孫雅，趙詠梅，齊光照，李婷婷，孟海陽，朱振峰

論著

虎杖苷與順鉑聯(lián)合增強(qiáng)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的凋亡作用

孫雅，趙詠梅，齊光照，李婷婷，孟海陽，朱振峰

考察虎杖苷和順鉑聯(lián)合給藥對人卵巢癌 SKOV3 細(xì)胞增殖及凋亡的作用機(jī)制。

SKOV3 細(xì)胞分為虎杖苷和順鉑分別及聯(lián)合給藥組，采用 MTT 法檢測對細(xì)胞增殖抑制的影響；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡率，并觀察細(xì)胞晚期凋亡（48 h）的形態(tài)學(xué)變化；Western blot 檢測凋亡蛋白和線粒體通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。

MTT 結(jié)果顯示SKOV3 細(xì)胞在虎杖苷和順鉑聯(lián)合給藥后明顯降低細(xì)胞存活率，且呈時(shí)間和濃度依賴性；單克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示虎杖苷與順鉑聯(lián)合給藥抑制細(xì)胞增殖的能力增強(qiáng)；AnnexinV-FITC 單染檢測細(xì)胞凋亡率顯示，與順鉑給藥組相比，聯(lián)合給藥組細(xì)胞凋亡率增加 11.5%；Western blot 檢測結(jié)果表明聯(lián)合給藥組與順鉑單藥給藥組相比，凋亡蛋白 cleaved PARP、cleaved caspase-9 的表達(dá)均增強(qiáng)；線粒體凋亡相關(guān)蛋白 Bax 升高，Bcl-2 降低。

虎杖苷和順鉑聯(lián)用能增強(qiáng)順鉑對細(xì)胞增殖的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，初步闡明聯(lián)合給藥的抗癌機(jī)制是通過線粒體凋亡途徑所介導(dǎo)。

順鉑； 細(xì)胞凋亡； 絲裂原激活蛋白激酶類； 虎杖苷

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，且致死率較高。美國國立癌癥研究院（NCI）調(diào)查顯示，卵巢癌的致死率約占女性生殖系統(tǒng)腫瘤死亡率的一半[1]。目前，對卵巢癌的手術(shù)治療尚不十分成熟，因?yàn)槁殉舶O易發(fā)生轉(zhuǎn)移，雖然以鉑類藥物為主的化療能在一定程度上彌補(bǔ)手術(shù)治療的局限，但由此引發(fā)的化療耐藥問題已成為卵巢癌治療的難題。

隨著近年來對中藥抗癌療法的深入研究，天然來源的抗癌化合物越來越受到關(guān)注?；⒄溶帐且环N天然的多酚類化合物，主要存在于虎杖這一傳統(tǒng)中草藥中，目前已收錄于《中國藥典》[2]。研究表明，虎杖苷具有抗心血管疾病、抗氧化、抗炎、防治腫瘤、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)等廣泛的藥理學(xué)活性。其中，虎杖苷因?qū)Χ喾N惡性腫瘤具有獨(dú)特抗腫瘤作用而備受關(guān)注。已有研究表明虎杖苷能夠誘導(dǎo)急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡[3]；誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的增殖周期停滯，誘發(fā)其凋亡[4]；還通過上調(diào) Bax/Bcl-2 蛋白的比例和減弱 β 反應(yīng)蛋白信號抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖[5]。迄今為止，虎杖苷抗卵巢癌研究報(bào)道較少。本研究旨在探索虎杖苷能否增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性，從而減少化療耐藥的問題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 虎杖苷購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號D1713186，純度≥ 98%；MTT 粉末和二甲基亞砜購自廣州賽國生物科技有限責(zé)任公司；Annexin V-FITC 染色細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和 JC-1 試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；所有一抗抗體均購自美國 Cell Signaling Technology 公司；順鉑和 Hoechst33258 染色液、小鼠抗 β-actin、山羊抗兔 IgG、山羊抗小鼠 IgG 均購自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.1.2 細(xì)胞 人卵巢癌細(xì)胞系 SKOV3 購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。

