倪黎綱，趙旭庭，王宵燕，宋成義，吳信生，甘 源

(1.揚州大學 動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009； 2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，江蘇 泰州 225300； 3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院 獸醫(yī)研究所，江蘇 南京 210004)

豬支原體肺炎(Mycoplasmalpneumoniaof swine， MPS)又稱為豬氣喘病，是養(yǎng)豬生產(chǎn)中主要呼吸系統(tǒng)疾病之一，當豬感染該病時，其臨床癥狀表現(xiàn)為咳嗽、氣喘、食欲減退、呼吸困難等，影響豬的生長速度和飼料轉化率，給養(yǎng)豬業(yè)造成經(jīng)濟損失[1]。生產(chǎn)實踐中發(fā)現(xiàn)，不同品種對該病的感染率不同，中國地方豬種的易感性比外來品種強，尤其是中國高繁殖力的地方品種，如梅山豬、二花臉豬對豬氣喘病均具有較高的易感性[2]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，不同豬種對豬氣喘病的易感性存在分子遺傳機制的差異，如豬TLR2、TLR4、IL-1β、CXCL8等免疫相關基因的變異及其表達差異與豬氣喘病的易感性/抗性可能存在關聯(lián)[3-7]。但是，關于候選基因的表達差異對豬氣喘病易感性/抗性的調(diào)控機制目前尚不清楚，特別是地方豬種對豬氣喘病易感性的分子基礎和感染機理還需要進一步研究。

microRNAs(miRNAs)廣泛存在于動植物中，屬于一種長度22 nt左右的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，miRNA可通過轉錄后調(diào)控基因的表達，參與細胞組織的增殖、凋亡、免疫等功能[8]。近些年研究表明，miRNA對基因功能研究和疾病防治有重要意義，如miR-let-7 家族通過調(diào)控NF-KB通路，促進各種細胞因子釋放，調(diào)控機體對病原免疫應答反應[9]；miR-223調(diào)控抑制CXCL2、CXCL8、CCL3等中性粒細胞趨化因子的表達，從而減少中性粒細胞趨化到肺部組織，減少肺組織的病理損傷，起到對肺組織的保護作用[10-11]。因此，對免疫反應中機體組織miRNA表達譜的研究，可探討特定miRNA及其靶基因在抗病免疫反應過程中的作用，全面揭示免疫反應的遺傳基礎及抗病機制。

姜曲海豬是我國江海型地方豬種，分布在江蘇蘇中地區(qū)，與梅山豬、二花臉豬等均屬于高繁殖力地方豬種，對豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)非常敏感[12]。本研究以姜曲海豬為實驗對象，通過人工感染豬肺炎支原體后，利用深度高通量測序技術研究姜曲海豬肺組織在肺炎支原體感染后miRNA的表達譜，差異分析miRNA的種類及其靶基因，并進一步分析預測靶基因的GO(gene ontology)和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)功能，為研究姜曲海豬對肺炎支原體的感染機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及樣本采集

50日齡純種姜曲海豬20頭由江蘇姜曲海種豬場(江蘇泰州)提供，未注射肺炎支原體疫苗，豬繁殖與呼吸綜合征病毒及肺炎支原體病原檢測均為陰性。實驗豬隨機分成2組(感染組和對照組)，人工感染肺炎支原體試驗劑量參考文獻[13-15]，感染組氣管注射5 mL肺炎支原體強毒凍干物(1∶100)稀釋液(Mhp Js強毒株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所提供)，對照組氣管注射5 mL無菌生理鹽水，試驗期為28 d[14]。然后，隨機選擇3頭感染豬和3頭健康無癥狀的對照組豬，屠宰分離肺部組織，無菌采集肺組織樣品，采集樣本后立即放到液氮中。 PCR檢測確定感染豬的肺組織為肺炎支原體病原陽性，對照組為陰性，然后轉移到冰箱冷凍保存，備用。

1.2 試驗試劑

RNA提取試劑盒、miRNA反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖為Biowest分裝產(chǎn)品；乙醇、氯仿、異丙醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.3 樣本總RNA的提取及測序

將所采集的肺組織樣本在液氮中充分磨碎，采用Trizol法，提取樣本總RNA，總RNA的純度和質(zhì)量經(jīng)Agilent2100檢測，RNA完整指數(shù)>107可用作miRNA的分離與鑒定，RNA完整指數(shù)>108可用作miRNA的測序與分析。提取的豬肺組織RNA樣品委托上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司進行高通量測序，構建文庫，并在Illumina Hiseq 2000平臺進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

由Illumina Hiseq 2000平臺測序所得數(shù)據(jù)經(jīng)過引物與接頭序列去除，并經(jīng)過對測序片段堿基的質(zhì)量檢驗和長度篩選，最終得到質(zhì)量可靠的測序純凈序列(clean reads)。然后，對純凈序列的長度分布進行統(tǒng)計，以初步評估樣本小RNA分布情況。并根據(jù)該物種的參考基因組序列(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-83/fasta/sus_scrofa/dna/Sus_scrofa.Sscrofa10.2.dna.toplevel.fa.gz)，將純凈序列與基因組比對，統(tǒng)計序列比對到基因組的百分比。過濾去除rRNA、snRNA、snoRNA、tRNA等序列，使用RepeatMasker軟件，過濾去除重復序列，鑒定已知的成熟體miRNA序列以及新預測的miRNA序列，采用差異表達基因(differentially expressed genes， DEGs)軟件篩選出P<0.05的差異表達miRNA。采用Miranda預測miRNA的靶基因。預測靶基因的KEGG和GO功能分析采用DAVID軟件分析。

