閆 峻，王志龍，徐 靜，馮 碩

（核工業(yè)北京地質(zhì)研究院, 北京 100029）

近年來(lái), 隨著工業(yè)生產(chǎn)的不斷發(fā)展, 大量的工業(yè)、 生活垃圾以及排放進(jìn)入海洋的污染物質(zhì), 或以離子狀態(tài)存在, 或以顆粒和膠狀狀態(tài)存在。 以后兩種狀態(tài)存在的物質(zhì)可能在較近的海區(qū)聚膠和下沉下來(lái), 而以離子狀態(tài)存在的污染物質(zhì)可能隨水體運(yùn)動(dòng)而擴(kuò)散到很遠(yuǎn)的地方。 因此在海洋污染監(jiān)測(cè)的過(guò)程中,對(duì)于污染物的流向是環(huán)境監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)和難點(diǎn)[1-3]。 羅丹明B, 又稱玫瑰紅B, 是一種堿性玫瑰紅色的熒光染料, 具有價(jià)格低廉、 色澤紅艷、 穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn), 很容易溶于水和醇, 在海洋水中擴(kuò)散后可以直接觀察和追蹤擴(kuò)散徑跡, 從而達(dá)到研究污染物運(yùn)動(dòng)規(guī)律的目的[4-5]。 因此用羅丹明B 作為示蹤劑可以很好地代表離子狀態(tài)污染物質(zhì)的運(yùn)動(dòng)規(guī)律。

目前, 對(duì)羅丹明B 的檢測(cè)方法主要有高效液相色 譜 法[6]、 液相色譜與質(zhì) 譜聯(lián)用 法[7]、超高效液相色譜與熒光聯(lián)用法[8]和電化學(xué)法[9]等。 但是這些方法樣品制備較為復(fù)雜, 而且儀器設(shè)備無(wú)法應(yīng)用于野外監(jiān)測(cè)。 而熒光分光光度法和分光光度法儀器設(shè)備經(jīng)濟(jì)、 便攜, 樣品前處理流程簡(jiǎn)單, 可以滿足野外檢測(cè)的各種要求, 是海洋污染監(jiān)測(cè)過(guò)程中切實(shí)可行的方法。

本研究采用熒光分光光度法和分光光度法, 以羅丹明B 為研究對(duì)象, 建立了以羅丹明B 為海洋示蹤劑的快速分析方法, 以期為海洋污染物監(jiān)測(cè)提供快捷、 準(zhǔn)確的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

F97XP 熒光分光光度計(jì), 上海棱光技術(shù)有限公司； 721G 分光光度計(jì), 上海第三分析儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

羅丹明B、 乙酸鈉、 碳酸鈉, 阿拉丁試劑（上海） 有限公司； 鄰苯二甲酸氫鉀、 混合磷酸鹽、 硼砂標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液, 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院； 海洋水由交通運(yùn)輸部天津水運(yùn)工程科學(xué)研究院提供； 地?zé)崴杀本┦械刭|(zhì)工程勘察院提供； 地下水由中國(guó)地質(zhì)科學(xué)院國(guó)家地質(zhì)實(shí)驗(yàn)測(cè)試中心提供； 純水為實(shí)驗(yàn)室自制去離子水, 符合GB/T 6682-2008 的要求。

2 熒光分光光度法

2.1 羅丹明B 最大吸收波長(zhǎng)

應(yīng)用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量時(shí), 被測(cè)樣品的最大吸光度值是測(cè)量的重要指標(biāo)。 采用F97XP 熒光分光光度計(jì), 在負(fù)高壓為500 V的條件下, 分別對(duì)1.0 g/L 的羅丹明B 溶液在激發(fā)波長(zhǎng)300～900 nm, 發(fā)射波長(zhǎng)為300～900 nm 的范圍內(nèi)進(jìn)行三維掃描, 獲得羅丹明B 波長(zhǎng)掃描等高圖（圖1）。

由圖1 可見(jiàn), 羅丹明B 的最大熒光值處的激發(fā)波長(zhǎng)為553 nm、 發(fā)射波長(zhǎng)為578 nm。因此, 選擇激發(fā)波長(zhǎng)為553 nm、 發(fā)射波長(zhǎng)為578 nm 作為羅丹明B 的測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2 溶液pH 對(duì)羅丹明B 吸光度的影響

