李州，彭燕，尹淑霞，韓烈保*

(1.北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所，北京 100083；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院草學(xué)系，四川 成都 611130)

隨著全球氣候變暖，極端氣候頻發(fā)，可利用灌溉水資源銳減，干旱已成為威脅植物生長發(fā)育最主要的逆境脅迫因子之一[1]。白三葉(Trifoliumrepens)是一種重要的冷季型豆科草類植物，因其具有產(chǎn)量高、適口性好、粗蛋白含量高和生物固氮能力強等特點，在我國南方地區(qū)常作為優(yōu)良牧草栽培種植。同時，由于白三葉具有匍匐生長特性強、再生速度快和葉型優(yōu)美等特點，亦被廣泛應(yīng)用于觀賞性草坪[2]。但白三葉喜冷涼濕潤的環(huán)境，生長過程中需水量大，根系較淺，自身抗蒸騰能力差，干旱是限制白三葉栽培利用的關(guān)鍵阻礙因子[3]。因此，如何提高栽培管理過程中白三葉的抗旱性顯得尤為重要。

前人研究已表明，在草坪養(yǎng)護管理和牧草栽培利用過程中，施用外源植物生長調(diào)節(jié)劑提高植物抗逆性具有操作簡單、見效快和實用價值高等特點， 并已成功應(yīng)用于提高白三葉、匍匐翦股穎(Agrostisstolonifera)、草地早熟禾(Poapratensis)等牧草及草坪草的抗旱性[4-6]。甘露糖(mannose，MAS)是一種植物體內(nèi)廣泛存在的單糖，可直接被利用合成糖蛋白參與免疫調(diào)節(jié)，也可合成其他代謝物例如抗壞血酸等，且相較于其他植物生長調(diào)節(jié)劑具有價格低廉、無毒副作用、低濃度調(diào)節(jié)效應(yīng)顯著等特點[7]。相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)匍匐翦股穎的抗旱性與甘露糖積累有關(guān)[5]；轉(zhuǎn)入甘露糖合成基因的擬南芥(Arabidopsisthaliana)耐旱性、耐酸性及耐鹽性均顯著提高[8]；外源甘露糖浸種也能有效提高干旱脅迫下小麥(Triticumaestivum)種子的萌發(fā)[9]。這些研究證實甘露糖在提高植物抗旱性上發(fā)揮重要作用，但其調(diào)節(jié)植物抗旱性相關(guān)作用機制尚未完全揭示清楚，甘露糖是否能有效調(diào)節(jié)白三葉抗旱性也未見報道。因此，研究外源甘露糖提高白三葉抗旱性具有實際應(yīng)用和理論研究意義雙重價值。

本試驗擬通過外施甘露糖提高白三葉抗旱性，并通過分析干旱脅迫下白三葉葉片水分含量變化、滲透調(diào)節(jié)能力、細胞膜透性、膜脂過氧化、抗氧化能力、光合響應(yīng)等，并借助氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)技術(shù)檢測脅迫下葉片內(nèi)關(guān)鍵糖和糖醇類代謝物積累變化，從生理和代謝上揭示甘露糖提高白三葉抗旱性相關(guān)機制，也為將甘露糖應(yīng)用到提高白三葉抗旱性栽培管理中奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與處理

以廣泛栽培種植的白三葉品種“拉丁諾”作為供試材料。于2018年進行試驗，選取飽滿良好的種子用0.1%高錳酸鉀溶液消毒5 min后，蒸餾水反復(fù)清洗3次備用。將消過毒的種子均勻播種在裝滿石英砂的育苗盤中，每盤播種量為0.1 g。將播種好的育苗盤放入光照培養(yǎng)箱(21 ℃/18 ℃，白天/黑夜；時長各為12 h；相對濕度為75%；光強為700 μmol·m-1·s-1)中正常培養(yǎng)，用蒸餾水發(fā)芽7 d后改用霍格蘭營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)23 d。當幼苗長至30 d時選取長勢一致的材料進行聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)6000模擬干旱脅迫處理。

