宋清梅，蔡信德，吳穎欣，吳嘉慧，陳顯斌，吳文成

（生態(tài)環(huán)境部華南環(huán)境科學研究所，廣州510655）

土壤重金屬污染作為全球性環(huán)境熱點問題，多年來一直備受社會各界的廣泛關(guān)注[1]。圍繞重金屬污染土壤治理修復和風險管控技術(shù)研發(fā)，眾多學者開展了大量研究工作。其中，植物修復因具有經(jīng)濟高效、環(huán)境友好和適用于大面積污染修復等優(yōu)點，成為近年來關(guān)注的熱點[2]。重金屬污染的植物修復技術(shù)主要包括植物萃?。≒hytoextraction）和植物固定（Phytostabilization）[3]。植物萃取是利用富集植物將土壤中的重金屬吸收和富集，并從植物根部轉(zhuǎn)運到莖、葉等地上部分，通過收割地上部分從而達到去除土壤中重金屬的效果[4]；植物固定是通過植物和根際分泌物對土壤中重金屬的吸收積累、螯合及沉淀作用，降低其生物有效性和移動能力，控制其在環(huán)境中遷移和擴散能力[5]。前者一般應用于低、中度重金屬污染的農(nóng)田土壤，而后者主要應用于重金屬嚴重污染的礦區(qū)和工業(yè)污染場地[6-7]。

香根草（Vetiveria zizanioides）屬于禾本科巖蘭草屬多年生大型草本植物，因其具有生物量大、根系發(fā)達、適應性強、生長周期短及經(jīng)濟價值高等優(yōu)點，而被廣泛應用于水土保持、退化生態(tài)系統(tǒng)恢復和污染物生物修復等領(lǐng)域[8]?，F(xiàn)有研究表明，香根草對多種高濃度重金屬（如Pb 和Cu 等）具有較強的耐受性和較高的富集能力，能把大部分重金屬積累在根部，對重金屬污染土壤，尤其是礦區(qū)和工業(yè)場地等污染較嚴重的土壤修復效果顯著，具有植物固定修復的潛力[9-13]。目前，國內(nèi)外學者對香根草修復重金屬污染土壤的研究主要集中在單一時間點、不同濃度的重金屬處理對香根草生理生態(tài)效應及其體內(nèi)的重金屬累積規(guī)律等方面，且研究對象多為成年植株，而重金屬對香根草種子萌發(fā)和幼苗生長階段在時間尺度上的脅迫效應鮮見報道[3，14-16]。鑒于種子萌發(fā)和幼苗生長是植物生命周期的重要階段，對外界環(huán)境變化最為敏感，開展此階段植物對重金屬脅迫響應的研究對深入探討植物對重金屬脅迫的適應性機制具有重大意義[17-18]。

一般而言，土壤重金屬的生物毒性隨其總量增加而增加[19]。但大量研究揭示，土壤重金屬的生物有效性和生物毒性更大程度上取決于土壤重金屬的化學形態(tài)[20-21]。其中，土壤重金屬水溶態(tài)主要以離子態(tài)和溶解性有機絡(luò)合態(tài)存在，最容易被植物吸收和積累，是引起植物毒害效應的主要形態(tài)[22-24]，在重金屬污染土壤植物修復工作中，其對植物的脅迫作用不容忽視。在自然環(huán)境中，土壤重金屬的形態(tài)分布受各種環(huán)境的綜合影響，且通常呈現(xiàn)出復合污染[25]，因此，從環(huán)境中采集重金屬復合污染土壤，模擬重金屬水溶態(tài)組分對香根草脅迫的研究具有現(xiàn)實意義。

