柳蕾，李琦涵

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所， 云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 昆明 650500

單純皰疹病毒(herpes simplex virus,HSV)引起的皰疹類疾病已成為全球性的健康問題之一[1]。單純皰疹病毒為人類皰疹病毒α家族的成員，包括單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)和單純皰疹病毒2型(herpes simplex virus type 2, HSV-2)[2]。HSV-1和HSV-2分別引起口唇皰疹和生殖器皰疹，并在三叉神經(jīng)節(jié)和骶背根神經(jīng)節(jié)潛伏感染[3]，還可通過母嬰傳播導(dǎo)致新生兒皰疹，引發(fā)較高的發(fā)病率和死亡率[4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年，全球15～49歲的人群中有4.17億人感染HSV-2，每年新增加的病例約有 1 900 萬，HSV-2引起的各類皰疹性疾病已成為最常見的性病之一[5]；且HSV-2與人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus 1,HIV-1)相關(guān)，可使感染HIV-1的概率增加3倍～5倍[6]。目前，尚無特異性的抗HSV-2藥物，因此研制出安全、有效的疫苗迫在眉睫。

1 HSV-2的概況

1.1 結(jié)構(gòu)與復(fù)制

HSV-2基因結(jié)構(gòu)是將雙鏈線性DNA基因組與結(jié)合蛋白包裹在衣殼蛋白中組成的二十面體核衣殼體[7]?；蚪M由兩個(gè)共價(jià)連接的片段組分構(gòu)成，即L(長)片段和S(短)片段[8]。HSV-2 DNA的長度約為152 kb，其G+C含量高達(dá)69%。衣殼由病毒蛋白VP5、VP19C、VP23、VP24、VP26以及UL6基因編碼的蛋白組成；在衣殼與包膜之間有一層由球狀病毒蛋白構(gòu)成的皮層蛋白，由病毒復(fù)制過程中與調(diào)節(jié)相關(guān)的20多種重要蛋白〔包括α-反式誘導(dǎo)因子(α-transinducing factor, α-TIF, 又稱為VP16)、病毒宿主關(guān)閉蛋白(virion host shutoff protein,VHS)或VP22、VP1-2等〕組成。包膜由脂質(zhì)雙層及其錨定的大約11種病毒糖蛋白組成，其中4種(gB，gD，gH和gL)是病毒進(jìn)入細(xì)胞的必需蛋白[7]。

病毒感染上皮細(xì)胞及黏膜始于病毒糖蛋白與存在于靶向細(xì)胞表面的黏多糖鏈的吸附作用。糖蛋白與細(xì)胞上特異的受體結(jié)合后，病毒包膜與靶向細(xì)胞的細(xì)胞膜融合，病毒侵入細(xì)胞，在細(xì)胞核中開始復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及核衣殼組裝[9]。基因復(fù)制后，晚期蛋白開始表達(dá)[10]。晚期蛋白在即刻早期蛋白以及早期蛋白的調(diào)控下形成病毒的結(jié)構(gòu)蛋白、包膜蛋白、皮層蛋白及糖蛋白。核衣殼形成后，病毒出細(xì)胞核至細(xì)胞質(zhì)中，依賴gH和gL兩種糖蛋白最終被排出細(xì)胞外[7]。

1.2 預(yù)防與治療

目前可通過使用安全套和抗病毒治療的方法來防止HSV-2的感染[11-12]。臨床常用于抗HSV藥物為阿昔洛韋、伐昔洛韋、泛昔洛韋等,可減少因HSV感染的發(fā)病率、傳染率和死亡率[12]，但抗病毒藥物具有一定的副作用，且在抑制潛伏感染方面也沒有明顯的臨床療效[13]。

2 HSV-2疫苗研究的現(xiàn)狀和進(jìn)展

多種動(dòng)物模型(包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔子和恒河猴)被用來探究HSV感染的免疫應(yīng)答、發(fā)病機(jī)制及疫苗效果，其中小鼠可用于研究HSV的急性感染、潛伏感染及神經(jīng)細(xì)胞感染，豚鼠和兔子常用于HSV感染的病毒重激活反應(yīng)等實(shí)驗(yàn)，大鼠和恒河猴則常用于對(duì)HSV所引起疾病特征的研究[14]。

由于HSV-2的基因結(jié)構(gòu)及感染過程復(fù)雜且存在潛伏感染重激活的情況，動(dòng)物模型也不能完全模擬人體感染病毒的特征，使得HSV-2疫苗的研發(fā)異常困難[3, 15]。