設(shè)置4個不同處理，每個處理4個獨立重復(fù)，分別為1)處理1：C(對照，營養(yǎng)液正常培養(yǎng)生長)；2)處理2：MAS+C(在營養(yǎng)液中加入50 mmol·L-1的MAS預(yù)處理3 d，然后更換為營養(yǎng)液繼續(xù)正常培養(yǎng))；3)處理3：D(未經(jīng)過MAS預(yù)處理的材料使用含-0.3 MPa PEG 6000的營養(yǎng)液進行模擬干旱脅迫)；4)處理4：MAS+D(50 mmol·L-1的MAS預(yù)處理3 d，然后更換為含-0.3 MPa PEG 6000的營養(yǎng)液進行模擬干旱脅迫處理)。脅迫9 d后剪取葉片測定各項生理生化指標。

1.2 測定方法

1.2.1葉片相對含水量 剪取新鮮葉片0.2 g，用吸水紙包好后放入裝有40 mL水的離心管中，室溫下避光靜置12 h，待葉片吸水飽和后取出，擦干葉片表面水分，稱量飽和鮮重，然后置于鼓風烘箱中在105 ℃下殺青45 min，然后75 ℃下烘至恒重，稱其干重，重復(fù)4次，取平均值。計算公式：相對含水量(%)=(鮮重-干重)/(飽和鮮重-干重)×100%。

1.2.2葉片滲透勢 取0.2 g植物新鮮葉片，用吸水紙包好后放入裝有40 mL去離子水的離心管中，室溫下靜置12 h，待葉片充分吸水后取出葉片，用吸水紙輕輕擦干葉片表面水分后，將葉片放入1.5 mL離心管中備用。使用擠壓棒將葉片汁液充分擠壓出來，吸取10 μL汁液放入滲透勢測定儀中測定汁液滲透壓。滲透勢(MPa)=滲透壓×0.001×2.58。

1.2.3葉綠素含量及光合相關(guān)參數(shù) 稱取葉片0.1 g將其剪碎至2 cm長，裝入具塞刻度試管中，加入丙酮-乙醇混合液(1∶1，V/V)10 mL，使葉片完全浸入混合液中，置于35 ℃恒溫箱黑暗浸提。直至葉片完全變白，傾出浸提液，以提取液為對照，分別在分光光度計上測定OD645和OD663，并計算葉綠素含量[10]。采用PocketPEA連續(xù)激發(fā)式熒光儀(Hansatech，the United Kingdom)測定葉片葉綠素熒光(photochemical efficiency，F(xiàn)v/Fm)。使用CIRAS-3便攜式植物光合儀(PP Systems，USA)測定凈光合速率(net photosynthetic rate，Pn)和水分利用效率(water use efficiency，WUE)。

1.2.4總抗氧化能力和丙二醛含量 自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司購買植物葉片總抗氧化能力測定試劑盒，根據(jù)說明書稱取0.2 g新鮮植物葉片進行提取和反應(yīng)，采用分光光度計法測定反應(yīng)液吸光值。采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，稱取植物葉片0.4 g放入研缽中，加入液氮充分研磨均勻，待液氮完全揮發(fā)后加入2 mL預(yù)冷的磷酸緩沖液和0.1 g 聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)在冰上再次充分研磨，然后轉(zhuǎn)入離心管中，用2 mL緩沖液充分清洗研缽，一并轉(zhuǎn)入離心管中。4 ℃下15000 r·min-1離心20 min，上清液即為測定用提取液。向0.5 mL的提取液中加入1 mL的反應(yīng)液(20% W/V的三氯乙酸和0.5% W/V的硫代巴比妥酸溶液)，95 ℃水浴30 min，取出后在冰浴上快速冷卻至室溫，10000 r·min-1離心10 min，取上清液在532和600 nm處測定吸光值[11]。

