金緯緯，林一禾，趙小迎，莊曉蘋，蔡平生

（溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 婦科，浙江 溫州 325000）

子宮內(nèi)膜癌為女性生殖道常見的三大惡性腫瘤之一，其發(fā)生率占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%。早期的子宮內(nèi)膜癌手術(shù)效果良好，但特殊或晚期子宮內(nèi)膜癌預(yù)后很差，主要采用以化療為主的姑息性治療?；煹牟涣挤磻?yīng)和多藥耐受（multidrug resistance，MDR）是影響化療療效的主要原因。根據(jù)溫伯格效應(yīng)理論，相較正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞更傾向于低氧環(huán)境，傾向于利用糖酵解途徑獲取能量。因此如何阻斷腫瘤細(xì)胞糖酵解過程，破壞腫瘤細(xì)胞賴以生存的低氧環(huán)境成為抗腫瘤機(jī)制研究的重要突破口。姜黃素是由姜科植物根莖中提取的一種多酚類物質(zhì)，其植物提取物經(jīng)純化的成分早已被用于治療多種疾病[1]。研究證實(shí)姜黃素具有抗氧 化[2]、抗炎[3]、抑制腫瘤作用[1]，可有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[4]。在前期的研究中，我們發(fā)現(xiàn)姜黃素能顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖及腫瘤遷移能力，但是其具體作用機(jī)制并未完全闡明。本研究旨在研究姜黃素可通過調(diào)控子宮內(nèi)膜癌能量代謝通路，抑制腫瘤細(xì)胞生長，及提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株：實(shí)驗(yàn)組：子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa （子宮內(nèi)膜腺癌高分化）/HEC-1-B（子宮內(nèi)膜腺癌中分化）；陰性對(duì)照組：正常宮頸上皮ECT1/E6E7細(xì)胞；陽性對(duì)照組：宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞株（腺癌）。ECT1/E6E7細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，Ishikawa、HEC-1-B和Hela細(xì)胞由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。

1.1.2 試劑和耗材：細(xì)胞線粒體壓力檢測試劑盒（103015-100）、細(xì)胞糖酵解壓力檢測試劑盒（貨號(hào)103020-100）、XF Cell Energy Phenotype Test Kit（103025-100）、細(xì)胞能量代謝檢測基礎(chǔ)培養(yǎng)基（102353-100）、細(xì)胞能量代謝檢測板（102601-100）購自德國Agilent公司；Cell-tak（354240）購自美國BD公司；乳酸檢測試劑盒（MAK064）、丙酮酸檢測試劑盒（MAK071）購自德國Sigma-Aldrich公司；TRIzol?Reagent、QuantiTect SYBR Green PCR Kit購自美國Invitrogen公司；cDNA合成試劑盒購自上海生工生物有限公司。5-FU（316-46-1）、姜黃素（458-37-7）購自美國Sigma公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司），Seahorse XFe96細(xì)胞能量代謝分析儀（德國Agilent公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞能量代謝檢測：提前24 h細(xì)胞鋪板，將細(xì)胞接種到Seahorse XF細(xì)胞培養(yǎng)板中，在生長培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；預(yù)熱儀器，打開Seahorse儀器和電 腦，并打開軟件，使儀器升溫至37 ℃，過夜預(yù)熱；水化探針：在Utility Plate中加入Seahorse XF校準(zhǔn) 液，將測試板放回Utility Plate上，置于37 ℃無CO2培養(yǎng)箱中過夜水化探針；細(xì)胞線粒體壓力檢測實(shí)驗(yàn)中所需試劑濃度：oligomycin為1.5 μmol/L，F(xiàn)CCP為1.5 μmol/L及rotenone/antimycin A為0.5 μmol/L， 體積為25 μL，分別加入A、B、C孔中；細(xì)胞糖酵解壓力實(shí)驗(yàn)所需配置藥物濃度：glucose為10 mmol/L，oligomycin為2.5 μmol/L，上述2種藥物分別加入 A、B孔中，體積為25 μL，100 mmol/L 2-DG 200 μL加入C孔；上樣步驟參照Seahorse X96步驟說明書。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1-B和293T細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)條件為5% CO2，37 ℃，恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。姜黃素處理Ishikawa細(xì)胞，用于檢測能量代謝Seahorse實(shí)驗(yàn)，處理濃度為10 μmol/L， 處理時(shí)間為24 h。