1.1.3 主要儀器 311 型氣套二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國 Thermo Fisher Scientific 公司；CKX41 倒置顯微鏡購自日本 Olympus 公司；Spectra Max Plus 384 酶標(biāo)儀和 ImageXpress 高內(nèi)涵成像系統(tǒng)購自美國 Molecular Devices 公司；BD C6 流式細(xì)胞儀購自美國BD 公司；TS-2000A 脫色搖床購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Mini-Protean@Tetra 電泳槽、Mini Trans-Blot 轉(zhuǎn)印槽和 ChemiDOCTMXRS+分子成像系統(tǒng)購自美國 Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將 SKOV3 細(xì)胞以適量濃度分別接種于培養(yǎng)瓶中，分別加入含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基，置于 37 ℃、5% CO2及 95% 相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞呈貼壁狀態(tài)生長，每周傳代 2 ~ 3 次，用 0.25% 胰酶消化 2 ~ 3 min 傳代。

1.2.2 MTT 法 取對數(shù)生長期的 SKOV3 細(xì)胞，0.25% 胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為 5 × 104個(gè)/ml，每孔接種 100 μl，培養(yǎng)24 h。設(shè)置不同濃度的虎杖苷（10、20、40、60、80、100 μmol/L）6 個(gè)劑量組，對照組為RPMI1640培養(yǎng)基；順鉑 5 μmol/L 與以上 6 個(gè)不同劑量的虎杖苷聯(lián)合作用，對照組為順鉑（5 μmol/L）。每組各設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔，給藥后繼續(xù)培養(yǎng) 24 和 48 h。每孔加 20 μl MTT 繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。棄原液，每孔加 150 μl DMSO，振蕩器振蕩 10 min，以 570 nm 為檢測波長，630 nm 為參照波長，用酶標(biāo)儀檢測各孔的吸光度（），按下列公式計(jì)算不同濃度藥物作用后腫瘤細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組/對照組）× 100%。用同樣的方法設(shè)置 5 個(gè)不同濃度的順鉑（1.5、3、6.25、12.5、25 μmol/L）給藥組，對照組為RPMI1640 培養(yǎng)基，給藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 和 48 h，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3 單克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的 SKOV3 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為（4 ~ 5）× 102個(gè)/ml，每孔 2 ml 接種于 6 孔培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，棄去原有的培養(yǎng)液，分別加入虎杖苷10 μmol/L，虎杖苷 20 μmol/L，順鉑2.5 μmol/L，虎杖苷10 μmol/L+ 順鉑2.5 μmol/L以及虎杖苷20 μmol/L+ 順鉑2.5 μmol/L，RPMI1640 培養(yǎng)基組作為空白對照組，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h 后撤去加藥的培養(yǎng)基，換成正常的新鮮培養(yǎng)基放于 37 ℃、5 % CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，且每隔 2 ~ 3 天換液，并于光學(xué)顯微鏡下觀察克隆的形成。大約 15 d后，6 孔板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，用每孔 1 ml 的 PBS 清洗 2 次，每孔加 1 ml 的 4% 多聚甲醛固定 30 min，棄去固定液，用PBS 清洗 2 次。每孔加入 1 ml 結(jié)晶紫染色液染色20 min 左右，然后用 PBS 緩慢洗去染色液，置于空氣中干燥后拍照處理。

1.2.4 Hoechst33258 觀察細(xì)胞核形態(tài) SKOV3 細(xì)胞 1 × l05個(gè)/孔接種于 96孔板，置于 37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，24 h 后加入虎杖苷20 μmol/L 以及虎杖苷20 μmol/L+ 順鉑5 μmol/L，同時(shí)設(shè)定終濃度< 0.1%（v/v）的 DMSO 為溶劑對照組，作用24 h 后，取出用 PBS 清洗細(xì)胞 2 次，然后用 4% 多聚甲醛固定 30 min，用 PBS 清洗兩次，接著每孔加入 200 μl Hoechst33258 染液，終濃度為5 μg/ml，37 ℃避光染色 30 min。染色結(jié)束后用 ImageXpress 高內(nèi)涵成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.2.5 AnnexinV-FITC測定細(xì)胞凋亡 將對數(shù)生長期的 SKOV3 細(xì)胞接種于 6 孔板中，培養(yǎng)24 h；按照實(shí)驗(yàn)需要將細(xì)胞分為不加藥組、虎杖苷80 μmol/L組、順鉑5 μmol/L組、虎杖苷80 μmol/L+ 順鉑5 μmol/L組。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，0.25% 胰酶消化，1000 r/min 離心 5 min。收集細(xì)胞，PBS洗兩遍，加入 500 μl binding buffer 重懸細(xì)胞；加入 5 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育 20 min；流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長為 488 nm，發(fā)射波長為 530 nm。