1.2.5電解質(zhì)滲透率 稱取0.2 g新鮮葉片用去離子水沖洗4次后，用潔凈濾紙吸去浮水，放入裝有10 mL去離子水的試管中，真空滲入30 min使葉片完全浸入水中，在25 ℃下放置4 h，用電導(dǎo)儀測初電導(dǎo)率(S1)，然后在沸水浴中煮15 min直到葉片完全殺死，冷卻至室溫后測定煮后終電導(dǎo)率(S2)。相對電導(dǎo)率=(煮前電導(dǎo)率S1/煮后電導(dǎo)率S2)×100%。

1.2.6可溶性總糖 將烘干至恒重后的葉片放入研缽中充分磨碎，準確稱取5 mg磨碎的樣品并倒入10 mL刻度離心管中，然后加入4 mL 80%乙醇，置于80 ℃水浴中不停攪拌40 min，離心，收集上清液，其殘渣加2 mL 80%乙醇重復(fù)提取2次，合并上清液。在上清液中放入10 mg活性炭，80 ℃脫色30 min，然后用80%乙醇定容至10 mL，過濾后用于測定糖含量。吸取上述糖提取液1 mL，加入5 mL蒽酮試劑混合均勻，蓋上塞子后在沸水浴中煮沸10 min，取出立即用冷水冷卻至室溫，在625 nm波長下測定溶液吸光值[12]。

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS，PerkinElmer Inc., Waltham, USA)測定糖和糖醇含量：將植物葉片用錫箔紙包好放入凍干機中凍干至恒重，將凍干的葉片放入研缽中研磨均勻成粉末，準確稱取0.05 g研磨均勻的粉末放入離心管中，加100 μL水和500 μL甲醇(甲醇∶氯仿=3∶1)充分震蕩均勻，混勻后超聲提取20 min。12000 r·min-1離心10 min，將300 μL上清液和10 μL氯苯丙氨酸(內(nèi)標)轉(zhuǎn)移至進樣瓶中，置于濃縮儀中濃縮、干燥。在完全干燥(2.5 h)的樣品加入 80 μL 15 mg·mL-1的甲氧胺/吡啶重新溶解，密封并混勻。置于30 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)甲氧基化2 h。甲氧基化后開啟瓶蓋，加入80 μL BSTFA∶TMCS(99∶1)，密封后充分混勻，70 ℃硅烷化1 h，然后放入GC-MS測定儀中進樣分析[13]。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Excel 2003統(tǒng)計數(shù)據(jù)并進行繪圖，采用SAS 9.1進行方差分析和顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘露糖對干旱脅迫下白三葉葉片水分和光合特性的影響

2.1.1甘露糖對干旱脅迫下白三葉葉片水分狀況的影響 在干旱脅迫下，葉片相對含水量顯著降低，但外源施用 MAS 預(yù)處理后則顯著提高，MAS+D處理比D處理高29%。但正常水分條件下施用MAS對葉片相對含水量沒有顯著影響(圖1)。在干旱脅迫下，葉片滲透勢顯著降低，MAS預(yù)處理下進一步降低。

2.1.2甘露糖對干旱脅迫下白三葉葉片光合特性的影響 外源施用MAS顯著提高葉片葉綠素含量(圖2)，MAS+C處理比C處理高12%，且MAS+D處理比D處理高50%。與C處理相比，干旱脅迫顯著降低了白三葉葉片F(xiàn)v/Fm和凈光合速率，但添加MAS則能顯著提高。干旱脅迫能顯著誘導(dǎo)葉片水分利用效率的提高，MAS+D處理比D處理高28%。

圖1 甘露糖對干旱脅迫下白三葉葉片相對含水量和滲透勢的影響

圖2 甘露糖對干旱脅迫下白三葉葉片葉綠素和光合參數(shù)的影響

2.2 甘露糖對干旱脅迫下白三葉葉片抗氧化能力及細胞膜穩(wěn)定性的影響

正常水分條件下，外源施用MAS沒有對葉片總抗氧化能力、丙二醛含量和電解質(zhì)滲透率產(chǎn)生顯著影響(圖3)。D處理下，葉片總抗氧化能力有所提升，幅度不大，但D+MAS處理的總抗氧化能力急劇上升。D+MAS處理的葉片總抗氧化能力是D處理的1.8倍。D+MAS和D處理均能顯著提高葉片丙二醛含量和電解質(zhì)滲透率，但D+MAS處理比D處理均降低22%。

