張偉珍， 段廷玉

(蘭州大學草地農業(yè)科技學院/蘭州大學草地農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室/蘭州大學農業(yè)農村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室,甘肅 蘭州 730020)

豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)又稱豆蚜，是半翅目蚜科昆蟲[1]。該類昆蟲在世界各地分布十分廣泛，可危害包括豌豆(Pisumsativum)、苜蓿(Medicagosativa)、三葉草(Trifoliumsubterraneum)等在內的多種豆科作物及牧草，是豆科作物種植及牧草栽培的主要害蟲之一[2]。豌豆蚜多聚集在豆科植物的的嫩莖、嫩葉及幼芽等部位，以其刺吸式口器刺穿植物表皮吸取汁液，造成植株體內營養(yǎng)流失，葉片卷縮、凋零，花蕾變黃脫落，嚴重時田間植株成片枯死，造成重大產量損失[3-4]。此外，豌豆蚜取食植物還可以傳播多種植物病毒，是三葉草、苜蓿等植物病毒病的主要傳播媒介之一[5]。

箭筈豌豆(Viciasativa)是雙子葉植物綱薔薇目豆科野豌豆屬植物，一年生或越年生[6]。箭筈豌豆具有早發(fā)、速生、早熟、產種量高而穩(wěn)定等優(yōu)點，且其營養(yǎng)物質含量豐富，莖葉含粗蛋白22.81%、有機物含量81.56%，含氮2.30%、含磷0.20%、含鉀1.58%，是一種優(yōu)良牧草[7]。近年來綠肥產業(yè)興起，箭筈豌豆作為西北干旱地區(qū)的一種重要的豆科綠肥作物，可與小麥、燕麥等進行輪作、套作或混播，對增加土壤有機質，改善土壤結構，提高土壤肥力具有重要作用[8-9]。蟲害是牧草產業(yè)中除病害外另一個極其重要的限制因子，據調查，蟲害不僅會導致牧草生長發(fā)育不良，嚴重的還會出現壞死斑點甚至全株死亡，降低牧草的適口性，嚴重影響家畜取食；同時，蟲害還會引起牧草產量下降，營養(yǎng)價值降低，制約牧草生產，引起重大經濟損失[10]。豌豆蚜是箭筈豌豆上的一種重要害蟲，在甘肅夏河的箭筈豌豆栽培區(qū)中發(fā)生面積較廣、蟲口密度較大，且因其天敵數量少，極易造成蟲害發(fā)生蔓延，應及早采取防治措施，以免對箭筈豌豆種植業(yè)造成損失。

叢枝菌根(arbuscular mycorrhizal，AM)真菌是球囊菌門(Glomeromycota)真菌，廣泛存在于自然界中[11]。AM真菌、昆蟲同時作用于植物體，可形成AM真菌-植物-昆蟲互作體系[12-13]。已有相關研究發(fā)現，AM真菌可通過調控植物的生長、生理生化代謝以及基因表達等，進而調控植物與昆蟲的互作效應[14-15]。一些球囊霉屬的真菌可以誘導植物產生大量揮發(fā)性化合物，主要是萜烯類、醇類、酯類和少量烷烴類物質，通常這類物質是作為植物-昆蟲營養(yǎng)關系中信息傳遞的媒介，可以影響到昆蟲的取食偏好及種群動態(tài)[16]。AM真菌侵染植物后產生的毒性代謝物，如E-2-己烯-1-醇、芳樟醇、苯甲醛、香芹酚等，這些物質對害蟲具有抑制或毒殺效果，可以保護植物，減少昆蟲取食，提高植物抗蟲性[17-18]；另外AM真菌也可通過強大的菌絲網絡在鄰近植株間傳遞抗蟲防御信號[19-20]，因此在害蟲防治方面應用前景十分廣泛。本研究選用箭筈豌豆作為宿主植物，研究AM真菌對豌豆蚜生長、植株代謝的影響，以期為利用AM真菌減少豌豆蚜對箭筈豌豆的危害、促進其天敵和有益昆蟲的發(fā)生、增創(chuàng)生態(tài)系統(tǒng)效益提供理論及技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試植物 蘭箭3號春箭筈豌豆(Viciasativacv. Lanjian No.3)。