本文以Pb 和Cu 復合污染土壤為研究對象，模擬土壤中水溶態(tài)重金屬組分對香根草種子萌發(fā)、幼苗生長的影響和植株各部分重金屬積累的動態(tài)變化，探討重金屬復合污染土壤重金屬水溶態(tài)組分對香根草種子萌發(fā)和幼苗早期的脅迫作用，以期為利用香根草對重金屬污染土壤進行植物修復提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物材料香根草種子和培養(yǎng)土均購自廣州市花卉園藝市場，其中培養(yǎng)土主要成分為天然泥炭土。供試土壤采自廣東省清遠市龍?zhí)伶?zhèn)電子廢物拆解場地，該場地土壤呈現(xiàn)較強酸性（pH 為4.3），且受重金屬復合污染（表1），Pb、Cu 和Cd 含量遠高于廣東省土壤背景值，其中Pb 和Cu 含量遠高于《土壤重金屬風險評價篩選值珠江三角洲》（DB 44/T 1415—2014）居住用地標準，水提取液Pb 含量屬于《地下水質(zhì)量標準》（GB/T 14848—2017）Ⅴ類水質(zhì)，可能對生態(tài)環(huán)境存在較大的威脅。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 種子萌發(fā)試驗

參考《土壤質(zhì)量有效態(tài)鉛和鎘的測定原子吸收法》（GB/T 23739—2009）中提取方法的固液比，稱取100 g風干的重金屬污染土壤于1 L玻璃錐形瓶中，加入500 mL 蒸餾水，恒溫振蕩4 h（150 r·min-1），取出靜置，過濾后獲得土壤水提取液（水溶態(tài)重金屬組分）。測定的重金屬含量見表1。

表1 土壤及其水提取液重金屬含量Table 1 The concentration of heavy metals in soils and their aqueous extracts

挑選顆粒飽滿、大小一致的香根草種子，用5%次氯酸鈉溶液消毒5 min 后，依次經(jīng)自來水和蒸餾水漂洗干凈，挑選25 粒均勻播種于經(jīng)高壓滅菌的培養(yǎng)皿（D=12 cm）中，皿底部預先鋪放兩層無菌濾紙作為發(fā)芽床并添加5 mL污染土壤水提取液潤濕，設(shè)置3個重復。空白對照組以無菌蒸餾水代替污染土壤水提取液。然后迅速將培養(yǎng)皿加蓋，置于溫度為25 ℃、濕度為70%的人工氣候培養(yǎng)箱中，采用12 h 光照、12 h黑暗交替培養(yǎng)，每2 d 定量補充污染土壤水提取液或無菌蒸餾水。將胚根出現(xiàn)認定為種子萌發(fā)，每2 d 定時觀察并記錄發(fā)芽情況，10 d后測定總發(fā)芽率。

采用修改后的Timson指數(shù)表示種子發(fā)芽速率[26]：

式中：G表示每隔2 d 的種子發(fā)芽率；t表示相應的發(fā)芽天數(shù)。T數(shù)值越大，說明種子萌發(fā)得越快。

1.2.2 幼苗水培試驗

在培養(yǎng)土上對香根草種子進行萌發(fā)，幼苗培養(yǎng)2周后，挑選大小、高度一致的香根草幼苗（株高約10 cm），使用蒸餾水清洗干凈。將幼苗移栽到1/2 Hoagland 營養(yǎng)液中預培養(yǎng)3 d 后，按照污染土壤水溶態(tài)Pb、Cu 和Cd 的濃度進行重金屬脅迫處理，共設(shè)置12個重復，每個重復5 株幼苗。將水培盆栽置于溫室中培養(yǎng)，營養(yǎng)液連續(xù)溫和通氣，每2 d更換一次。對照組除不進行重金屬處理外，其他與處理組一致。分別在第15、30、45、60 d 隨機收獲對照組和處理組各3 盆整株植物樣本，用自來水和去離子水多次小心沖洗干凈，用吸水紙吸干表面水分并晾置20 min后，分成根部和地上部，記錄根長、株高及鮮質(zhì)量，然后置于烘箱中105 ℃殺青30 min，60 ℃干燥至恒質(zhì)量，測定干質(zhì)量。根據(jù)所采集的樣品量情況，第45 d和第60 d收獲的香根草根部和地上部分別進行Pb、Cu和Cd含量測定。