1.2.3 丙酮酸脫氫酶激酶2（pyruvate dehydrogenase kinase-2，PDK2）敲除子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株構(gòu)建：shPDK2-pLKO.1-GFP病毒購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，提前1 d將Ishikawa細(xì)胞按每孔3×105接種于6孔板，培養(yǎng)24 h，按1:1 000在培養(yǎng)基中加入shPDK2-pLKO.1-GFP慢病毒，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中感染過夜；24 h后，更換新鮮培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清）；48 h后，準(zhǔn)備二次感染，步驟同上；48 h后，流式分選GFP陽性Ishikawa細(xì)胞。

1.2.4 RT-qPCR：TRIzol reagent（美國Invitrogen 公司）提取細(xì)胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司，按照說明書步驟進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。SYBR Green PCR Master MIX（美國Applied Biosystems公司）試劑盒，ABI PRISM 7900 system（美國PerkinElmer公司）進(jìn)行熒光定量PCR測定。實(shí)驗(yàn)中所用的特異性寡核苷酸引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2.5 細(xì)胞代謝產(chǎn)物乳酸及丙酮酸檢測：取1×106細(xì)胞，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h，培養(yǎng)基體積為500 μL。收取培養(yǎng)上清液，室溫2 000 r/min離心 5 min除去細(xì)胞，吸取上清液用于檢測乳酸含量，根據(jù)乳酸測量試劑盒說明操作。收集培養(yǎng)后細(xì)胞，室溫2 000 r/min離心5 min，棄上清液，留取細(xì)胞沉淀，用預(yù)冷的1×PBS洗滌1次，留取沉淀用于檢測細(xì)胞內(nèi)丙酮酸水平，參照丙酮酸測量試劑盒說明操作。

1.2.6 小鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)：Nude小鼠20只，6～8周齡，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2015-0009；收集子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞，皮下注射入裸鼠體內(nèi)，每只小鼠注射細(xì)胞數(shù)為1.5×106，皮下注射后2周，觀察到小鼠皮下有凸起腫塊，進(jìn)行5-FU（100 mg/kg）及姜黃素（100 mg/kg）處理，腹腔注射，隔天注射，連續(xù)1周。5周后，測量小鼠腫瘤體積及質(zhì)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用GraphPad Prism 7軟件作圖，數(shù)據(jù)均來自3個(gè)以上獨(dú)立樣本，統(tǒng)計(jì)代表至少獨(dú)立重復(fù)3次的結(jié)果。計(jì)量資料以表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析與Tukey多重比較檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞能量代謝依賴于糖酵解途徑 與陰性對(duì)照組比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在氧耗率（oxygen consumption rate，OCR）即氧化磷酸化水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但是在反映細(xì)胞糖酵解活性的細(xì)胞外酸化率（extracellular acidification rate，ECAR）上，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞顯著高于陰性對(duì)照組；培養(yǎng)基上清液中乳酸含量檢測結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組及陽性對(duì)照組培養(yǎng)基上清液中乳酸水平顯著高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而細(xì)胞內(nèi)丙酮酸含量檢測顯示，實(shí)驗(yàn)組及陽性對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)丙酮酸含量略高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。因此與正常宮頸上皮細(xì)胞相比，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中乳酸分泌量顯著增加，胞內(nèi)丙酮酸含量也略高，提示子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞能量代謝更依賴于糖酵解途徑。

圖1 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞能量代謝水平檢測

2.2 姜黃素抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞糖酵解過程 利用姜黃素處理Ishikawa細(xì)胞后（10 μmol/L，24 h），與對(duì)照組（未經(jīng)過姜黃素處理）比，ECAR顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），OCR水平2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)基中乳酸和丙酮酸含量經(jīng)過6 h培養(yǎng)，姜黃素組細(xì)胞上清中乳酸含量顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而丙酮酸含量檢測顯示，姜黃素組細(xì)胞內(nèi)丙酮酸含量略高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示姜黃素顯著抑制了子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞糖酵解途徑。見圖2。