圖3 甘露糖對干旱脅迫下白三葉葉片抗氧化能力和膜穩(wěn)定性的影響

2.3 甘露糖對干旱脅迫下白三葉葉片糖及糖醇的影響

圖4 甘露糖對干旱脅迫下白三葉葉片可溶性總糖的影響

2.3.1甘露糖對干旱脅迫下白三葉葉片可溶性總糖的影響 干旱脅迫誘導(dǎo)白三葉葉片內(nèi)可溶性糖含量顯著升高，與正常處理C相比較，D處理和MAS+D處理的可溶性糖含量分別上升了94%和124%(圖4)。正常條件下，施用外源MAS略微提高葉片可溶性糖含量，但差異不顯著。干旱條件下，外施MAS能顯著提高葉片可溶性糖含量，即MAS+D處理比D處理高15%。

2.3.2甘露糖對干旱脅迫下白三葉葉片單糖的影響 通過GC-MS分析鑒定，6種不同的單糖被檢測到，包括甘露糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖和來蘇糖(圖5)。在沒有外施MAS的情況下， 干旱脅迫沒有引起葉片內(nèi)甘露糖含量的積累，而應(yīng)用外源MAS顯著提高。與正常條件相比較，干旱脅迫顯著降低了葉片內(nèi)葡萄糖含量，但MAS預(yù)處理后維持在正常水平。干旱脅迫導(dǎo)致果糖在葉片內(nèi)顯著積累，MAS+C處理是C處理的2.27倍，MAS+D處理比D處理高30%。在正常條件和干旱脅迫下，MAS預(yù)處理均能顯著提高半乳糖和木糖在葉片內(nèi)的積累。MAS+C處理的來蘇糖含量是C處理的2倍，處理D和MAS+D中顯著提高，但兩處理間差異不顯著。

圖5 甘露糖對干旱脅迫下白三葉葉片單糖的影響

2.3.3甘露糖對干旱脅迫下白三葉葉片雙糖的影響 3種不同的多糖(蔗糖、麥芽糖和海藻糖)在白三葉葉片內(nèi)被檢測到。葉片蔗糖含量在干旱脅迫下顯著升高，外施MAS預(yù)處理進一步提高了干旱脅迫誘導(dǎo)的蔗糖積累(圖6)。MAS誘導(dǎo)了麥芽糖的顯著積累，MAS+C處理是C處理的4.9倍。白三葉葉片內(nèi)海藻糖含量在干旱脅迫下顯著下降，MAS+C處理比C處理低27%，而MAS+D處理比D處理高38%。

圖6 甘露糖對干旱脅迫下白三葉葉片雙糖的影響

2.3.4甘露糖對干旱脅迫下白三葉葉片糖醇的影響 外施MAS對白三葉葉片內(nèi)肌醇的積累影響較小，干旱脅迫沒有顯著誘導(dǎo)肌醇的積累，但干旱脅迫顯著提高了外施MAS后葉片中肌醇的積累(圖7)。MAS+D處理的丙三醇含量顯著高于D處理，而處理C和處理MAS+C之間沒有顯著差異。4個不同處理之間松醇含量均差異顯著，其中MAS+D處理最高，D處理次之，MAS+C處理第3，C處理最低。