重金屬耐性指數(shù)（MTI）是指處理組植株干質(zhì)量和對照組植株干質(zhì)量的百分比，用于衡量香根草幼苗在重金屬脅迫下的生長能力[27]。轉(zhuǎn)移系數(shù)（TF）是指植物地上部與地下部重金屬含量的比值，用來衡量香根草對重金屬的轉(zhuǎn)運能力[16]。計算香根草的重金屬耐性指數(shù)和對各重金屬的轉(zhuǎn)運系數(shù)。

1.3 分析方法

植物樣品干燥后經(jīng)液氮處理進行研磨粉碎，采用硝酸-高氯酸法消解；土壤采用王水-高氯酸法消解；消解定容后的樣品與污染土壤提取液一致，均采用原子吸收分光光度計（PinAAcle 900T，美國PerkinElmer公司）測定Pb、Cu 和Cd 含量。分析中所使用的試劑均為優(yōu)級純以上，采樣和實驗用器皿用2%硝酸浸泡超過24 h，然后用超純水沖洗干凈備用。每批樣品均做兩個以上的空白試驗和20%的平行樣品，土壤和植物樣品分別采用土壤成分分析標準物質(zhì)——磚紅壤GBW 07407（GSS-7）和生物成分分析標準物質(zhì)——芹菜GBW 10048（GSB-26）進行質(zhì)控，各金屬回收率在90%～110%之間。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 16.0 對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用平均值±標準誤差表示，使用單因素方差分析（One-way ANOVA）對變量進行差異性檢驗；圖形繪制采用OriginPro 8.5軟件（Origin-Lab corporation，USA）完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 水溶態(tài)重金屬組分對種子萌發(fā)的影響

Pb 和Cu 復合污染土壤水溶態(tài)重金屬組分對香根草種子萌發(fā)速率和最終發(fā)芽率的影響均不顯著（圖1）。第2、4 d，處理組香根草種子的發(fā)芽速率低于對照組，第6～10 d，處理組的發(fā)芽速率逐漸高于對照組，但均未達到顯著差異（P＞0.05）。香根草的種子萌發(fā)速率很快，處理組在第2 d的Timson指數(shù)為19.3，此后一直維持較高的萌發(fā)速率，至第10 d，指數(shù)已高達42.3。污染土壤水溶態(tài)重金屬組分對香根草種子的最終發(fā)芽率產(chǎn)生了輕微促進作用，但未達到顯著差異水平（P＞0.05）。因此，香根草的種子萌發(fā)受污染土壤水溶態(tài)重金屬組分的影響較小，且萌發(fā)速度較快、發(fā)芽率較高，具有在重金屬復合污染土壤中定植的潛力。

2.2 水溶態(tài)重金屬組分對香根草幼苗生長的影響

2.2.1 根長和株高

植物的根長和株高是反映植物在污染環(huán)境中抗性和生長能力的重要指標。水溶態(tài)Pb 和Cu 對香根草幼苗的根長、株高產(chǎn)生較大的抑制作用（圖2A和圖2B），且對根長的抑制作用比株高更顯著。第15 d，處理組香根草幼苗根長受到顯著抑制（P＜0.05），但株高并未受到影響（P＞0.05）。第30 d，香根草幼苗的根長、株高分別比對照組低38.9%、39.7%，達到極顯著差異（P＜0.01）。此后，根長一直受到明顯抑制（P＜0.01），至第60 d，根長較對照組低43.6%。株高在第45 d 受到抑制作用的程度有所減弱（P＜0.05），但在第60 d，受到的抑制同樣達到極顯著水平（P＜0.01），較對照組低18.9%。

