gè)。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，存在同一個(gè)性狀與多個(gè)位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，也存在同一標(biāo)記與多個(gè)性狀相關(guān)聯(lián)。RAPD標(biāo)記重復(fù)性差，試驗(yàn)標(biāo)記數(shù)量有限，在連續(xù)兩年的重復(fù)試驗(yàn)中得到的標(biāo)記較少。本研究初步分析了芫荽群體基因組狀況及其與性狀的關(guān)聯(lián)，在此基礎(chǔ)上將作擴(kuò)展與深入研究。

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