根據(jù)研究目的的不同，HSV-2疫苗分為兩大類：治療性疫苗和預(yù)防性疫苗。治療性疫苗用來減輕已被感染HSV-2人群(HSV-2血清陽性)的癥狀及傳染性；而預(yù)防性疫苗用于防止尚未被感染(HSV-2血清陰性)的人群感染HSV-2。根據(jù)類型的不同，HSV-2疫苗又可分為滅活疫苗、亞單位疫苗、復(fù)制缺陷疫苗、減毒活疫苗、DNA疫苗、多肽疫苗等。

2.1 滅活疫苗

早在20世紀(jì)30～40年代，從甲醛溶液泡過的動(dòng)物組織中提取的HSV，或用雞胚培養(yǎng)的病毒經(jīng)用紫外線照射、加熱或化學(xué)方法滅活處理后用作疫苗。1964年，使用從甲醛處理后的動(dòng)物組織中提取的病毒作為疫苗展開了全球第1次臨床試驗(yàn)，給感染生殖器皰疹的患者注射疫苗后，與對(duì)照組相比未出現(xiàn)明顯差異，提示疫苗并未起到明顯的保護(hù)作用[16]。但在小鼠模型中，經(jīng)甲醛處理后的滅活病毒加入佐劑單磷?；|(zhì)(amonophosphoryl lipid A,MPL)或鋁膠的疫苗肌內(nèi)注射接種小鼠，可在急性感染期及潛伏期起到保護(hù)作用[17]。

由于HSV滅活病毒的免疫原性低，且疫苗效力差，還可能有致癌的風(fēng)險(xiǎn)，目前人們已不再將滅活疫苗作為HSV-2的候選疫苗[11]。

2.2 亞單位疫苗

由HSV-2的糖蛋白構(gòu)建的重組亞單位疫苗gD2/gB2，是目前最常用的疫苗。Chiron等研發(fā)了由HSV-2的gD/gB加佐劑MF59構(gòu)建的疫苗[18]，可誘導(dǎo)26%的女性產(chǎn)生高效價(jià)抗體，且其保護(hù)作用可持續(xù)6個(gè)月，但對(duì)男性則無效[19]。2007年，GSK(Glaxo Smith Kline)公司研制的疫苗已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)，在gD及gB基礎(chǔ)上，病毒進(jìn)入細(xì)胞時(shí)必需的蛋白質(zhì)gD亦被加入用于構(gòu)建亞單位疫苗，對(duì)HSV-1及HSV-2血清反應(yīng)陰性的73%女性起到保護(hù)作用，但對(duì)男性、HSV-1及HSV-2血清反應(yīng)陽性的女性起不到保護(hù)作用[20]。該疫苗對(duì)部分女性的保護(hù)效果高于男性的原因可能緣于兩性生殖器的解剖學(xué)差異，使得疫苗在女性生殖器的黏膜組織中可能比在男性生殖器的表皮組織更容易引起免疫保護(hù)作用[19]。

以包含缺失的gD蛋白及部分感染細(xì)胞蛋白4(infected cell protein 4, ICP4)，再加入佐劑matrix-M2制成的亞單位疫苗GEN003，已進(jìn)入Ⅰ期臨床。Ⅰ期及Ⅱ期a臨床研究發(fā)現(xiàn)，接種人群在接受最有效的劑量后，針對(duì)gD2、ICP4的T細(xì)胞及中和抗體免疫應(yīng)答可持續(xù)升高，病毒增殖率減少了50%，在12個(gè)月內(nèi)具有保護(hù)作用[21-22]。目前Ⅱ期臨床正在評(píng)估GEN003的優(yōu)化配方[21]。

gD蛋白依然是亞單位疫苗的主要成分，未來將在gD蛋白基礎(chǔ)上對(duì)各類亞單位疫苗進(jìn)行改進(jìn)，使其在HSV-2血清陽性/陰性的男、女性中均有較好的免疫保護(hù)作用。

2.3 復(fù)制缺陷疫苗

已敲除一個(gè)或多個(gè)病毒復(fù)制必需基因的復(fù)制缺陷病毒(disabled infectious single cycle, DISC)只能在表達(dá)相應(yīng)基因的補(bǔ)充細(xì)胞系中增殖。因此，進(jìn)入人體后只能進(jìn)行1輪復(fù)制，具有較高的安全性。研究表明用復(fù)制缺陷的病毒免疫接種后，機(jī)體對(duì)野毒株的攻擊可產(chǎn)生保護(hù)性免疫[11, 20]。