1.2.6 Western blot 檢測虎杖苷與順鉑聯(lián)用對凋亡信號通路的影響 收集總細(xì)胞，提取總蛋白，將提取到的蛋白樣品用 BCA 法進(jìn)行相對定量，將各組蛋白含量調(diào)至相同濃度；按 Western blot 常規(guī)操作，用 10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），通過半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上，5% 脫脂牛奶封閉后結(jié)合一抗（抗體稀釋比均為 1:1000），4 ℃孵育過夜；次日洗滌后結(jié)合二抗（抗體稀釋比 1:5000），經(jīng)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影、定影，以 β-actin 為內(nèi)參照，用 ImageJ 軟件測定各組蛋白的灰度值，除以內(nèi)參蛋白 β-actin 的灰度值，所得結(jié)果為各蛋白的相對值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 虎杖苷與順鉑聯(lián)用對 SKOV3 細(xì)胞生長的影響

2.1.1 MTT 檢測細(xì)胞活性 虎杖苷單獨(dú)用藥和順鉑單獨(dú)用藥對卵巢癌SKOV3細(xì)胞 24、48 h 的細(xì)胞存活率比較如圖 1A所示；24 h 的虎杖苷、順鉑、虎杖苷+順鉑聯(lián)合組的 IC50分別為（257.3 ± 5.9）、（14.4 ± 2.7）、（190.5 ± 7.3）μmol/L，CI50= 1.08 ± 0.2，CI ≤ 1.1，為疊加作用；48 h 的虎杖苷、順鉑、虎杖苷+ 順鉑聯(lián)合組的 IC50分別為（175.7 ± 6.3）、（8.8 ± 2.1）、（13.8 ± 4.5）μmol/L，CI50= 0.68 ± 0.14，CI < 0.8，為中度協(xié)同作用（圖 1B）。結(jié)果表明虎杖苷與順鉑聯(lián)合作用 48 h 對抑制 SKOV3 細(xì)胞生長有協(xié)同作用。

圖 1 虎杖苷與順鉑聯(lián)用對SKOV3 細(xì)胞生長的影響（A：MTT 法檢測SKOV3 細(xì)胞經(jīng)虎杖苷和順鉑分別作用后的存活率；B：MTT 法檢測SKOV3 細(xì)胞經(jīng)虎杖苷與順鉑聯(lián)用后的存活率，與虎杖苷組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；C：SKOV3 細(xì)胞經(jīng)虎杖苷、順鉑、虎杖苷+ 順鉑組處理48 h 后的單克隆形成）

Figure 1 The survival rate of SKOV3 after treated with different concentrations of polydatin and cisplatin [A: MTT assay of cell viability of SKOV3 cells were treated with different concentrations of polydatin and cisplatin; B: MTT assay of cell viability of SKOV3 cells were treated with polydatin and cisplatin,*< 0.05 and**< 0.01, compared to polydatin group; C: SKOV3 cells were treated with different concentrations of polydatin and cisplatin (48 h) and colony formation was assessed by staining with crystal violet]

1：空白對照組；2：順鉑 5 μmol/L；3：順鉑 5 μmol/L + 虎杖苷 20 μmol/L；4：順鉑 5 μmol/L + 虎杖苷 40 μmol/L；5：順鉑 5 μmol/L + 虎杖苷 80 μmol/L

