賀 超， 王文全 ,2*， 侯俊玲

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102；3.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102)

隨著我國農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展，在保證國家糧食安全和社會穩(wěn)定的同時，農(nóng)作物秸稈生產(chǎn)量也在逐年增加，我國為農(nóng)業(yè)大國，擁有豐富的纖維素資源，每年農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量達5.7×108t[1]；加之我國中藥企業(yè)每年要消耗植物類藥材數(shù)百萬噸，隨之產(chǎn)生的植物類藥渣多達幾千萬噸(含水分)[2]。

目前此部分資源尚未得到充分開發(fā)利用，多被自然腐敗或用于畜牧飼料、積肥與燃料，不僅占用大量土地，而且造成環(huán)境的嚴(yán)重污染和資源的巨大浪費。因此，對農(nóng)作物秸稈、中藥藥渣進行合理利用不僅能減少資源浪費，提高利用率，改善生態(tài)環(huán)境，同時對植物健康生長和農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要意義。木霉屬(TrichodermaPers.)真菌因其在生物降解和生物防治[3-5]等方面的應(yīng)用潛力，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域具有特殊地位，而綠色木霉(Trichodermaviride)具有菌體生長量大且迅速、酶系齊全、產(chǎn)酶量大、酶活性高、降解木質(zhì)纖維素能力強、綠色高效，以及自身生長營養(yǎng)要求簡單、發(fā)酵過程中既有固態(tài)發(fā)酵方式也有液體深層培養(yǎng)方式等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工程和生物降解等相關(guān)領(lǐng)域[6-7]。同時，綠色木霉也是一種農(nóng)業(yè)上常見生防菌，在抑制病原菌、促進植物生長、提高土壤肥力等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[8-9]?；诖?，本文就近年來國內(nèi)外有關(guān)綠色木霉在生物降解和生物防治方面的功能和機制進行綜述，同時對綠色木霉在資源節(jié)約型和環(huán)境友好型生態(tài)農(nóng)業(yè)中未來應(yīng)用前景進行展望。

1 綠色木霉生物降解功能

綠色木霉在代謝過程中會分泌大量胞外降解酶類，如纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶以及木聚糖酶等，用于降解農(nóng)作物秸稈、中藥藥渣等環(huán)境中的有機物質(zhì)，為自身生長、繁殖提供碳源和氮源。其中，綠色木霉在適宜條件下高產(chǎn)高活性纖維素酶系倍受關(guān)注，科研人員利用綠色木霉高產(chǎn)纖維素酶、降解能力強的特性，解決了沼氣發(fā)酵前期好氧菌快速消耗易利用物質(zhì)，導(dǎo)致厭氧菌缺乏養(yǎng)分供給問題；有機廢物經(jīng)綠色木霉有氧預(yù)培養(yǎng)后，被降解為容易吸收利用的物質(zhì)，厭氧消化過程中甲烷產(chǎn)量明顯增加[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，綠色木霉突變菌株發(fā)酵液中纖維素水解酶活性顯著提高[11]。目前，該領(lǐng)域研究主要集中在利用綠色木霉高產(chǎn)纖維素酶過程中發(fā)酵基質(zhì)和條件優(yōu)化，為充分利用可再生資源提供有效途徑[12-13]。

纖維素是地球上數(shù)量最大的可再生資源，在自然界廣泛分布，但目前利用率較低。纖維素酶是一種復(fù)合水解酶類，主要由內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶組成。研究表明，綠色木霉是產(chǎn)纖維素酶系齊全、比例適當(dāng)，且酶活力最高的菌株之一，能夠有效降解纖維素類物質(zhì)[14]。綠色木霉產(chǎn)生的纖維素酶可將植物纖維素水解為葡萄糖，破壞植物細(xì)胞壁，使其釋放蛋白體、淀粉等營養(yǎng)成分，從而消除植物殘渣中淀粉多糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高植物殘渣利用率[10]。若能合理加以開發(fā)利用，則能在一定程度上緩解能源危機、減少環(huán)境污染，并產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益和生態(tài)效益。