2.3.1 預(yù)防性疫苗HSV529為敲除ul5和ul29的復(fù)制缺陷病毒，在動(dòng)物模型中表現(xiàn)出病毒脫落減少，致使疾病程度減輕，從而降低死亡率。目前已進(jìn)入臨床Ⅰ期試驗(yàn)。在臨床Ⅰ期，對(duì)血清陽性以及血清陰性患者的檢測，以及患者所引起的生殖器免疫反應(yīng)評(píng)估正在進(jìn)行中[23-24]。

具有us6基因(編碼糖蛋白gD)缺失的HSV-2(ΔgD-2)僅在表達(dá)HSV-2 gD的互補(bǔ)細(xì)胞系中增殖，只能進(jìn)行1輪病毒復(fù)制。在小鼠模型中，ΔgD-2是安全的、有免疫原性的。當(dāng) HSV-1和HSV-2攻擊時(shí)，疫苗免疫產(chǎn)生的抗體可提供陰道或皮膚的完全保護(hù)效果，具有進(jìn)行人體臨床實(shí)驗(yàn)的潛力[25]。

新型表達(dá)gD2的復(fù)制缺陷型病毒疫苗CJ2-gD2，可引發(fā)強(qiáng)烈的HSV-2特異性記憶CD4+和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。CJ2-gD2與野生型HSV-2感染細(xì)胞后均有效表達(dá)gD2，且兩者共感染細(xì)胞后，使野生型HSV-2復(fù)制能力降低。經(jīng)CJ2-gD2免疫的小鼠可在HSV-2陰道攻毒后降低病毒排放，減輕后肢癱瘓癥狀，減少生殖器病變，病死率亦隨之下降[26]。

2.3.2 治療性疫苗缺失ul22即缺失編碼糖蛋白gH的HSV-2突變毒株，有復(fù)制缺陷，只能在重組表達(dá) HSV-2ul22基因的細(xì)胞中生長。接種患者后在人體內(nèi)只能進(jìn)行1輪復(fù)制，不能2次感染細(xì)胞。以復(fù)制缺陷病毒疫苗為治療性疫苗，可降低免疫缺陷人群再次感染HSV-2時(shí)的重激活所引起的臨床癥狀。在豚鼠和小鼠模型上均表現(xiàn)出較好的免疫原性和安全性。對(duì)生殖器皰疹復(fù)發(fā)的患者進(jìn)行隨機(jī)、對(duì)照臨床試驗(yàn)，其安全性已被證明，但所產(chǎn)生的免疫效果與安慰劑對(duì)照組無明顯差異，還須進(jìn)一步探究[27]。

盡管復(fù)制缺陷疫苗的安全性已被證明，但該類病毒僅被敲除了極少數(shù)的基因(gD、ul22等)，在自然界中，如果因基因重組而恢復(fù)其野生病毒的復(fù)制能力，引起的后果將是不可想象的。同時(shí)，復(fù)制缺陷疫苗免疫效力還僅限于動(dòng)物模型，對(duì)人體的免疫力還未得到有效評(píng)估，安全性與免疫效力共存的復(fù)制缺陷疫苗正在研發(fā)中。

2.4 減毒活疫苗

HSV-2 0ΔNLS是HSV-2 ICP0-突變疫苗株，由于干擾素(interferon，IFN)-超敏反應(yīng)，其毒性在體內(nèi)明顯減弱。 接種HSV-2 0ΔNLS突變株后，機(jī)體表現(xiàn)出病毒傳播率和脫落率的降低，減少了發(fā)病率和死亡率。經(jīng)高劑量突變株免疫后機(jī)體可抵抗HSV-2的攻擊，在小鼠模型中表現(xiàn)出低毒力與免疫原性之間較好的平衡[28-29]，可產(chǎn)生比 gD2 亞單位疫苗高 10～100倍的保護(hù)效力，是一種具有潛力的HSV-2 候選減毒疫苗[29-30]。

核糖核苷酸還原酶(ICP10)的大亞基蛋白激酶結(jié)構(gòu)域缺失的HSV-2突變株被用于預(yù)防HSV-2感染和疾病的潛在疫苗。該病毒被命名為ICP10 ΔPK，缺乏PK活性和轉(zhuǎn)化潛能ICP10蛋白的表達(dá)。ICP10 ΔPK在小鼠模型上表現(xiàn)出較低的病毒拷貝數(shù)，且減少了病毒在小鼠中的潛伏數(shù)量，降低了病毒重激活能力，免疫動(dòng)物后產(chǎn)生HSV特異性體液和細(xì)胞免疫，對(duì)HSV-2感染及導(dǎo)致的疾病表現(xiàn)出較好的保護(hù)效果[31]。