1.1.2供試昆蟲 豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)，采集自蘭州大學榆中苜蓿試驗田，形態(tài)學鑒定，以豌豆幼苗作為寄主，于光照培養(yǎng)箱(每天光照時間為14 h，黑暗時間為10 h；溫度為20±1℃；濕度為60% RH)中培養(yǎng)，用得到的2齡若蚜作為接種昆蟲。

1.1.3供試土壤 試驗用土由兩部分組成，黑土和沙土，購自蘭州花市。所有基質過2 mm篩，121℃高壓滅菌兩次，每次滅菌1 h，間隔24 h。再將黑土∶沙土以1∶3的比例混合?；旌贤寥阑|全N為16.21 mg·kg-1，全P為17.18 mg·kg-1，pH為7.3。

1.1.4供試菌劑 供試AM真菌菌劑為扭形球囊霉(Glomustortuosum)。購買于北京市農林科學研究院植物營養(yǎng)與資源研究所，中國叢枝菌根真菌菌種資源保藏中心，宿主植物為三葉草(Trifoliumsubterraneum)。

1.2 試驗設計

盆栽試驗于2018年8月-10月在蘭州大學榆中校區(qū)草地農業(yè)科技學院智能溫室進行。2種AM真菌接菌處理：接菌(AM)與不接菌(NM)。3種接蟲處理：接蚜蟲(H+)、不接蚜蟲(H-)和針刺模擬昆蟲取食(M)。設置針刺模擬昆蟲取食的處理，旨在避免因蚜蟲過早死亡造成蚜蟲取食頻率較低，未對植株造成明顯傷害，從而導致試驗結果不明顯?？偣?×3=6種處理，每處理5盆，共30盆，各處理隨機擺放。

AM真菌接種方法：需要接菌的處理，接種量為每盆100 g，接種菌劑為含有孢子、菌絲的土壤及其寄主植物的根段混合物。接種采用層播的方式，先稱取1 000 g土壤基質加入花盆，再準確稱取100 g菌劑，將其均勻平鋪于花盆中的土壤上，然后再稱400 g土壤基質，將其均勻地撒在菌劑上層。不接AM真菌的處理則用等量滅菌土壤基質代替AM真菌菌劑。用于接種的AM菌劑為用三葉草擴繁所得的孢子、菌根根段、根外菌絲及培養(yǎng)基質，每克菌劑含有>100個孢子。

催芽及播種：挑選大小一致、籽粒飽滿、健康無病蟲害的箭筈豌豆種子，將其置于10%的H2O2中浸泡5 min進行表面消毒，然后傾去H2O2，用無菌水對種子進行清洗，重復3遍即可。用滅菌鑷子將種子均勻擺放于鋪設了滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25℃培養(yǎng)箱催芽培養(yǎng)。待芽長至1～2 mm即可播種，每盆6株，播種深度為1～2 cm。

蚜蟲接種方法：在箭筈豌豆植株生長6周時進行接蟲處理，用毛筆小心粘取蚜蟲，將其移至箭筈豌豆葉片上，每盆接種10只。針刺模擬處理則在每盆植株隨機選取10個葉片，用用昆蟲針在植物葉片上進行針刺，造成10個直徑約為0.25 mm的創(chuàng)傷。

試驗管理：出苗后定期觀察并記錄植株生長指標。生長期間，根據天氣狀況定期稱重澆水。接種蚜蟲5 d后收獲植株，測量箭筈豌豆的莖葉干重、根系干重，以及抗病相關酶活性、脫落酸、茉莉酸、水楊酸及胰蛋白酶抑制劑等生理生化指標。試驗期間，溫度為20～28℃，每周五溫室定期噴施噠螨靈、吡蟲啉、溴氰菊酯等藥劑。

1.3 測定指標及方法

菌根侵染率采用染色鏡檢法進行測定[21]。莖葉干重和根干重采用稱重法測定。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，過氧化物酶(peroxidase，POD)，過氧化氫酶(catalase，CAT)及多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)等防御酶活性參照李合生的方法進行測定[22]。全N、全P含量參照馬源等的方法測定[23]。脫落酸含量采用高效液相色譜法測定[24]。茉莉酸含量采用高效液相色譜法測定[25]。水楊酸含量采用高效液相色譜法測定[26]。胰蛋白酶抑制劑活性參照樊艷平等的方法測定[27]。