2.2.2 生物量

水溶態(tài)Pb 和Cu 對香根草幼苗鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的影響見圖2C和圖2D。與對照組相比，除第15 d，香根草幼苗生物量均受到了顯著或極顯著抑制（P＜0.05或P＜0.01），抑制作用強度隨時間呈現(xiàn)先升后降的規(guī)律。第15 d，處理組香根草幼苗的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量相較對照組均無顯著差異（P＞0.05）。隨著生長時間的增加，處理組生物量受到的抑制作用開始顯現(xiàn)，在第30～45 d，處理組幼苗鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均受到極顯著抑制（P＜0.01）。但在第60 d，處理組幼苗生物量受到的抑制作用有所減弱，此時仍達到顯著差異（P＜0.05），鮮質(zhì)量、干質(zhì)量分別較對照低43.8%、30.7%。與干質(zhì)量相比，處理組幼苗鮮質(zhì)量的減少更加顯著，即植株含水率下降。

圖1 水溶態(tài)重金屬組分對香根草種子萌發(fā)速率和最終發(fā)芽率的影響Figure 1 Effects of water-soluble components of heavy metals in contaminated soil on the seed germination speed and germination percentages of vetiver

圖2 水溶態(tài)重金屬組分對香根草幼苗根長、株高和生物量的影響Figure 2 Effects of water-soluble components of heavy metals on root length，shoot height and biomass of vetiver seedlings

2.2.3 耐性指數(shù)

由圖3 可知，香根草幼苗的MTI值隨生長時間的增加呈現(xiàn)先降后升的趨勢。在第15 d，香根草幼苗的MTI值為110.3%，可能因為處理的時間較短，幼苗體內(nèi)積累的重金屬含量較低，對植株生長抑制作用不明顯。幼苗MTI值在第30 d 達到最低值，為32.7%，說明隨著培養(yǎng)時間的增加，香根草幼苗體內(nèi)逐漸累積的重金屬對幼苗的生長產(chǎn)生了較強烈的抑制。但自第30 d 起，幼苗MTI值為上升趨勢，至第60 d 時，MTI值達到了70.2%。

圖3 水溶態(tài)重金屬組分脅迫下香根草幼苗的耐性指數(shù)Figure 3 The MTI of vetiver seedlings under the stress of water-soluble components of heavy metals

2.3 香根草幼苗對重金屬的富集程度

隨著生長時間的增加，處理組香根草幼苗根部的Pb 和Cu 含量和地上部Cu 含量均呈下降趨勢（圖4A，圖4C 和圖4D），地上部Pb 含量呈上升的趨勢（圖4B）。在第45 d，處理組幼苗根部和地上部的Pb和Cu含量均極顯著高于對照組（P＜0.01）。第60 d，處理組幼苗根部和地上部的Pb 和Cu 含量均顯著或極顯著高于對照組（P＜0.05或P＜0.01）。

香根草幼苗對Pb、Cu 的吸收和積累均主要發(fā)生在根部，根部最大積累量分別達到763 mg·kg-1和235 mg·kg-1，而地上部的Pb 和Cu 最大積累量僅為32.8 mg·kg-1和24.4 mg·kg-1。第60 d，處理組根部和地上部Pb 含量分別是對照組的124.3、17.9 倍，Cu 含量分別是對照組的9.41、1.80 倍。香根草幼苗對不同的重金屬富集能力不同，其對Pb的積累量較Cu大。

2.4 香根草幼苗對重金屬的轉(zhuǎn)運能力

香根草幼苗對Pb 和Cu 的TF值隨生長時間的增加而增大（表2），但TF值均小于1，說明香根草幼苗對這兩種重金屬元素從根部轉(zhuǎn)運到地上部的能力較弱。盡管處理組香根草幼苗根部富集的Pb 和Cu 含量較高，但其在香根草體內(nèi)的遷移受到很大的限制，其TF值均遠小于對照組，達到顯著或極顯著差異（P＜0.05或P＜0.01），說明香根草幼苗根系對重金屬有較強的滯留效果。香根草幼苗對不同重金屬的轉(zhuǎn)運能力存在差異，相較而言，對Cu的轉(zhuǎn)運能力強于Pb。