BioVex生物技術(shù)公司開發(fā)的一種減毒活病毒疫苗ImmunoVex，敲除了與免疫逃逸相關(guān)基因從而可抑制HSV的病毒免疫逃避。除了HSV糖蛋白gC與C3b結(jié)合以抑制補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)的活化外，HSV也編碼阻斷IFN反應(yīng)和抑制抗原呈遞給CD8+T細(xì)胞的蛋白質(zhì)。通常情況下，被敲除的基因會(huì)抑制主要組織相容性抗原的呈遞、樹突細(xì)胞活化和IFN反應(yīng)。在豚鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，雙倍劑量的疫苗注射可誘導(dǎo)出較好的免疫應(yīng)答，目前正在進(jìn)行Ⅰ期臨床研究實(shí)驗(yàn)。希望此疫苗候選株可同時(shí)提供預(yù)防和治療的功效[19]。

HSV-2糖蛋白gE缺失突變株(gE2-del病毒)同樣作為具有復(fù)制能力的減毒活病毒疫苗候選株，不能從神經(jīng)元細(xì)胞體到軸突末端順行轉(zhuǎn)運(yùn)，其毒性較野生型毒株低5個(gè)數(shù)量級(jí)。在小鼠模型中，除非將以高滴度的gE2-del病毒直接注射到大腦中，其他接種途徑和劑量gE2-del病毒是安全的，且作為預(yù)防性和免疫治療性疫苗是有效的[11, 32]。

減毒活疫苗被敲除了與病毒毒力、潛伏力等相關(guān)的基因，在機(jī)體細(xì)胞中正常復(fù)制和增殖，可引起較強(qiáng)烈的CD4+和CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)，具有較高的免疫原性。但是減毒活疫苗可能會(huì)被重激活，與野生毒株發(fā)生基因重組，傳染給免疫能力低下者，對(duì)動(dòng)物及人體安全性造成潛在的威脅。未來在研究減毒活疫苗的過程中，在檢測其免疫效果的同時(shí)，對(duì)其安全性也應(yīng)進(jìn)行重點(diǎn)評(píng)估[19]。

2.5 DNA疫苗

DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗，是指將編碼某種蛋白質(zhì)抗原的重組真核表達(dá)載體直接注射到動(dòng)物體內(nèi)，使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生的抗原激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。

2.5.1 預(yù)防性疫苗大多數(shù)DNA疫苗采用加強(qiáng)免疫的方式，以便在人體中引起更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。而在之前的研究中，采取表達(dá)gD的質(zhì)粒載體與修飾過表達(dá)gD的重組牛痘病毒載體(MVA-gD2)相結(jié)合的方式。當(dāng)MVA-gD2載體初次免疫，之后再以MVA-gD2加強(qiáng)免疫時(shí)，對(duì)gD反應(yīng)IgG的抗體和針對(duì)HSV-2的中和抗體反應(yīng)最強(qiáng)，在小鼠模型和人體中均能發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞數(shù)目增加以及T細(xì)胞免疫反應(yīng)增強(qiáng)[19]。

2.5.2 治療性疫苗VCL-HB01，是由包含2個(gè)密碼子優(yōu)化基因(gD2+VP11/12)和佐劑Vaxfectin的構(gòu)成的DNA治療性疫苗。 在HSV-2血清陽性人群的Ⅰ/Ⅱ期研究中，疫苗接種者經(jīng)過9個(gè)月病變程度可降低57%，檢測到的病毒的拷貝數(shù)也減少，且能夠引起ul46特異性的T細(xì)胞免疫反應(yīng)[20]。

另一種DNA治療性疫苗候選株為COR-1，包含密碼子優(yōu)化基因gD2和由泛素溶解而縮短的gD2，能增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的產(chǎn)生。臨床Ⅰ期檢驗(yàn)中，COR-1對(duì)HSV-1/2血清陰性者是安全的，且能夠引起gD1特異性的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，但不能引起抗體反應(yīng)[33]。COR-1的臨床II期結(jié)果評(píng)估即將進(jìn)行[20]。