根長：由著生于莖干基部的根冠頂端到主根尖末端的長度。

根系面積：使用杭州萬深檢測科技有限公司生產的LA-S植物根系掃描儀進行掃描，并計算植株根系面積。

蚜蟲存活率：從接蟲開始，每隔12 h觀察蚜蟲的存活情況，共統(tǒng)計4 d，計算蚜蟲的存活率。

1.4 數據處理與分析

試驗數據錄入Microsoft Excel 2010進行整理并計算，用JMP IN 4統(tǒng)計軟件對數據進行單因素方差分析，用GraphPad Prism 5.01軟件繪圖。

2 結果

2.1 菌根侵染率

NM處理的箭筈豌豆根系中均未檢測到菌根侵染結構，接種AM真菌的處理，在顯微鏡下觀察到叢枝、泡囊及菌絲等菌根侵染結構，表明AM真菌接種成功。菌根侵染率分別為57.5%，57.7%和58.8%，三個處理間無顯著差異(圖1)。

圖1 不同處理下的菌根侵染率Fig.1 Colonization rate in different treatments注：NM表示不接種AM真菌處理，AM表示接種G. tortuosum；H-表示無接蟲處理，H+表示蚜蟲處理，M表示針刺模擬昆蟲取食；不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同Note:NM=Inoculation with sterilized AM fungi,AM=Inoculation with G. tortuosum;H-=Don’t inoculate aphid;H+= Inoculation with aphid;M=Simulated insect feeding by prodding. Different low case letter above the bars means there are significant different across treatments at the 0.05 level. The same as below

2.2 植物生長情況

AM真菌對箭筈豌豆的生長產生了顯著的促進效應(表1，圖2)。與不接種扭形球囊霉(G.tortuosum)的處理相比較，接種扭形球囊霉的處理顯著提高了箭筈豌豆的地上生物量、地下生物量、根長以及根系面積，促進了植株的生長(P<0.05)。相比對照，接種G.tortuosum后植株的莖葉干重提高約53.98%，根干重提高約179.69%，根長提高約24.34%，根系面積提高約38.85%。該試驗結果表明，扭形球囊霉顯著促進了箭筈豌豆的生長。試驗發(fā)現，接蟲處理及針刺模擬蚜蟲取食未對箭筈豌豆的生物量及根系長度、面積產生影響，可能由于接蟲處理于植株生長發(fā)育為健全植株后進行，且昆蟲取食時間僅為3～4 d，所以未對植株的生長產生明顯的抑制效應。

表1 AM真菌(AM)，豌豆蚜(H)及兩者互作效應方差分析Table 1 ANOVA results(P) of Vicia sativa inoculated with or without arbuscular mycorrhizal (AM) andAcyrthosiphon pisum (H) and their interactions (AM*H)

注：NS表示無顯著影響(P>0.05)

Note:NS indicate no significant difference at the 0.05 level

圖2 AM真菌、豌豆蚜對箭筈豌豆生長指標的影響Fig.2 Effect of AM fungus and Acyrthosiphon pisum on the growth of Vicia sativa

2.3 蚜蟲存活率

由圖3可知，在接蟲后12 h，接種扭形球囊霉的植株上的蚜蟲已大幅度死亡，存活率僅為48%，而同一時間未接種AM真菌的植株蚜蟲存活率為60%，明顯高于AM真菌處理的植株。在隨后的12 h內，AM真菌處理的植株上的蚜蟲死亡速度持續(xù)增大，到接蟲后36 h，蚜蟲存活率僅為12%，同一時間未接種AM真菌的植株蚜蟲存活率為32%。到接蟲后第4 d，AM真菌處理的植株上的蚜蟲全部死亡，而未接種AM真菌的植株上的蚜蟲還有8%存活，且觀察到有下一世代的幼蟲出現。試驗結果表明，AM真菌扭形球囊霉對箭筈豌豆上的豌豆蚜具有抑制作用，甚至可能對豌豆蚜具有毒害作用。

圖3 AM真菌對豌豆蚜存活率的影響Fig.3 Effect of AM fungus on the survival rateof Acyrthosiphon pisum