表2 香根草對Pb和Cu的轉(zhuǎn)運系數(shù)Table 2 Translocation factor of Pb and Cu in vetiver seedling

3 討論

種子萌發(fā)作為植物生命活動的開始，對植物的繁殖、生長和適應環(huán)境均有重大影響[18]?，F(xiàn)有研究證明，Pb 和Cu 對植物種子的萌發(fā)具有濃度效應，一般表現(xiàn)為低促高抑[28-29]，一定濃度的重金屬可通過打破種子的休眠而提高發(fā)芽率[30]。本研究中，Pb 和Cu 復合污染土壤的水溶態(tài)重金屬組分對香根草種子萌發(fā)速率的影響表現(xiàn)為前期抑制后期促進，對最終發(fā)芽率的影響表現(xiàn)為輕微促進，但與對照組并無顯著差異（P＞0.05）。這可能是由于污染土壤中水溶態(tài)重金屬組分比重較小，相對濃度較低，且香根草種子自身有較強的重金屬耐受性[31]，因而對其表現(xiàn)出低濃度促進的效應。因此，雖然土壤中重金屬水溶態(tài)組分被認為是造成植物危害的主要形態(tài)[24]，但由于其比重較小，即使在重金屬污染較嚴重的土壤中，其相應的重金屬水溶態(tài)組分也不一定會限制植物的種子萌發(fā)。

在污染物脅迫下能發(fā)芽并存活是修復植物的基本特征[32]。植物幼苗期生長是經(jīng)受重金屬脅迫的關(guān)鍵時期，已有報道表明，Pb 和Cu 對香根草幼苗的生長存在低濃度促進高濃度抑制的影響，具體表現(xiàn)因重金屬、植物種類及外部條件的不同而有所差異[14，16]。重金屬污染土壤對植物幼苗生長的抑制作用主要表現(xiàn)為抑制根伸長、降低株高、減少生物量，且土壤中重金屬濃度越高，其抑制作用越強[33-34]。本研究結(jié)果表明，香根草幼苗生長比種子萌發(fā)更容易受到水溶態(tài)Pb 和Cu 的脅迫，處理組香根草幼苗的根長、株高和生物量均受到了顯著或極顯著的抑制作用（P＜0.05或P＜0.01），這種抑制作用可能來自于植株內(nèi)富集重金屬毒性的直接作用或來自于對微量元素、水分獲取能力抑制的間接作用[14]。香根草幼苗根部對水溶態(tài)Pb和Cu 的脅迫比地上部更為敏感。根系是重金屬脅迫最直接的受害部位，當土壤受到重金屬污染時，根系受到的影響相對最為嚴重[35-36]，因此，幼苗根系受脅迫程度可反映重金屬對植物的生物毒性及植物對重金屬的忍耐能力[37]。本研究中，與對照相比，水溶態(tài)Pb和Cu處理的香根草幼苗鮮質(zhì)量減少幅度大于干質(zhì)量，即植株含水率出現(xiàn)下降現(xiàn)象，這與前人報道的高濃度Cu、Cd 脅迫引起香根草植株含水率和生物量下降的結(jié)果一致[14，16]。重金屬脅迫可能阻礙了香根草植株對于水分的輸送，從而影響了細胞對水分的吸收[38]。

圖4 香根草幼苗根部和地上部Pb和Cu的含量Figure 4 Pb and Cu concentration in root and aerial part of vetiver seedlings

MTI是用于篩選修復植物的最常用指標之一，可以用來衡量植物對某一濃度重金屬脅迫下的生長能力[39]，MTI值越高，表明植物對重金屬的耐受性越強，在重金屬污染區(qū)域存活和生長的可能性越大[40]。本研究結(jié)果表明，第30～60 d 香根草幼苗的MTI值均小于100%，為敏感-中度耐受級別[3]，但隨著生長時間的增加，MTI值呈上升趨勢，說明其耐受性逐漸增強。Gautam 等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，香根草在Pb、Cu、Zn 和Ni 等重金屬污染的土壤中培養(yǎng)180 d 后的MTI值均大于100%，屬于重金屬高耐受性植物。因此，可推斷香根草幼苗對重金屬的脅迫較成年植株敏感，在研究重金屬污染土壤修復植物耐受性時應重點關(guān)注植物幼苗期的脅迫響應。