圖7 甘露糖對干旱脅迫下白三葉葉片糖醇的影響

3 討論與結(jié)論

葉片萎蔫是植物響應(yīng)干旱脅迫最明顯的癥狀，但在長期進化適應(yīng)過程中，植物產(chǎn)生了許多調(diào)節(jié)機制以應(yīng)對干旱脅迫造成的水分虧缺，其中滲透調(diào)節(jié)能力顯得尤為重要。植物滲透調(diào)節(jié)作用主要受細胞內(nèi)有機滲透溶質(zhì)和無機滲透調(diào)節(jié)離子積累的影響。有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)包括可溶性糖類和游離氨基酸等，而無機離子Na+、K+、Ca2+及Mg2+等也參與細胞滲透調(diào)節(jié)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，積累滲透調(diào)節(jié)溶質(zhì)除具有調(diào)節(jié)細胞滲透勢，維持干旱脅迫下水分平衡和防止葉片萎蔫外，還具有重要的滲透保護功能，起到維持細胞膜穩(wěn)定性及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等作用[15]。本試驗研究結(jié)果顯示，外施甘露糖預(yù)處理能使白三葉在干旱脅迫下維持顯著較高的葉片相對含水量，說明甘露糖能顯著緩解干旱造成的葉片失水。通過進一步測定葉片滲透勢發(fā)現(xiàn)，葉片滲透勢隨干旱脅迫而下降，甘露糖處理后能使葉片滲透勢進一步降低，說明甘露糖通過調(diào)節(jié)細胞滲透勢從而有助于維持葉片水分平衡，增強植株抗旱性。此外，干旱脅迫促進葉綠素降解從而加快葉片衰老，植物光合作用受到抑制。干旱脅迫下植物保持較高的光合作用有助于代謝物合成從而有利于維持生長和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下白三葉葉片葉綠素含量、葉綠素熒光和凈光合速率急劇下降，植株受損嚴重。但外施甘露糖后白三葉在干旱脅迫下維持了顯著較高的葉綠素熒光參數(shù)和凈光合速率，葉綠素降解減慢，說明甘露糖調(diào)節(jié)白三葉抗旱性與提高植株光合特性有關(guān)。前人的研究也表明，干旱脅迫下提高水分利用效率是植物增強抗旱性的有效途徑之一[17-18]。在本試驗中，白三葉葉片在干旱脅迫下水分利用效率顯著提高，說明白三葉在遭遇干旱脅迫時通過提高自身水分利用效率進而提高抗旱性。有趣的是，當外施甘露糖后白三葉葉片水分利用效率進一步提升，表明白三葉植株在干旱脅迫下維持水分利用和平衡的能力得到進一步增強，有利于白三葉更好地適應(yīng)干旱環(huán)境。

干旱等逆境脅迫會誘導(dǎo)過氧化氫(H2O2)和超氧陰離子(O2-·)等活性氧(ROS)大量積累，打破植物細胞正常條件下所維持的ROS動態(tài)平衡。逆境脅迫下ROS的大量積累必然引起細胞氧化損傷，膜脂過氧化產(chǎn)物積累，細胞膜透性增強等，嚴重影響植物生長發(fā)育直至植株死亡[19-21]。本試驗發(fā)現(xiàn)，外施甘露糖顯著提升了白三葉葉片總抗氧化能力，并有效降低干旱脅迫誘導(dǎo)積累MDA，增強干旱脅迫下細胞膜穩(wěn)定性。已有研究表明，1%的甘露糖可以顯著增強小麥葉片黃化過程中過氧化氫酶(catalase，CAT)、過氧化物酶(peroxidase，POD)和抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，AXP)多種抗氧化酶活性，減輕氧化傷害，從而延緩葉片衰老[22]。Ai等[23]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)導(dǎo)甘露糖合成相關(guān)基因PpGMP的煙草(Nicotianatabacum)抗旱性和耐鹽性顯著提高，這與轉(zhuǎn)基因植株在干旱和鹽脅迫下具有顯著較高的抗壞血酸(ascorbic acid，AsA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性有關(guān)，使得轉(zhuǎn)基因植株能在脅迫下維持顯著較高的抗氧化防御能力，降低MDA和H2O2積累。此外，過量表達DoGMP1的擬南芥在鹽脅迫下也具有顯著較高的AsA含量，增強了細胞清除ROS的能力，轉(zhuǎn)基因植株比野生型表現(xiàn)出更強的耐鹽性[24]。本試驗結(jié)果與這些研究相一致，即甘露糖通過提高白三葉抗氧化防御能力有效緩解干旱引起的細胞氧化傷害，提高植株抗旱性。