2.4 防御酶活性

AM真菌對箭筈豌豆酶活性的影響結果與植物生長指標保持一致(圖4)。接種AM真菌對超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，過氧化物酶(peroxidase，POD)活性均產生正效應，AM真菌處理后這兩種防御酶活性均顯著高于未接菌處理，SOD活性較對照增加48.64%，POD活性較對照增加72.04%(P<0.05)。AM真菌對過氧化氫酶(catalase，CAT)及多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)活性的影響并不顯著。蚜蟲取食同樣對四種防御酶活性產生顯著影響，尤其是對CAT和PPO活性的影響更為顯著，與對照相比，蚜蟲取食后箭筈豌豆的CAT和PPO活性增加幅度高達20～30倍(P<0.05)。

圖4 AM真菌、豌豆蚜對箭筈豌豆防御酶活性的影響Fig.4 Effect of AM fungus and Acyrthosiphon pisum on defense enzyme activity of Vicia sativa

2.5 植物養(yǎng)分含量

接種AM真菌后，箭筈豌豆的地上及地下N含量、地下P含量分別增加50.62%，113.07%和62.42%，均達到顯著水平(P<0.05，圖5)。但接種AM真菌后，箭筈豌豆的地上P含量反而較NM處理降低。不論是否接種AM真菌，接蟲處理對地上及地下N含量、地下P含量均變現為負效應。但是對地上P含量的影響與此趨勢不同，NM處理中，蚜蟲取食降低了植株的地上P含量；而在AM真菌處理中，蚜蟲取食及針刺則顯著提高了地上P含量(P<0.01)，比對照增加超過1.5倍。

2.6 信號物質(脫落酸、茉莉酸、水楊酸、胰蛋白酶抑制劑)

NM處理組及AM真菌處理組中，蚜蟲取食均顯著增加了植株的脫落酸含量，分別較對照增加55.53%和50.09(P<0.05)。在針刺模擬昆蟲取食的處理組中，接種AM真菌顯著降低了脫落酸含量，較未接種AM真菌的處理降低19.53%(P<0.05)(圖6)。

與對照相比，接種AM真菌后植株的茉莉酸含量顯著增加52.74%(P<0.05)，水楊酸含量增加3.44%。蚜蟲取食后，箭筈豌豆的茉莉酸和水楊酸含量分別增加32.80%和18.02%(P<0.05)(圖6)。

接種AM真菌+蚜蟲取食處理下，箭筈豌豆植株的胰蛋白酶抑制劑活性最高，與對照相比增加175.02%(P<0.05)。接種AM真菌后，其活性較對照增加95.95%(P<0.05)(圖6)。

圖5 AM真菌、豌豆蚜對箭筈豌豆N、P含量的影響Fig.5 Effect of AM fungus and Acyrthosiphon pisum on N and P content of Vicia sativa

圖6 AM真菌、豌豆蚜對箭筈豌豆信號物質的影響Fig.6 Effect of AM fungus and Acyrthosiphon pisum on the signal substance of Vicia sativa

3 討論與結論

本研究探究了AM真菌扭形球囊霉對箭筈豌豆響應豌豆蚜的影響，結果表明G.tortuosum可以促進箭筈豌豆生長和N，P的吸收，提高植物防御性酶活性，增加茉莉酸、水楊酸等信號物質含量，增強胰蛋白酶抑制劑活性，降低蚜蟲存活率，從而減輕豌豆蚜對箭筈豌豆的取食。已有相關研究發(fā)現，在昆蟲-AM真菌-植物互作體系中，AM真菌可以促進植物生長及養(yǎng)分吸收，改善植物的營養(yǎng)狀況，提高了植物整體健康水平，從而間接影響昆蟲的生長和繁殖[28]。在對百脈根(Lotusjaponicus)[29]、梯牧草(Phleumpratense)[30]、水稻(Oryzasativa)[31]、香根菊(Baccharishalimifolia)[32]等進行的研究表明，接種AM真菌后，植物生物量增加，昆蟲數量減少，昆蟲的生長受到抑制。研究表明，AM真菌與昆蟲互作效應因植物、AM真菌、昆蟲而異，接種AM真菌對昆蟲取食的影響不僅僅表現為促進效應[33-34]，如Catherine和Bennett[35]研究了40種AM真菌與昆蟲的互作關系，結果發(fā)現，其中有42.5%的AM真菌對昆蟲趨性及取食有促進作用，有抑制作用的占30.0%，無影響的占25.0%，變異的占2.5%。也有大量研究發(fā)現，AM真菌與昆蟲互作，可以有效抑制昆蟲取食，降低危害程度[36]。究其原因，除影響植物整體健康水平之外，AM真菌也可通過改變植物體內的揮發(fā)性物質、防御性化合物的組分及濃度，調控植物生理生化機制，從而使宿主植物對昆蟲產生驅避作用，減少害蟲取食，降低對植物造成的傷害[37-38]。