Figure 2 The influence of polydatin on apoptosis of SKOV3 cells induced by cisplatin (A: SKOV3 cells were incubated with polydatin and cisplatin for 24 h, observed using a confocal microscopy; B: SKOV3 cells were pretreated with polydatin and cisplatin for 48 h, and apoptosis rates were analyzed by flow cytometry; C: The expression levels of PARP, cleaved PARP, caspase-9, cleaved caspase-9 were detected by Western blot; D: The expression levels of Bax and Bcl-2 in SKOV3 cells after treated with polydatin and cisplatin, were detected by Western blot;*< 0.05 and**< 0.01, compared to non-treated control)

2.1.2 單克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖抑制作用 圖1C結(jié)果顯示虎杖苷與順鉑聯(lián)合作用后對SKOV3 細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)?；⒄溶諉为?dú)作用卵巢癌細(xì)胞的抑制增殖作用不甚顯著，但當(dāng)其與順鉑（2.5 μmol/L）聯(lián)用時(shí)，20 μmol/L 的虎杖苷明顯抑制細(xì)胞增殖。

2.2 虎杖苷與順鉑聯(lián)用對 SKOV3 細(xì)胞凋亡的影響

2.2.1 免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞核形態(tài) 核皺縮是細(xì)胞凋亡前期的一個(gè)明顯標(biāo)志。虎杖苷20 μmol/L 濃度作用于卵巢癌 SKOV3 細(xì)胞后，可見細(xì)胞核形態(tài)變化不大，幾近于正常細(xì)胞，說明虎杖苷單獨(dú)作用對 SKOV3 細(xì)胞形態(tài)影響較小，但與順鉑聯(lián)合作用后出現(xiàn)細(xì)胞核縮小、染色質(zhì)固縮等形態(tài)變化（圖 2A）。說明虎杖苷與順鉑聯(lián)用有增強(qiáng)卵巢癌 SKOV3 細(xì)胞核損傷的作用。

2.2.2 AnnexinV-FITC 檢測細(xì)胞凋亡率 空白對照組凋亡率為（1.9 ± 2.5）%，虎杖苷組凋亡率為（11.5 ± 3.6）%，順鉑組凋亡率為（16.1 ± 3.1）%，虎杖苷+ 順鉑組凋亡率為（27.6 ± 4.5）%，聯(lián)合作用組與單獨(dú)用藥組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）（圖 2B）。

2.2.3 Western blot 檢測凋亡相關(guān)蛋白 caspase 家族蛋白以及線粒體蛋白Bax/Bcl-2 表達(dá) Western blot檢測各目的蛋白的表達(dá)，虎杖苷與順鉑聯(lián)合作用 SKOV3 細(xì)胞后凋亡蛋白 cleaved PARP、cleaved caspase-9 的表達(dá)均較對照組增強(qiáng)（圖 2C）?；⒄溶张c順鉑聯(lián)合組線粒體凋亡相關(guān)蛋白 Bax 較對照組有升高，Bcl-2 較對照組有降低（圖2D）。說明虎杖苷與順鉑聯(lián)用對線粒體凋亡通路有重要影響。

3 討論

卵巢癌的化療耐藥及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是世界醫(yī)學(xué)界待攻克的一大難題，需要研究新藥物和新的治療策略來改善卵巢癌的預(yù)后。許多研究表明，中藥成分開發(fā)正在成為發(fā)現(xiàn)抗癌藥物的新方法[6]。中藥虎杖系蓼科植物，具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰等功效。其核心成分是虎杖苷，在腫瘤治療方面具有較高的藥用價(jià)值[7]。我們的研究表明虎杖苷能增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對順鉑的藥物敏感性，兩者聯(lián)用具有協(xié)同作用，能使細(xì)胞凋亡增強(qiáng)。