如上所述，干旱脅迫下植物通過積累可溶性糖類以降低細胞滲透勢，調(diào)節(jié)水分平衡，增強植株抗旱能力。通過測定白三葉葉片內(nèi)可溶性糖含量發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫顯著誘導(dǎo)了葉片內(nèi)可溶性糖含量積累，而外源添加甘露糖預(yù)處理能進一步促進干旱下可溶性總糖在葉片內(nèi)的積累，這與甘露糖進一步降低干旱脅迫下葉片內(nèi)滲透勢相一致。此結(jié)果也表明甘露糖促進糖類代謝物積累可能是誘導(dǎo)干旱脅迫下白三葉細胞水勢降低的重要原因。進一步利用 GC-MS 檢測不同糖和糖醇類代謝物在白三葉葉片內(nèi)的變化后發(fā)現(xiàn)，甘露糖顯著誘導(dǎo)干旱脅迫下白三葉葉片內(nèi)積累更多的甘露糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、蔗糖、麥芽糖和海藻糖。干旱脅迫下積累碳水化合物不僅有利于提高植物細胞滲透勢，而且也起到保護細胞膜和其他細胞大分子的作用[15,25-26]。近期的研究發(fā)現(xiàn)外源殼聚糖通過促進干旱脅迫下白三葉葉片積累多種糖類并增強滲透調(diào)節(jié)能力，從而維持較好的生長和抗旱能力[27]。伽馬氨基丁酸顯著提高干旱脅迫下匍匐翦股穎抗旱性與甘露糖和麥芽糖積累有關(guān)[5]。本試驗也顯示，正常條件下外施甘露糖也能顯著提高內(nèi)源甘露糖、果糖、半乳糖、木糖和來蘇糖的含量。結(jié)合這些研究結(jié)果，一方面說明白三葉葉片中不同糖類對干旱脅迫的響應(yīng)有所不同，另一方面證實甘露糖能誘導(dǎo)或維持多種單糖和多糖的積累，在白三葉應(yīng)對干旱脅迫過程中維持滲透調(diào)節(jié)和能量供給起重要作用，且為植株生長提供保障。此外，外施甘露糖也能顯著提高干旱脅迫下肌醇、丙三醇和松醇的含量。Yildizli等[28]研究顯示，外源噴施肌醇通過顯著降低細胞膜氧化傷害及調(diào)節(jié)葉片水分狀況從而有效提高胡椒(Capsicumannuum)幼苗抗旱性。丙三醇具有很強的水合作用，也涉及細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)，其積累有利于細胞抗凍和抗旱性的提高[29]。因此本研究中甘露糖誘導(dǎo)白三葉積累更多的糖醇也參與調(diào)節(jié)細胞滲透勢和抗氧化能力，進而提高白三葉抗旱性。

綜上所述，干旱脅迫顯著降低白三葉葉片含水量、葉綠素含量、葉綠素熒光和凈光合速率，導(dǎo)致膜脂過氧化加劇，細胞膜穩(wěn)定性降低，植株受損嚴重。但白三葉能夠通過提高自身水分利用效率及降低滲透勢以適應(yīng)干旱脅迫。外施適宜濃度的甘露糖(30 mmol·L-1)能顯著提高干旱脅迫下白三葉葉片光合作用、抗氧化和滲透調(diào)節(jié)能力，從而有效緩解干旱誘導(dǎo)的氧化傷害并維持良好的水分狀況，提高植株抗旱性。通過對不同糖及糖醇類代謝物含量變化的測定發(fā)現(xiàn)，不同糖類積累對干旱脅迫響應(yīng)有所不同，甘露糖能在正常及干旱條件下誘導(dǎo)多種糖和糖醇的積累，這既提高了干旱脅迫下細胞滲透調(diào)節(jié)能力，也為白三葉生長和代謝供能提供更多的可利用碳水化合物。