由于地下水、 海洋水和自來(lái)水等的pH 值存在一定的差異, 因此本試驗(yàn)分別用一定體積的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液、 磷酸鹽緩沖溶液、 硼酸鈉緩沖溶液、 1 mol·L-1乙酸鈉溶液和1 mol·L-1碳酸鈉溶液作為酸度調(diào)節(jié)劑,對(duì)0.4 mg·L-1的羅丹明B 溶液的pH 值進(jìn)行調(diào)節(jié), 并在熒光最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定羅丹明B溶液的熒光吸光度值, 結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 羅丹明B 熒光波長(zhǎng)掃描等高圖Fig. 1 The scanning contour map of rhodamine B fluorescence wavelength

由表1 可見(jiàn), 羅丹明B 在酸性和堿性的條件下, 熒光吸光度值均比較穩(wěn)定, 無(wú)論是加入不同體積的相同緩沖溶液, 還是加入相同體積的不同緩沖溶液, 熒光吸光度值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在2%以下。 因此在測(cè)量過(guò)程中,無(wú)需添加額外的酸度調(diào)節(jié)劑。

2.3 不同基體對(duì)羅丹明B 含量測(cè)定的影響

取5 支25 mL 的比色管, 分別加入1.00 mL濃度為10 mg·L-1的羅丹明B 溶液, 并分別以去離子水、 自來(lái)水、 海水、 地?zé)崴偷叵滤ㄈ葜量潭? 在熒光最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定羅丹明B 溶液的熒光吸光度值, 結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 不同pH 值條件下羅丹明B 的熒光吸光度值Table 1 Fluorescence absorption value of rhodamine B at different pH value

表2 不同基體水樣對(duì)羅丹明B 熒光吸光度的影響Table 2 Effect of different matrix water samples on fluorescence absorption of rhodamine B

由表2 可見(jiàn), 不同基體水樣對(duì)羅丹明B溶液的熒光吸光度值的的影響較小, 說(shuō)明羅丹明B 可作為該基體水樣的示蹤劑從事科學(xué)研究工作。

2.4 羅丹明B 線性關(guān)系研究

在實(shí)際的測(cè)量中, 由于加入羅丹明B 示蹤劑后, 不同的監(jiān)測(cè)時(shí)間和不同的監(jiān)測(cè)地點(diǎn)的羅丹明B 示蹤劑的濃度差異較大, 最低濃度和最高濃度往往相差100 倍以上。 因此,本研究在4 μg·L-1～800 μg·L-1的濃度范圍內(nèi), 分別做了低濃度和高濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線,具體方法如下。

2.4.1 低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.10、 0.20、0.30、 0.40、 0.50 mL 1.00 mg·L-1的羅丹明B于25 mL 比色管中, 加純水定容至刻度, 搖勻。 用1 cm 比色皿, 在激發(fā)波長(zhǎng)為553 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為578 nm, 負(fù)高壓為500 V 的條件下分別測(cè)定熒光吸光度值, 以溶液中羅丹明B的質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo), 熒光吸光度值為縱坐標(biāo)做線性回歸方程。 結(jié)果見(jiàn)圖2。

由 圖2 可 見(jiàn), 羅 丹 明B 在4 μg·L-1～20 μg·L-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好, 線性回歸方程為y＝147.38x＋6.22, 相關(guān)系數(shù)r＝0.998 9,該線性回歸方程適用于較低濃度的羅丹明B示蹤劑的測(cè)量。

2.4.2 中濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

分 別 準(zhǔn) 確 移 取1.00、 2.00、 3.00、 4.00、5.00 mL 1.00 mg·L-1的羅丹明B 標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL 比色管中, 加純水定容至刻度, 搖勻。用1 cm 比色皿, 在激發(fā)波長(zhǎng)為553 nm、 發(fā)射波長(zhǎng)為578 nm, 負(fù)高壓為500 V 的條件下分別測(cè)定熒光吸光度值, 以溶液中羅丹明B 的質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo), 熒光吸光度值為縱坐標(biāo)做線性回歸方程。 結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 低濃度羅丹明B 的線性回歸方程Fig. 2 The regression curve of low concentration rhodamine B