綠色木霉可以通過產(chǎn)生纖維素酶將廢報紙中的纖維素降解為可發(fā)酵的糖，并能高效降解造紙污水中的木質(zhì)素，有利于減少環(huán)境污染，促進資源再利用[15]。用綠色木霉、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、煙曲霉(Aspergillusfunigatus)分別對甘蔗渣進行生物預(yù)處理，以還原糖增長量衡量三種高產(chǎn)纖維素酶菌株降解能力的強弱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠色木霉組和煙曲霉組還原糖產(chǎn)量顯著高于枯草芽胞桿菌組，說明綠色木霉和煙曲霉降解能力相對更強[16]。Korenaga等[17]研究表明，綠色木霉產(chǎn)生的纖維素酶對纖維素具有糖化作用，在最佳發(fā)酵條件下，綠色木霉纖維素水解酶的產(chǎn)量和活性顯著提高，使稻草纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的效率大幅提升。在對城市固體垃圾降解菌的篩選過程中發(fā)現(xiàn)綠色木霉組的降解效果最為顯著，降解60 d后，堆肥垃圾減重33.35%[18]。Ghorbani等[19]發(fā)現(xiàn)，利用綠色木霉產(chǎn)纖維素酶降解水稻秸稈，能夠明顯提高秸稈纖維素降解率，大幅度提高其轉(zhuǎn)化為還原糖的效率。對綠色木霉降解殼聚糖的研究發(fā)現(xiàn)，在溫度50 ℃，pH 5.6，反應(yīng)時間6 h時，其分泌的纖維素酶對殼聚糖有較高降解能力，而且酶解法反應(yīng)條件溫和，耗能低，中間產(chǎn)物殼寡糖穩(wěn)定，具有良好的應(yīng)用價值[20]。Surendra等[21]研究發(fā)現(xiàn)綠色木霉和黑曲霉顯示出很高的纖維素酶活性，其中綠色木霉更能有效降解纖維素，提高蛋白質(zhì)含量，這對于綠色木霉降解城市固體廢物是一種有效途徑。

大量研究表明，相比單一菌種發(fā)酵，多菌種聯(lián)合作用效果更好[22]。以綠色木霉、黑曲霉、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)對啤酒糟進行聯(lián)合固體發(fā)酵結(jié)果表明，當(dāng)黑曲霉∶綠色木霉∶酵母=2∶1∶1、溫度29 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min條件下發(fā)酵5 d時，啤酒糟中纖維素、半纖維素含量顯著下降，產(chǎn)物中蛋白含量可提高11.8%[23]。田亞紅等[24]對多菌種混合發(fā)酵向日葵花盤、秸稈生產(chǎn)生物蛋白飼料進行了嘗試，結(jié)果表明當(dāng)啤酒酵母、枯草芽胞桿菌、綠色木霉接種比例為2∶2∶1時，混合有機物中大分子碳水化合物被大量降解為利于牛羊等牲畜消化吸收的小分子化合物，同時發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白增加率為92.62%，發(fā)酵效果顯著。肖洪等[25]發(fā)現(xiàn)黑曲霉(Aspergillusniger)、日本根霉(Rhizopusjaponicus)與綠色木霉的比例不同會影響桑葉茶發(fā)酵產(chǎn)物中活性成分含量，在黑曲霉∶日本根霉∶綠色木霉=2∶1∶2時，桑葉茶中主要功能性成分脫氧野尻霉素(DNJ)產(chǎn)量最高，脫氧野尻霉素是強效α-葡萄糖苷酶抑制劑，可有效抑制人體糖分轉(zhuǎn)化，降低血液糖含量。利用綠色木霉高效降解能力，使其和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)混合發(fā)酵降解稻草中的纖維素，綠色木霉降解稻草纖維素產(chǎn)生的葡萄糖為釀酒酵母提供了良好碳源，其產(chǎn)物可再生能源乙醇含量顯著提高[26]。此外，綠色木霉∶紅芝=1∶4、接種量35%、發(fā)酵時間8 d；二次發(fā)酵酵母接種量7%、發(fā)酵時間24 h時，稻草秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素降解率顯著提高[27]。

研究表明，綠色木霉對環(huán)境適應(yīng)范圍廣，并對除草劑草甘膦具有良好的生物降解作用，因而具備修復(fù)因草甘膦大量使用導(dǎo)致土壤污染的能力[13]。研究者對印度尼西亞草甘膦嚴(yán)重污染土壤進行了野外修復(fù)試驗，結(jié)果表明綠色木霉在自然條件下能顯著降低由于草甘膦大量使用而導(dǎo)致的土壤pH升高，實現(xiàn)了對污染土壤的生物修復(fù)[28]。此外，綠色木霉對多環(huán)芳烴[29]、有機氯[30]等有機污染物也有良好降解效果。

