王艷麗 祁少可 張超楠 李樂瑤 李超杰 郭文文 劉新新 郝戈芳 李鵬威 孫小瑞

河南省人口和計劃生育科學技術研究院，國家衛(wèi)生健康委出生缺陷預防重點實驗室，河南省人口缺陷干預技術研究重點實驗室(鄭州 ，450002)

串聯(lián)質(zhì)譜技術已廣泛應用于新生兒遺傳代謝病篩查。目前，實驗室對篩查指標的評估主要依賴于豐華公司提供的參考范圍，但各地區(qū)人群存在遺傳背景差異，導致閾值各不相同。本研究對河南省22 811例新生兒血斑標本進行11種氨基酸檢測，建立本省新生兒氨基酸的正常參考區(qū)間。

1 材料與方法

1.1 標本

收集2017年1月—2018年10月河南省各地區(qū)送本實驗室篩查的新生兒干血斑標本，按照《新生兒遺傳代謝病篩查》[1]的規(guī)定剔除未滲透，血斑面積不夠及采血時間不足等標本，共計對22 811例標本進行篩查。

1.2 主要試劑和儀器

串聯(lián)質(zhì)譜儀(API 3200MD)， 恒溫孵育振蕩器(PerkinElmer)，數(shù)控超聲波清洗器(KQ3200DE型)，多種氨基酸、肉堿測定試劑盒(廣州豐華醫(yī)療器械有限公司)。

1.3 方法

按照非衍生化多種氨基酸、肉堿測定試劑盒(廣州豐華)說明書進行操作。使用打孔器對送檢的血斑打孔，直徑3mm，將血斑依次放入潔凈的U型微孔板中。每孔加入含氨基酸內(nèi)標的萃取液100 μl，使用粘性封板膜覆蓋微孔板。30℃，650～750 rpm速度震蕩(45±10)min。孵育完成后，每孔吸取75 μl內(nèi)容物至V型底耐熱微孔板對應孔中，使用鋁箔封套覆蓋微孔板，啟動應用軟件測量。

1.4 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 篩查情況

在22811例接受遺傳代謝病篩查的新生兒中，電話召回復查696例(3.05%)，陽性27人(0.12%)，確診6人，死亡1人，篩查病種發(fā)病率為0.26‰。其中甲基丙二酸血癥(MMA)3例，發(fā)病率為0.13‰；苯丙酮尿癥(PKU)3例，發(fā)病率為0.13‰[2]。

2.2 11種氨基酸參考范圍

剔除6例確診陽性的患者，對22 805例標本進行分析。 對11項氨基酸檢測結果正態(tài)分布檢驗均不符合正態(tài)分布 ，取P0.5～P99.5的值作為參考區(qū)間，從而得出河南省新生兒干血斑中11項氨基酸檢測正常參考值，見表1。

2.3 與其他地區(qū)及試劑盒參考范圍比較

隨著新生兒遺傳代謝病篩查的普及，許多地區(qū)都已經(jīng)建立了各自的正常值參考區(qū)間[9-12]，具體對比見表1。

表1 河南及其他省新生兒干血斑11種氨基酸檢測正常值參考區(qū)間(μmol/L)

3 討論

遺傳代謝病種類繁多，臨床表現(xiàn)復雜多樣，輕重不等，任何器官和系統(tǒng)均可受累，如代謝性酸中毒、毛發(fā)異常、急性腦病等[3]。因遺傳代謝病臨床癥狀缺乏特異性，目前臨床也尚無常規(guī)生化檢驗指標，因此對新生兒遺傳代謝病的診斷治療存在較大難度。串聯(lián)質(zhì)譜技術1990年在美國首次用于新生兒遺傳代謝病篩查，2003年上海市率先應用該技術對遺傳代謝病進行篩查[4]。目前由于該項技術對各項要求較高(標本、技術，儀器、實驗操作、試劑等)，并且國內(nèi)尚未有統(tǒng)一的操作規(guī)范和參考區(qū)間，且各地區(qū)人群存在遺傳背景的差異，從而導致閾值各不相同，所以各地區(qū)實驗室應該根據(jù)自己的實際情況建立適合當?shù)厝巳旱膮⒖紖^(qū)間。

本研究對河南省22 811例新生兒干血斑進行遺傳代謝病篩查，其中PKU發(fā)病率(0.13‰)與之前報道的河南省發(fā)病率接近[5]；MMA發(fā)病率(0.13‰)也與之前報道的河南省的發(fā)病率比較接近[6]。

本研究在確定參考區(qū)間前，根據(jù)美國CLSI文件推薦的C28-A2要求[7]，對檢測儀器進行性能評價，評價的關鍵指標為不準確度和不精密度。氨基酸低值質(zhì)控C1各項指標對應的批內(nèi)精確度ALA 4%、ARG 4%,CIT 5%、GLY 9%、LEU 5%、MET 5%、PHE 5%、PRO 4%、TYR 5%、VAL 5%)。氨基酸高值質(zhì)控C2各項指標對應的批內(nèi)精確度(ALA 4%、ARG 4%、CIT 4%、GLY 6%、LEU 4%、MET 4%、PHE 4%、PRO 4%、TYR 4%、VAL 4%)。本研究的檢測系統(tǒng)經(jīng)過驗證，檢測結果可靠。本研究對河南省22 805例新生兒干血斑中11種氨基酸進行分析，建立了該地區(qū)的正常值參考區(qū)間。對比豐華醫(yī)療器械有限公司提供的參考區(qū)間，PHE的切值差異較大，從116μmol /L降到了98.6μmol /L。這就意味著在對河南地區(qū)新生兒中進行高苯丙氨酸血癥初篩判讀時[8]，使用豐華公司提供的參考區(qū)間將會出現(xiàn)假陰性結果，需要引起足夠重視。

隨著串聯(lián)質(zhì)譜技術的推廣，許多地區(qū)都已經(jīng)建立了各自的正常值參考區(qū)間[9-12]，本文對河南省、陜西省和甘肅省的參考值范圍，比較發(fā)現(xiàn)，這3個省干血斑中氨基酸含量的檢測區(qū)間各不相同。首先選擇正常參考區(qū)間的百分位數(shù)是造成差異的重要原因，如甘肅省的參考區(qū)間為P2.5～P97.5[10]，而本實驗室的參考區(qū)間為P0.5～P99.5。目前《新生兒遺傳代謝病篩查》建議百分位數(shù)的區(qū)間為(P0.5～P99.5)，統(tǒng)一的標準將更加方便室間的比較。其次篩查人群及居住地域差異等會導致各地區(qū)的發(fā)病率也各不相同，如PKU在北方地區(qū)發(fā)病率明顯高于南方，這些因素也會導致參考區(qū)間的明顯不同。此外，濕度、溫度等氣候變化也有可能引起檢測結果的差異。因此每個實驗室都應建立自己的參考區(qū)間。

本研究按照教材建議的參考區(qū)間，通過對22 805例新生兒串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，建立了本地的正常值參考范圍，有利于降低假陽性和假陰性率，提高陽性預測值，以期更好地輔助臨床。