圖3 高濃度羅丹明B 的線性回歸方程Fig. 3 The regression curve of high concentration rhodamine B

由圖3 可見(jiàn), 羅丹明B 在40 μg·L-1～200 μg·L-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好, 線性回歸方程為y＝132.57x＋18.19, 相關(guān)系數(shù)r＝0.999 4,該線性回歸方程適用于中等濃度的羅丹明B示蹤劑的測(cè)量。

2.4.3 高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

分 別 準(zhǔn) 確 移 取1.00、 2.00、 3.00、 4.00、5.00、 10.00、 20.00 mL 1.00 mg·L-1的羅丹明B 標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL 比色管中, 加純水定容至刻度, 搖勻。 用1 cm 比色皿, 在激發(fā)波長(zhǎng)為553 nm、 發(fā)射波長(zhǎng)為578 nm, 負(fù)高壓為500 V的條件下分別測(cè)定熒光吸光度值, 以溶液中羅丹明B 的質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo), 熒光吸光度值為縱坐標(biāo)做線性回歸方程。 結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 中濃度羅丹明B 的線性回歸方程Fig. 4 The regression curve of medium concentration rhodamine B

由圖4 可見(jiàn), 羅丹明B 在40 μg·L-1～800 μg·L-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好, 線性回歸方程為y＝109.59x＋93.12, 相關(guān)系數(shù)r＝0.997 9,該線性回歸方程適用于高濃度的羅丹明B 示蹤劑的測(cè)量。 對(duì)于更高濃度樣品, 可將樣品稀釋后進(jìn)行測(cè)量。

2.5 羅丹明B 的正確度和檢出限

配制含羅丹明B 濃度分別為0.004、0.006、 0.008、 0.010 和0.020 mg·L-1的海水樣品, 用1 cm 比色皿, 在激發(fā)波長(zhǎng)為553 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為578 nm, 負(fù)高壓為500 V 的條件下分別測(cè)定熒光吸光度值, 并計(jì)算樣品中羅丹明B 的含量, 結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 羅丹明B 測(cè)量正確度結(jié)果Table 3 Correctness result of rhodamine B measurement

由表3 可見(jiàn), 羅丹明B 的含量在0.004 mg·L-1～0.020 mg·L-1的范圍內(nèi)正確度良好。將0.004 μg·L-1的 羅 丹 明B 溶 液 繼 續(xù) 稀 釋,熒光吸光度值的平行性較差, 無(wú)法計(jì)算溶液中羅丹明B 的含量, 因此熒光分光光度法測(cè)定海水中羅丹明B 的含量的檢出限為0.004 mg·L-1。

2.6 羅丹明B 的加標(biāo)回收率

配制含羅丹明B 濃度分別為0.005 和0.050 mg·L-1的海水樣品, 并加入一定量的羅丹明B, 用1 cm 比色皿, 在激發(fā)波長(zhǎng)為553 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為578 nm, 負(fù)高壓為500 V 的條件下分別測(cè)定熒光吸光度值, 并計(jì)算加標(biāo)前后樣品中羅丹明B 的含量, 結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4 可知, 用該方法測(cè)量海水中羅丹明B 的回收率在98.7%～106%之間, 加標(biāo)回收率良好。

3 分光光度法

3.1 羅丹明B 最大吸收波長(zhǎng)

應(yīng)用分光光度法進(jìn)行測(cè)量時(shí), 被測(cè)樣品的最大吸光度值是測(cè)量的重要指標(biāo)。 采用721G 型分光光度計(jì), 以去離子水為參比, 采用3 cm 比色皿對(duì)1.0 g·L-1的羅丹明B 溶液在480～580 nm 的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描, 記錄吸光度值, 結(jié)果見(jiàn)圖5。

表4 羅丹明B 加標(biāo)回收率測(cè)量結(jié)果Table 4 Result of recovery rate of rhodamine B

圖5 羅丹明B 在可見(jiàn)光區(qū)的吸收曲線Fig. 5 Absorption curve of rhodamine B in visible wavelength