近年來關(guān)于綠色木霉降解功能的應(yīng)用研究報道相對較多，且多集中在對工農(nóng)業(yè)廢料、殘渣的降解和再利用，如綠色木霉降解花生殼制備膳食纖維[31]，降解落葉及草坪碎屑縮短堆肥周期[32]，降解甘草渣產(chǎn)糖條件的研究[33]等。

2 綠色木霉生防和促生功能

生物防治是指利用對植物無害或傷害小的生物來抑制病原菌的生存和活動，以達到降低病害發(fā)生率或嚴(yán)重度的防治手段。綠色木霉作為一種分布廣泛、生長迅速、能產(chǎn)生拮抗物質(zhì)和寄生植物病原菌的真菌，已被廣泛應(yīng)用于植物病害尤其是植物土傳病害的生物防治[34-35]。

2.1 綠色木霉對病原微生物的抗性

綠色木霉是一種廣譜性強的拮抗微生物，廣泛定殖在植物根、莖、葉中，對病原菌具有強烈抑制性并能顯著提高植物抗病性，其作用機制主要包括競爭、溶菌、重寄生、產(chǎn)抗生素和誘導(dǎo)抗性等[36-37]。

綠色木霉對多種病原菌有重寄生作用，能夠有效競爭營養(yǎng)物質(zhì)和生存空間。大多數(shù)真菌細(xì)胞壁主要由幾丁質(zhì)、β-1,3-葡聚糖以及少量蛋白質(zhì)和脂肪構(gòu)成，綠色木霉菌體分泌大量幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶等細(xì)胞壁降解酶，侵入寄主菌絲細(xì)胞吸食其營養(yǎng)物質(zhì)[37]。覃柳燕等[38]研究發(fā)現(xiàn)綠色木霉對根腐病菌茄腐鐮孢菌(Fusariumsolani)有顯著拮抗效應(yīng)。提前3 d接入病原菌，綠色木霉對茄腐鐮孢菌的抑制率達100%，顯微鏡下可見綠色木霉通過纏繞、寄生等方式使茄腐鐮孢菌發(fā)生菌絲斷裂、縊縮、消解等現(xiàn)象。Naglot等[39]研究表明，綠色木霉菌株SDRLIN1對兩種病原菌Pestalotiatheae和F.solani的抑制率分別達到50.51%和63%，是試驗所用菌株中效果最好的。Jana和Manda[40]利用分離鑒定的綠色木霉菌株與白絹病病菌共同培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠色木霉菌株T10完全抑制了白絹病病菌生長。Nawaz等[41]研究表明，綠色木霉可有效抑制辣椒疫霉菌菌絲的生長，抑制率高達85.5%，同時在溫室環(huán)境中種植辣椒時，配合根施綠色木霉菌劑的處理較空白對照組可以降低植株根腐病發(fā)病率達24%～26.5%。

綠色木霉代謝過程中會產(chǎn)生倍半萜烯類、類固醇類以及烷基吡喃酮等抑菌物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)該菌在無土培養(yǎng)基上會分泌綠膠霉素和膠霉毒素，而這兩種代謝產(chǎn)物均對植物有顯著抑菌作用[42]。膠霉菌素是一種具有毒副作用的次級代謝產(chǎn)物，其特有的二硫鍵橋結(jié)構(gòu)可與胞內(nèi)活性蛋白分子發(fā)生交聯(lián)從而抑制酶的生物活性，膠霉菌素對水稻紋枯病、小麥枯萎病等土傳病原菌均有廣譜抗菌性[43]。王勇等[44]發(fā)現(xiàn)，綠色木霉菌絲體在液體發(fā)酵過程中胞外愈創(chuàng)木酚氧化酶和多酚氧化酶活性呈現(xiàn)緩慢曲線式上升，這兩種酶具有抗植物病原真菌活性，表明綠色木霉對病原菌的抗性逐漸增強。

不同病原菌對綠色木霉代謝產(chǎn)物的敏感性不同，并且綠色木霉揮發(fā)性代謝產(chǎn)物和非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對馬鈴薯炭疽菌、鐮刀菌、立枯絲核菌的抑制效果存在差異，揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對三種病原菌的抑制率顯著高于非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物[45]。Valenzuela等[46]研究發(fā)現(xiàn)芒果接種綠色木霉24 h后，致病菌炭疽菌的生長明顯受到抑制，抑制率高達77.4%。氣相色譜-質(zhì)譜分析表明其揮發(fā)性代謝產(chǎn)物主要是苯甲醇、2-苯乙醇、6-戊基-2H-吡喃-2-酮等有機化合物[47]。Kumari等[48]研究綠色木霉抗菌機制時發(fā)現(xiàn)，生物合成的銀納米粒子比化學(xué)物質(zhì)對病原菌的抑制性更強。