圖2 姜黃素調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞糖酵解過程

2.3 姜黃素調(diào)控PDK2 表達(dá) Ishikawa細(xì)胞經(jīng)過姜黃素處理后，糖酵解代謝相關(guān)基因受到顯著抑制，其中PDK2作為調(diào)控糖酵解途徑的重要激酶，其mRNA相對(duì)表達(dá)水平較對(duì)照組低（P＜0.05）；而在Ishikawa細(xì)胞中敲除PDK2的表達(dá)，敲除組細(xì)胞PDK2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平較未敲除組低（P＜0.05）；進(jìn)一步檢測PDK2敲除組細(xì)胞能量代謝指標(biāo)，結(jié)果顯示PDK2敲除組Ishikawa細(xì)胞ECAR顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），而OCR差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示姜黃素通過PDK2調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞能量代謝通路；胞外乳酸分泌水平檢測結(jié)果顯示，PDK2敲除組乳酸分泌水平較對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；細(xì)胞內(nèi)丙酮酸水平檢測結(jié)果顯示，對(duì)照組與PDK2敲除組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），進(jìn)一步驗(yàn)證姜黃素通過PDK2調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞能量代謝通路。見圖3。

2.4 姜黃素提升子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞化療敏感性 5-FU 作為臨床一線化療藥物，是子宮內(nèi)膜癌常用化療方案，但是存在一定的化療耐受；姜黃素聯(lián)合5-FU使用，體外細(xì)胞培養(yǎng)過程中可顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖，見圖4A；在動(dòng)物皮下成瘤模型中，對(duì)照組小鼠腫瘤質(zhì)量為（0.484±0.052）g，姜黃素組為（0.435±0.039）g，5-FU組為（0.206± 0.029）g，聯(lián)合用藥組為（0.321±0.005）g，聯(lián)合用藥組小鼠腫瘤質(zhì)量最小，與5-FU組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)照組小鼠腫瘤體積為（816.40± 76.17）mm3，姜黃素組為（649.90±86.00）mm3，5-FU組為（335.30±26.31）mm3，聯(lián)合用藥組為（66.18± 11.34）mm3，聯(lián)合用藥組小鼠腫瘤體積最小，與5-FU組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。綜上，姜黃素聯(lián)合5-FU處理子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，可在體內(nèi)體外有效抑制腫瘤的增殖與擴(kuò)增。見圖4B。

圖3 PDK2調(diào)控子宮內(nèi)膜癌糖酵解過程

3 討論

圖4 姜黃素與5-FU聯(lián)合用藥抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖（n=5）

腫瘤干細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生與病程發(fā)展、腫瘤的復(fù)發(fā)、放化療藥物耐受等過程起重要作用，而現(xiàn)有的理論認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞存活于獨(dú)特的腫瘤微環(huán)境中，且腫瘤干細(xì)胞處于細(xì)胞周期靜息期，因此相比位于細(xì)胞周期內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，可能具有相對(duì)獨(dú)特的生理生化反應(yīng)及能量代謝過程。越來越多的研究顯示，代謝途徑的改變在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。CHEN等[5]研究顯示急性髓細(xì)胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）細(xì)胞偏向于利用糖酵解途徑進(jìn)行能量代謝，且其可通過攝取果糖而不是葡萄糖來進(jìn)行糖酵解過程；CHEN等[6]研究顯示在肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞中，癌細(xì)胞中調(diào)控糖酵解途徑的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Chrebp顯著上調(diào)；SUN等[7]研究顯示在肺癌細(xì)胞中，PDK2表達(dá)水平與paclitaxel藥物耐受關(guān)系密切，而PDK2在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的糖酵解中起重要作用；XINTAROPOULOU等[8]發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中，與糖酵解途徑關(guān)系緊密的GLUT1、HK1、PKM2等基因高表達(dá)，而下調(diào)其表達(dá)可顯著抑制卵巢癌的增殖過程。因此靶向腫瘤細(xì)胞糖酵解過程，阻斷腫瘤細(xì)胞糖酵解途徑已經(jīng)成為抗腫瘤治療及抗腫瘤藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株和正常上皮細(xì)胞能量代謝途徑存在差異，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞依賴于糖酵解作為主要代謝方式，而姜黃素通過PDK2調(diào)控糖酵解代謝通路，抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖與克隆形成，與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，但是腫瘤細(xì)胞是否僅僅利用糖酵解途徑作為主要能量代謝途徑，尚存在一定的爭議。LAGADINOU等[9]研究顯示，在人AML細(xì)胞中存在兩群ROS含量不同的細(xì)胞，而腫瘤干細(xì)胞主要集中于ROS較低的那群細(xì)胞群中，但是這群細(xì)胞具有較低的糖酵解及氧化磷酸化水平，但是其利用BCL2抑制劑靶向作用于氧化磷酸化過程，ROS較低的細(xì)胞群中，細(xì)胞增殖受到顯著抑制，而在ROS較高的細(xì)胞群中可通過上調(diào)糖酵解過程補(bǔ)償能量代謝，而腫瘤干細(xì)胞集中于ROS低細(xì)胞群中，因此認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞以氧化磷酸化作為主要能量代謝方式，與我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果相悖，但是在本研究過程中，我們亦發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中，氧化磷酸化代謝通路并未減弱，因此在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中氧化磷酸化通路可能在腫瘤細(xì)胞代謝存在一定作用，但是具體其調(diào)控方式及途徑，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究；而我們現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果集中于探究子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系，而患者原代組織中分離原代細(xì)胞中，癌旁組織細(xì)胞、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞及子宮內(nèi)膜癌干細(xì)胞之間能量代謝途徑調(diào)控差異，我們尚未在原代細(xì)胞上驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，有待繼續(xù)探究。