AM真菌可調節(jié)植物信號物質，影響蚜蟲取食及存活。AM真菌可以促進番茄(Lycopersiconesculentum)抗蟲防御信號物質的合成，并且通過其菌絲網絡傳遞抗蟲信號，從而提高植株抗蟲性[39]；在本研究中，接種G.tortuosum后，箭筈豌豆植株的防御信號物質如茉莉酸、水楊酸的含量均較未接菌處理顯著提高，脫落酸含量則顯著降低。茉莉酸、水楊酸介導的信號傳遞途徑均與植物抗性密切相關，二者都是植物對外界刺激(如昆蟲取食)做出應答，進而誘導抗性基因表達的信號分子，可以促進宿主植物自身防御系統(tǒng)的快速建立，以響應外界脅迫[40-42]。Sabine等[43]也發(fā)現昆蟲取食后，菌根化植株中蛋白酶抑制劑基因(PI-1和PI-II)顯著上調表達，這是植物體內一種重要的抗蟲基因；且接種AM真菌后，植株的的茉莉酸感知突變體基因LOXD和茉莉酸合成突變體基因PI-II不表達，茉莉酸過表達植株中的基因轉錄水平顯著升高。因此，在昆蟲-AM真菌-植物三者互作時，AM真菌可以調控植物相關防御基因表達，改變體內防御性化學物質的變化，從而影響昆蟲的采食和生長。

本研究亦發(fā)現，接種G.tortuosum后，脫落酸含量降低，說明AM真菌的定殖減緩了昆蟲取食對植物葉片造成的危害。接種AM真菌后，箭筈豌豆植株葉片中的胰蛋白酶抑制劑活性顯著提高。胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitor,TI)能夠與生物體內的酶結合，降低酶作用底物分解速率，從而抑制胰蛋白酶水解活性，調節(jié)生物體內的生理生化代謝[44-46]。有研究表明，胰蛋白酶抑制劑可以作用于昆蟲腸道，與胰蛋白酶結合，抑制其活性，昆蟲對食物的消化受到嚴重影響，無法充分吸收和利用食物中的營養(yǎng)物質，導致昆蟲營養(yǎng)不良甚至死亡[47-48]。

本研究雖然發(fā)現叢枝菌根真菌的定殖對豌豆蚜的發(fā)生具有一定程度的抑制作用，但試驗僅在溫室進行，且溫室每周五定期噴施噠螨靈、吡蟲啉、溴氰菊酯等藥劑，雖然對試驗植物進行了遮蔽，但很大程度上影響了蚜蟲存活率。在實際生產中，田間氣候條件復雜多變，AM真菌-植物-昆蟲互作模式會因物種、作用時間、自然環(huán)境的復雜性等不同存在較大的差異；另外，一旦蟲害爆發(fā)，采用生防菌劑遠不如化學防治見效快，且研制生防菌劑需耗費大量人力、物力及資金，即使研發(fā)成功，如何進行產業(yè)化生產仍具有較高的應用技術難度。因此，在進行AM真菌-植物-昆蟲互作的相關研究時應考慮環(huán)境等因素的影響，研究不同響應方式之間的聯系，明確AM真菌與昆蟲相互作用的方式和機制，分析AM真菌-植物-昆蟲互作的復雜關系，趨利避害，利用自然界生物之間的關系，控制農業(yè)害蟲的發(fā)生，是實現綠色、健康可持續(xù)許發(fā)展的重要途徑。