由以上可知，DNA疫苗采用加強(qiáng)免疫方式并加以佐劑輔助會(huì)引起免疫反應(yīng)的增強(qiáng)作用。

2.6 多肽疫苗

單一的免疫顯性T 細(xì)胞抗原表位或中和抗體抗原表位可以使機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)，因此可使用單一的合成多肽來使機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從而得到免疫保護(hù)效果[3]，HSV-2的多肽疫苗通常是以T細(xì)胞表位或者B細(xì)胞表位作為疫苗的免疫原[11]。

2.6.1 預(yù)防性疫苗常見類型的限制性表位在gB2的HLA上，A * 0201表位與其佐劑熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)的免疫接種Ⅰ期臨床試驗(yàn)已開始。該研究旨在確定肽“接受者”是否可以引發(fā)高水平的針對(duì)HSV抗原的CD8+T細(xì)胞特異性免疫反應(yīng)。 HSV血清陰性者和HSV-2血清陽性者均會(huì)作為受試者[34]。

Pan等的研究發(fā)現(xiàn)，HSV-2糖蛋白gB、gC、 gE、gG、gI的抗原多肽表位gB2466-473、gC2216-223、gE2483-491、gG2572-579 和 gI2286-295接種小鼠后均可產(chǎn)生抗體，對(duì)HSV-2引起中和反應(yīng)[35]。

2.6.2 治療性疫苗治療性疫苗HerP V由HSV-2的32種35聚HSV-2多肽與重組HSP70非共價(jià)連接后構(gòu)成，且這些多肽來自HSV-2各個(gè)復(fù)制周期的22個(gè)蛋白。Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，HerP V在HSV-2陽性受試者中誘導(dǎo)出明顯的CD4+T和CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)。此候選株免疫接種HSV-2陽性受試者后可同時(shí)引起針對(duì)HSV-2抗原強(qiáng)烈的CD4+T和CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)，也是首個(gè)基于人類HSP針對(duì)病毒抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的疫苗候選株[36]。

與HSV識(shí)別相關(guān)的糖蛋白抗原多肽是構(gòu)建多肽疫苗時(shí)的重點(diǎn)選擇，將此類抗原多肽與人體重組蛋白組合可達(dá)到更好的免疫保護(hù)效果。

3 展望

HSV-2嚴(yán)重影響了人類的健康，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)生殖器皰疹已經(jīng)成為青少年的主要傳染性疾病之一。但針對(duì)發(fā)病率較高，且對(duì)公共衛(wèi)生具有明顯積極意義的HSV-2疫苗研發(fā)，經(jīng)過若干技術(shù)策略的改進(jìn)和不同規(guī)模的臨床試驗(yàn)，仍然沒有得到明確的結(jié)果。多種類型的疫苗候選株已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段，而研究人員也在不斷地探索新的方法，使HSV-2疫苗的成功研發(fā)成為可能。

近日，通過傳統(tǒng)的酶切和質(zhì)粒基因重組方法構(gòu)建出一系列HSV-2突變株，分別缺失了LAT中的TATA box，ICP-4連接位點(diǎn)，miR-I、miR-II基因片段。在豚鼠模型中，可降低急性期HSV-2在體內(nèi)的病毒載量和組織損傷，但是不能預(yù)防病毒的重激活。也許通過此類方法可以構(gòu)建出缺失LAT其他片段的突變株，以其在急性期和潛伏期方面均能產(chǎn)生較好的抗病毒能力[37]。

近來，一種運(yùn)用納米技術(shù)構(gòu)建的樹突狀大分子及多陰離子的微生物殺滅劑(microbicides)，可抑制病毒進(jìn)入并可引起較強(qiáng)烈的抗病毒免疫反應(yīng)。此微生物劑可針對(duì)病毒進(jìn)入的關(guān)鍵分子gB、gD、gH/gL和硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)形成抑制分子，阻止病毒進(jìn)入。而在后期臨床的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，期望此微生物劑本身可以具有很強(qiáng)的疫苗效力或者與其他疫苗協(xié)同作用發(fā)揮更大的作用，作為將來HSV-2的治療性疫苗或預(yù)防性疫苗[38]。

另有實(shí)驗(yàn)室利用CRISPR/Cas9 的技術(shù)，通過定向的基因突變方法改造HSV-1，克隆構(gòu)建出了具有特定突變基因的缺失突變株。其在急性期和潛伏期均能起到較好的減毒作用和免疫效果[39-40]，雖然還未達(dá)到理想狀態(tài)，但也為將來HSV-2疫苗的研究提供了一些思路。相信通過科學(xué)與技術(shù)的不斷改進(jìn)，最終可以研制出安全性與疫苗效力并存的HSV-2疫苗，HSV-2的有效控制將為可實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)。