姜黃素的研究集中于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[10-11]、自噬[10]、細(xì)胞周期阻滯[12-13]、表觀遺傳學(xué)效應(yīng)劑[14]等作用，CHEN等[15]發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過抑制細(xì)胞因子相關(guān)調(diào)控因子SOCS1和SOCS2，抑制JAK2/STAT通路的激活，從而抑制AML和CML細(xì)胞的生長和克隆形成能力；TSAI等[16]發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過抑制NF-κB/MPPs 信號(hào)通路抑制非小細(xì)胞肺癌的侵襲和遷移過程；但是針對(duì)姜黃素調(diào)控細(xì)胞代謝途徑效應(yīng)劑研究較少。我們前期研究過程集中探究了姜黃素調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞糖酵解及氧化磷酸化過程，主要集中于糖代謝通路，并未探究其在氨基酸代謝、脂代謝、核酸代謝過程中的作用，而現(xiàn)有的研究顯示，氨基酸代謝在腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)及耐藥過程發(fā)揮重要作用，如甲氨蝶呤與組氨酸及甘氨酸代謝有密切聯(lián)系[17]，而脂肪酸代謝[18]、果糖代謝[19]及其調(diào)控相關(guān)的AMPK通路在AML發(fā)生過程中也起到重要作用[18]，因此，姜黃素調(diào)控氨基酸及脂肪酸代謝過程靶點(diǎn)及調(diào)控方式需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中提及姜黃素顯著增強(qiáng)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對(duì)化療藥物5-FU的敏感性，而現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道，腫瘤干細(xì)胞的耐藥與干細(xì)胞獨(dú)特的代謝方式密切相關(guān)，BCL2抑制劑維納克拉特異性靶向氨基酸代謝，與臨床化療藥物阿扎胞苷聯(lián)合用藥，可顯著提高AML患者化療效果，顯著延長患者無病生存期[19-20]；研究顯示，異檸檬酸脫氫酶IDH1在AML發(fā)生與發(fā)展過程中起重要作用[21]，而IDH1是三羧酸循環(huán)的限速酶，因此IDH1抑制劑可顯著抑制AML細(xì)胞氧化磷酸化過程，靶向抑制AML細(xì)胞氧化磷酸化過程，從而殺傷AML細(xì)胞[22]；邢沖云等[23]發(fā)現(xiàn)姜黃素通過調(diào)控JAK/STAT通路，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖，而現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道顯示JAK/STAT通路同樣調(diào)控了腫瘤細(xì)胞的代謝過程；因此探究姜黃素特異靶向腫瘤細(xì)胞代謝途徑，及其與臨床化療藥物的聯(lián)合化療方案，從而降低常規(guī)化療藥物使用濃度，降低其對(duì)正常細(xì)胞毒性作用，調(diào)高腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，亟待后續(xù)的研究。