大量試驗表明，綠色木霉代謝產(chǎn)物對串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)、茄鏈格孢菌(Alternariadauci)、杯盤菌(Ciboriaspp.)、灰霉菌(Botrytiscinerea)、出芽短梗霉(Aureobasidiumpulluans)、曲霉(Aspergillus)、青霉(Penicillium)、毛霉(Mucor)和根霉(Rhizopus)等植物病原菌均有明顯拮抗效果[34,49]。此外，綠色木霉次生代謝產(chǎn)物中某些胞外蛋白酶也對南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)卵孵化產(chǎn)生高度抑制，降低植物病蟲害發(fā)生率[50]。Al-Hazmi等[51]研究發(fā)現(xiàn)，給番茄澆灌不同濃度綠色木霉和哈茨木霉(Trichodermaharzinum)菌液，不僅能有效抑制根結(jié)線蟲病的發(fā)病率，還會促進番茄生長。

2.2 綠色木霉對植物免疫的誘導(dǎo)

誘導(dǎo)抗病性是指利用物理、化學(xué)以及生物學(xué)方法對植物進行預(yù)處理，從而增強植物自身抗性，改變植物對病蟲害的反應(yīng)[52]。目前關(guān)于綠色木霉對植物病原菌的抗性及其機理研究較為廣泛，而對綠色木霉誘導(dǎo)植物抗病代謝的研究相對較少。

綠色木霉可以通過誘導(dǎo)植物防御酶系的變化增強植物抗性。經(jīng)綠色木霉發(fā)酵液處理后，小麥體內(nèi)苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶、多酚氧化酶等防御酶均出現(xiàn)活性高峰；該發(fā)酵液能夠抑制小麥絲核菌多聚半乳糖醛酸酶活性，造成寡聚半乳糖醛酸酐積累，使植物相關(guān)抗性代謝增強，激發(fā)植物防御反應(yīng)[53]。辛鑫等[54]發(fā)現(xiàn)綠色木霉和香蕉枯萎病病原菌的接種順序?qū)φT導(dǎo)香蕉組培苗抗性具有顯著影響，在先接種綠色木霉后接種病原菌時，香蕉組織內(nèi)苯丙氨酸酶、多酚氧化酶、過氧化物酶等防御酶活性明顯升高。Gajera等[55-56]發(fā)現(xiàn)經(jīng)綠色木霉處理后花生幼苗頸腐病發(fā)病率降低了51%～58%，接種綠色木霉后誘導(dǎo)的抗氧化防御反應(yīng)對因黑曲霉引發(fā)的根腐病有顯著抑制作用。

2.3 綠色木霉對植物生長的促進作用

近年來研究發(fā)現(xiàn)，綠色木霉和哈茨木霉不僅對植物病原菌有拮抗作用，還能提高種子活力和萌發(fā)率，促進幼苗生長[57-59]。有研究指出，經(jīng)過木霉處理的馬鈴薯(Solanumtuberosum)、小麥(Triticumaestivum)、煙草(Nicotianatabacum)、胡蘿卜(Daucuscarota)、長春花(Catharanthusroseus)、菊花(Dendranthemamorifolium)、辣椒(Capsicumfrutescens)和玉米(Zeamays)，其種子萌發(fā)和植株生長均有不同程度提高，具體表現(xiàn)為提高植物種子活力、發(fā)芽率、出苗率、根系活力、株高及植株干質(zhì)量等[60-63]。李艷娟等[64]研究表明，不同濃度的綠色木霉和哈茨木霉溶液對杉木(Cunninghamialanceolata)種子萌發(fā)和幼苗生長有促進作用，并能通過提高幼苗抗氧化酶活性，增強杉木幼苗抗逆性。Arun等[65]將綠色木霉發(fā)酵木薯塊莖固體廢物得到的生物有機肥分別與磷細(xì)菌、固氮菌回接到秋葵(Abelmoschusesculentus)上，發(fā)現(xiàn)堆肥與磷細(xì)菌共同作用能夠顯著提高植株葉綠素含量及秋葵產(chǎn)量，且接種堆肥的秋葵植株不被根腐病感染。同時，綠色木霉活性有機肥能夠顯著降低堿性土壤pH值，有效抑制氨揮發(fā)，并與土壤微生物群落互作增強硝化作用，提高作物對氮肥的利用效率[66]。Singh等[67]研究表明，利用假單胞菌、綠色木霉和哈茨木霉菌劑不僅能有效防治水稻鞘枯萎病，還能促進水稻生物量的積累。Lee等[68]研究發(fā)現(xiàn)，木霉屬多個菌株都對番茄有促生作用，其中綠色木霉對番茄總生物量和側(cè)根生長有顯著促進作用。Joshi等[69]研究表明，從喜馬拉雅地區(qū)土壤分離的綠色木霉菌株回接到植株后，其根系和株高顯著高于空白處理。