由圖5 可見(jiàn), 羅丹明B 的最大吸收波長(zhǎng)為550 nm, 因此選擇550 nm 作為羅丹明B 的測(cè)定波長(zhǎng)。

3.2 溶液pH 對(duì)羅丹明B 吸光度的影響

由于地下水、 海洋水、 自來(lái)水等的pH 值存在一定的差異, 因此本試驗(yàn)分別用一定體積的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液（pH＝4.00）、 磷酸鹽緩沖溶液（pH＝6.86）、 硼酸鈉緩沖溶液（pH＝9.18）、 1 mol·L-1乙酸鈉溶液和1 mol·L-1碳酸鈉溶液作為酸度調(diào)節(jié)劑, 對(duì)0.4 mg·L-1的羅丹明B 溶液的pH 值進(jìn)行調(diào)節(jié), 并在550 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定羅丹明B 溶液的吸光度值, 結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5 可見(jiàn), 羅丹明B 在酸性和堿性的條件下, 吸光度值均比較穩(wěn)定, 無(wú)論是加入不同體積的相同緩沖溶液, 還是加入相同體積的不同緩沖溶液, 熒光吸光度值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在2.4% 以下。 因此在測(cè)量過(guò)程中, 無(wú)需添加額外的酸度調(diào)節(jié)劑。

3.3 不同基體對(duì)羅丹明B 含量測(cè)定的影響

取5 支25 mL 的比色管, 分別加入1.00 mL濃度為10 mg·L-1的羅丹明B 溶液, 并分別以去離子水、 自來(lái)水、 海水、 地?zé)崴偷叵滤ㄈ葜量潭? 在550 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定羅丹明B溶液的吸光度值, 結(jié)果見(jiàn)表6。

由表6 可見(jiàn), 不同基體水樣對(duì)羅丹明B溶液的吸光度值的的影響較小, 說(shuō)明羅丹明B可作為該基體水樣的示蹤劑從事科學(xué)研究工作。

3.4 羅丹明B 線性關(guān)系

在實(shí)際的測(cè)量中, 由于加入羅丹明B 示蹤劑后, 不同的監(jiān)測(cè)時(shí)間和不同的監(jiān)測(cè)地點(diǎn)的羅丹明B 示蹤劑的濃度差異較大, 最低濃度和最高濃度往往相差100 倍以上。 因此,本研究在4 μg·L-1～800 μg·L-1的濃度范圍內(nèi), 分別做了低濃度和高濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線,具體方法如下:

3.4.1 低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別準(zhǔn)確移取0.10、 0.20、 0.30、 0.40 和0.50 mL 1.00 mg·L-1的羅丹明B 標(biāo)準(zhǔn)溶 液于25 mL 比色管中, 加純水定容至刻度, 搖勻。用10 cm 比色皿, 以純水為參比, 在550 nm波長(zhǎng)下分別測(cè)定吸光度值, 以溶液中羅丹明B的質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo), 吸光度值為縱坐標(biāo)做線性回歸方程。 結(jié)果見(jiàn)圖6。

表5 不同pH 值條件下羅丹明B 的吸光度值Table 5 Absorption value of rhodamine B at different pH value

表6 不同基體水樣對(duì)羅丹明B 吸光度的影響Table 6 Effect of different matrix water samples on absorption of rhodamine B

圖6 低濃度羅丹明B 的線性回歸方程Fig. 6 The regression curve of low concentration rhodamine B

由圖6 可見(jiàn), 羅丹明B 在4 μg·L-1～20 μg·L-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好, 線性回歸方程為y＝0.080 1x＋0.005 1, 相關(guān)系數(shù)r＝0.999 7,該線性回歸方程適用于較低濃度的羅丹明B示蹤劑的測(cè)量。

3.4.2 中濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別準(zhǔn)確移取1.00、 2.00、 3.00、 4.00 和5.00 mL 1.00 mg·L-1的羅丹明B 標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL 比色管中, 加純水定容至刻度, 搖勻。用1 cm 比色皿, 以純水為參比, 在550 nm波長(zhǎng)下分別測(cè)定吸光度值, 以溶液中羅丹明B的質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo), 吸光度值為縱坐標(biāo)做線性回歸方程, 結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 中濃度羅丹明B 的線性回歸方程Fig. 7 The regression curve of medium concentration rhodamine B