植物的重金屬含量和轉(zhuǎn)移系數(shù)是衡量植物對重金屬耐受性的重要指標[14]。本研究結(jié)果表明，與對照組相比，處理組較高濃度的Pb 和Cu 使香根草幼苗的根部和地上部重金屬含量顯著增加，這也是處理組幼苗生長受到顯著抑制的主要原因[14]。隨著生長時間的推移，處理組香根草根部的Pb 和Cu 含量均呈下降趨勢，而地上部Pb 含量呈上升的趨勢。相應地，TF值也隨生長時間的增加而增大，說明香根草幼苗對重金屬從根部轉(zhuǎn)移到地上部的能力隨生長時間逐漸增強，從而提高對重金屬脅迫的抗性[41]。在不同生長階段，香根草幼苗根系的Pb 和Cu 含量均遠大于地上部，根部重金屬含量所占總量比例高達97.7%和90.6%，只有少量重金屬轉(zhuǎn)移到地上部。因此，香根草屬于根部重金屬積累型植物，這與前人研究的結(jié)論一致[16，42-43]。

TF可用于評估植物對單一重金屬的轉(zhuǎn)運能力，當TF大于1 時，說明植物將重金屬從地下部轉(zhuǎn)運到地上部的能力較強，可達到地下部重金屬的大量吸收，主要表現(xiàn)為耐性生長[16]。在本研究中，所有處理Pb 和Cu 的TF值均小于1。因此，香根草幼苗對兩種重金屬的轉(zhuǎn)運能力較弱，根系對重金屬有較強的滯留效果，這可能是由于大部分Pb 和Cu 被根際區(qū)域的分泌物固定，只有少部分重金屬能有效地向上轉(zhuǎn)移所致[14]。植物將大部分重金屬滯留或固定在根部，阻止或減少其向地上部分運輸，被認為是植物減輕對地上部敏感器官的毒害作用，增強植物耐性的重要機制之一[40，44-45]。大量研究表明，香根草對高濃度的重金屬具有較強的耐受能力[8，11，14，43]。本研究結(jié)果表明，香根草幼苗根系對兩種重金屬較強的滯留能力可能對提高其重金屬耐性產(chǎn)生了重要作用。本研究中，盡管處理組香根草幼苗根部富集的Pb 和Cu 含量較高，但其在香根草體內(nèi)的遷移受到很大的限制，處理組香根草幼苗的TF值均顯著小于對照組，說明香根草地上部可能存在較低重金屬濃度閾值以減輕重金屬對地上部植株的毒害作用從而增加耐受性[41]。這與Aibibu等[14]的研究中香根草轉(zhuǎn)運系數(shù)隨著水溶液Cd 濃度升高而降低的結(jié)論一致。

4 結(jié)論

（1）香根草幼苗生長受污染土壤水溶態(tài)Pb 和Cu組分的脅迫比種子萌發(fā)階段敏感，表現(xiàn)為幼苗根長、株高、濕質(zhì)量和干質(zhì)量的顯著減少；但其耐性隨生長時間的增加而逐漸增強，在研究重金屬污染土壤的修復植物時應特別關(guān)注植物幼苗早期的表現(xiàn)。

（2）在水溶態(tài)Pb 和Cu 組分的處理下，香根草幼苗根部和地上部的Pb 和Cu 含量均顯著增加，但主要富集在根部，其轉(zhuǎn)運系數(shù)均小于1，表明香根草屬于根部積累性植物，通過限制重金屬向上部轉(zhuǎn)移以減輕對地上部的傷害，提高其耐受性。