細(xì)胞凋亡是一種程序性死亡，是引起癌細(xì)胞死亡的一種重要方式。凋亡過程涉及多種信號傳導(dǎo)途徑的調(diào)控，目前已證明的有線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和死亡受體途徑[8-9]。其中線粒體在細(xì)胞凋亡中起著決定性作用，包括：激活細(xì)胞色素 C、釋放 caspase 家族蛋白、喪失電子轉(zhuǎn)移功能、使線粒體跨膜電位降低以及影響 Bcl-2 家族蛋白的表達(dá)等[10-11]。研究表明，大多數(shù)抗腫瘤藥物可通過內(nèi)源性線粒體途徑發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，即通過破壞線粒體而激活上游的 caspase-9 基因，進(jìn)一步活化下游的 caspase 家族基因，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)虎杖苷與順鉑聯(lián)用后對卵巢癌細(xì)胞的生長增殖具有抑制作用，且隨著聯(lián)合濃度的升高，細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡現(xiàn)象。并進(jìn)一步用 Western blot 檢測凋亡相關(guān)蛋白 caspase 家族蛋白 caspase-9、PARP 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨著聯(lián)合濃度增強(qiáng)，cleaved caspase-9 和 cleaved PARP 出現(xiàn)明顯表達(dá)。此外，我們檢測了線粒體相關(guān)蛋白 Bax 與 Bcl-2 的表達(dá)。結(jié)果顯示，線粒體促凋亡蛋白 Bax 表達(dá)增強(qiáng)、抗凋亡蛋白 Bcl-2 降低，由此說明虎杖苷與順鉑聯(lián)用是通過激活內(nèi)源性線粒體途徑而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，虎杖苷能增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對順鉑的藥物敏感性，兩者聯(lián)用能使卵巢癌細(xì)胞凋亡增強(qiáng)，而凋亡機(jī)制主要是涉及線粒體凋亡途徑的發(fā)生。這為臨床治療卵巢癌提供了新思路。我們應(yīng)該著力從傳統(tǒng)中藥中尋找有效成分，與臨床抗癌藥物聯(lián)合治療，以增強(qiáng)藥物敏感性，降低耐藥行為的發(fā)生。

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Effect of polydatin in combination with cisplatin on the apoptosis in human ovarian cancer cell line SKOV3

SUN Ya, ZHAO Yong-mei, QI Guang-zhao, LI Ting-ting, MENG Hai-yang, ZHU Zhen-feng

We aim to observe the effect of polydatin in combination with cisplatin on the proliferation and apoptosis in human ovarian cancer cell line SKOV3 and investigate its mechanism.

The survival rate of SKOV3 cells was detected using MTT method, after treatment with different concentrations of polydatin, cisplatinor both polydatin and cisplatin. The apoptosis rate and morphological changes of late apoptosis were measured by Annexin V-FITC staining and the Hoechst33258 staining method, respectively. The expression of Bax, Bcl-2, cleaved caspase-9, and cleave PARP was measured by Western blot.

MTT results showed that SKOV3 cells significantly decreased cell viability after combined administration of polydatin and cisplatin in a time- and concentration-dependent manner; monoclonal results showed that the combination of polydatin and cisplatin inhibited cell proliferation. Annexin V-FITC single staining showed that the apoptosis rate of the combined administration group was increased by 11.5% compared with the cisplatin administration group. The Western blot test showed that the combined administration group was compared with the single drug administration group. The expression of cleaved PARP and cleaved caspase-9 was increased. The mitochondrial apoptosis-related protein Bax increased and Bcl-2 decreased.

Polydatin can enhance the anticancer effect of cisplatin on SKOV3 cells by promoting apoptosis.

Cisplatin; Apoptosis; Mitogen-activated protein kinases; Polydatin

ZHU Zhen-feng, Email: zhenfeng1997@sina.com

Author Affiliations: Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Henan 450053, China (SUN Ya, ZHAO Yong-mei, QI Guang-zhao, MENG Hai-yang, ZHU Zhen-feng); Department of Pharmacology, School of Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing 210038, China (LI Ting-ting)

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.06.005

國家自然科學(xué)基金（81503150）；河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（201303026）；北京醫(yī)衛(wèi)健康公益基金會(huì)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究基金（YWJKJJHKYJJ-B16239）

450053 河南，鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部（孫雅、趙詠梅、齊光照、孟海陽、朱振峰）；210038 南京，中國藥科大學(xué)藥學(xué)院藥理系（李婷婷）

朱振鋒，Email：zhenfeng1997@sina.com

2019-09-03