由圖7 可見(jiàn), 羅丹明B 在40 μg·L-1～200 μg·L-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好, 線性回歸方程為y＝0.024 0x＋0.018 5, 相關(guān)系數(shù)r＝0.999 7,該線性回歸方程適用于中濃度的羅丹明B 示蹤劑的測(cè)量。

3.4.3 高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

分 別 準(zhǔn) 確 移 取1.00、 2.00、 3.00、 4.00、5.00、 10.00 和20.00 mL 1.00 mg·L-1的羅丹明B 標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL 比色管中, 加純水定容至刻度, 搖勻。 用1 cm 比色皿, 以純水為參比, 在550 nm 波長(zhǎng)下分別測(cè)定吸光度值, 以溶液中羅丹明B 的質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo), 吸光度值為縱坐標(biāo)做線性回歸方程, 結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 高濃度羅丹明B 的線性回歸方程Fig. 8 The regression curve of high concentration rhodamine B

由圖8 可見(jiàn), 羅丹明B 在40 μg·L-1～800 μg·L-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好, 線性回歸方程為y＝0.007 8x＋0.023 6, 相關(guān)系數(shù)r＝0.999 6,該線性回歸方程適用于高濃度的羅丹明B 示蹤劑的測(cè)量。 對(duì)于更高濃度的樣品, 可將樣品稀釋后進(jìn)行測(cè)量。

3.5 羅丹明B 正確度和檢出限

配制含羅丹明B 濃度分別為0.004、0.006、 0.008、 0.010、 0.020 和0.040 mg·L-1的海水樣品, 用10 cm 比色皿在550 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定各樣品的吸光度值, 并計(jì)算各樣品中羅丹明B 的含量, 結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 羅丹明B 測(cè)量正確度結(jié)果Table 7 Correctness result of rhodamine B measurement

由表7 可見(jiàn), 羅丹明B 的含量在0.010 mg·L-1以上時(shí)正確度良好, 低于0.010 mg·L-1時(shí)羅丹明B 計(jì)算結(jié)果偏差較大。 因此分光光度法測(cè)定海水中羅丹明B 的含量的檢出限為0.010 mg·L-1。

3.6 羅丹明B 的加標(biāo)回收率

配制含羅丹明B 濃度分別為0.005、0.050、 0.500 和5.00 mg·L-1的海水樣品, 并加入一定量的羅丹明B, 其中0.005 和0.050 mg·L-1的樣品用10 cm 比色皿, 0.500 mg·L-1的樣品用3 cm 比色皿, 5.00 mg·L-1的樣品用1 cm 比色皿, 在550 nm 波長(zhǎng)下分別測(cè)定吸光度值, 并計(jì)算加標(biāo)前后樣品中羅丹明B 的含量, 結(jié)果見(jiàn)表8。

由表8 可見(jiàn), 用該方法測(cè)量海水中羅丹明B 的回收率在89.9%～116%之間, 加標(biāo)回收率可以滿足要求。

表8 羅丹明B 加標(biāo)回收率測(cè)量結(jié)果Table 8 Result of recovery rate of rhodamine B

4 結(jié)論與建議

本研究建立的熒光分光光度法和分光光度法二者均可用于海洋水中羅丹明B 示蹤劑的定量分析。 通過(guò)對(duì)比可知, 兩種方法均不受基體種類和pH 等因素的影響, 且樣品前處理簡(jiǎn)單、 快速。 熒光分光光度法的檢出限 （0.004 mg·L-1） 優(yōu) 于 分 光 光 度 法（0.010 mg·L-1）, 但是在野外監(jiān)測(cè)過(guò)程中, 熒光分光光度法對(duì)環(huán)境的要求高于分光光度法,且熒光分光光度計(jì)長(zhǎng)時(shí)間開機(jī)光源需要散熱,需要定時(shí)停機(jī) “休息”, 從而影響野外檢測(cè)進(jìn)度[10]。 而分光光度計(jì)對(duì)環(huán)境的要求較為簡(jiǎn)單,儀器較熒光分光光度計(jì)更加便攜, 且可長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)工作。 因此, 在海洋監(jiān)測(cè)活動(dòng)中, 可根據(jù)實(shí)際的工作量和需求, 選取熒光分光光度法或分光光度法進(jìn)行測(cè)試。