就目前研究結(jié)果而言，木霉可能的促生機制主要包括：木霉可產(chǎn)生植物生長調(diào)節(jié)劑，對外源植物激素起到雙向調(diào)節(jié)作用[70-71]；木霉能抑制或降低植物根際周圍有害菌群產(chǎn)生的有利于自身生長但對植物生長有抑制作用的化合物[72]；木霉產(chǎn)生的有機酸、螯合劑、還原酶等，能夠增加植物對養(yǎng)分的利用率，促進植物生長[73-74]。

3 展 望

綠色木霉在農(nóng)業(yè)、資源再利用和環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。近年來國內(nèi)外關(guān)于綠色木霉在生物防治、生物發(fā)酵、生態(tài)修復(fù)等方面的研究報道很多，但多局限在實驗室條件下，大規(guī)模應(yīng)用研究較少。綠色木霉生長和繁殖受環(huán)境因素影響較大，因此近年來研究人員利用基因工程提高綠色木霉對不利環(huán)境的適應(yīng)性以及多種水解酶的表達量，這樣能極大提高綠色木霉生存生長以及生物防治能力，為大規(guī)模應(yīng)用綠色木霉提供了保障[8,75-76]。

我國每年因農(nóng)作物病蟲害導(dǎo)致糧食減產(chǎn)3.53%，損失約1 966 萬噸。綠色木霉是當(dāng)前應(yīng)用廣泛的廣譜抗生菌之一，對多種植物病原菌具有明顯防治效果，并能促進植株生長[77]。因此，充分開發(fā)利用綠色木霉生防菌資源對緩解糧食危機和防治農(nóng)業(yè)污染具有重要意義。農(nóng)作物秸稈和中藥藥渣是重要的可再生生物資源，其主要成分是纖維素，作為一個農(nóng)業(yè)大國，我國擁有豐富的纖維素資源，占世界總量的20%～30%，而我國的秸稈和中藥藥渣再利用率并不高，多被自然腐敗或燃棄，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。尤其是近年來霧霾問題日益突出，運用生物降解法綜合利用農(nóng)作物秸稈、中藥藥渣等廢棄物的優(yōu)越性逐漸顯現(xiàn)，綠色木霉高效的纖維素降解能力體現(xiàn)出了巨大的經(jīng)濟和生態(tài)價值[2,76]。此外，綠色木霉還具有促進植株生長、降低重金屬污染以及生物轉(zhuǎn)化提高次生代謝產(chǎn)物等多種對人類有益的生物功能[78-79]。因此，未來尚需加強對以下領(lǐng)域的深入研究：①深化基礎(chǔ)理論研究，闡明諸如綠色木霉-植物有益互作所誘導(dǎo)的植物抗性機制等。②篩選高效綠色木霉菌株，最大限度提高其生物降解和生物防治功能。③利用分子生物技術(shù)及基因工程等手段，選育、馴化、培養(yǎng)綠色木霉菌株，特別是應(yīng)用基因工程技術(shù)得到基因工程菌，獲得能夠高效產(chǎn)酶和生物降解的優(yōu)良菌種。④進行綠色木霉與其他有益微生物、環(huán)境有機殘渣的組合研究，強化綠色木霉促生和生態(tài)修復(fù)效果。⑤自然環(huán)境條件較實驗室條件更為復(fù)雜，從實驗室得出的研究成果可能并不完全適用于自然生境。因此，應(yīng)加強自然條件下的試驗研究，以便盡快實現(xiàn)綠色木霉工程化應(yīng)用。