1.5 qRT-PCR驗證差異表達miRNA

根據(jù)高通量測序得到miRNA序列，隨機選擇4個成熟的miRNA進行定量PCR驗證。采用莖-環(huán)RT-PCR法設計miRNA的定量引物，U6作為內(nèi)參基因(表1)。試驗樣本提取的總RNA采用miRNA反轉錄試劑盒進行cDNA的合成(加尾法)，使用CFX384 TouchTM熒光定量PCR進行檢測驗證。定量 PCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進行分析處理，利用SPSS 17.0軟件分析差異表達情況，用T-test檢驗差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 miRNA表達基本數(shù)據(jù)分析

采集的肺組織樣本，經(jīng)提取總RNA和質(zhì)控后，進行Illumina Hiseq高通量測序，成功獲得了感染組和對照組2個肺組織sRNA文庫。文庫篩選分別獲得14 985 014和14 357 415條序列，經(jīng)過濾后分別獲得14 265 786和14 000 588條純凈序列，與參考基因組序列的比對率分別為92.23%和91.83%(表2)。選取純凈序列長度為15～41 bp的序列進行長度分布及拷貝數(shù)統(tǒng)計，結果顯示，大部分純凈序列集中在20～24 nt(圖1)，最多的集中在22 nt，感染組中22 nt的序列占43.72%，對照組中22 nt的序列占47.88%。

2.2 差異表達miRNA分析

對感染組和對照組篩選出來的差異miRNA進行統(tǒng)計分析，相對于對照組，感染組中共篩選到73個顯著差異表達的miRNAs(圖2)，其中，39個表達上調(diào)miRNAs，34個表達下調(diào)miRNAs。隨機選取4個miRNAs進行定量PCR分析，定量結果與miRNA測序的結果基本一致(圖3)，表明miRNA測序的準確性和可靠性。

表1miRNA的定量PCR引物序列

Table1miRNA primers of qRT-PCR

miRNA名稱Name of miRNA引物Primerssc-miR-2225′-GGCTACATCTGGCTACTG-3′ssc-miR-221-3p5′-GCTACATTGTCTGCTGGG-3′ssc-miR-27b-3p5′-TTCACAGTGGCTAAGTTC-3′ssc-miR-30c-5p5′-GGTAAACATCCTACACTCTC-3′下游通用引物Reverse universal primer5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3′U6上游引物Forward primer5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′U6下游引物Reverse primer5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′

表2 小RNA高通量測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

Table2High-throughput sequencing data statistics of small RNAs

組別Groups序列總數(shù)Total reads過濾純凈序列Clean reads過濾百分比Clean ratio/%比對上基因組的序列數(shù)Aligned reads比對上基因組的序列數(shù)比例Aligned ratio/%感染組Infected group149850141426578695.201315730292.23對照組Control group143574151400058897.511285665691.83

圖1 小RNA片段的長度分布Fig.1 The length distribution of small RNA sequences

2.3 miRNA調(diào)控靶基因預測與分析

使用Miranda軟件對感染組中顯著差異表達的miRNA進行靶基因預測，73個差異miRNAs預測到1 685個靶基因和4 220個靶位點。根據(jù)靶向基因預測結果，篩選到8個與免疫調(diào)控相關的miRNAs(表3)，包括ssc-miR-30c-5p、ssc-miR-128、ssc-miR-125b、ssc-let-7c、ssc-miR-221-3p、ssc-miR-221-5p、ssc-miR-20b和ssc-miR-4332，預測到與免疫相關的靶向基因包括TLR6、CD6、CCDC180、CCDC120、HHLA2、IL12RB2、WNT2等。

圖2 感染組中差異表達miRNA數(shù)量Fig.2 Number of differentially expressed miRNAs in the infected group

圖3 miRNA測序結果的定量PCR驗證Fig.3 The result of qPCR compared with miRNA-Seq

2.4 靶基因GO和KEGG分析

差異表達miRNA預測的靶基因進行GO和KEGG分析。GO分析結果見圖4，預測靶基因注釋到組蛋白H3-K27去甲基化、MAPKKK活性激活、細胞凋亡的執(zhí)行等生物過程；組蛋白乙酰轉移酶復合物、Ada2Gcn5Ada3轉錄激活復合物等細胞成分；P53結合、信號適配活性、C-X-C趨化因子受體活性等分子功能。KEGG分析結果見表4，預測靶基因主要參與細胞凋亡、ECM受體相互作用、粘附斑通路等信號通路。

表3 感染組中與免疫調(diào)控相關的差異表達miRNAs

Table3Differentially expressed miRNAs related to immuneregulation in the infected group

miRNA名稱miRNA namemiRNA序列Sequence of miRNA表達上調(diào)/下調(diào)Up/Down-regulatedP值P-value靶基因Target genesssc-miR-30c-5pTGTAAACATCCTACACTCTCAGC上調(diào)Up8.39×10-6TLR6、ACSL3、SHISA2ssc-miR-128TCACAGTGAACCGGTCTCTTT上調(diào)Up0.00261CD6、KIF13B、TMOD1、GBP1、ADCY3、OAS2ssc-miR-125bTCCCTGAGACCCTAACTTGTGA上調(diào)Up0.00361CCDC180、ABCG4、CCDC120、CCDC80、TNKS1BP1、COL7A1ssc-let-7cTGAGGTAGTAGGTTGTATGGTT上調(diào)Up0.00483TAF5L、DICER1、IFT172、ZNF831ssc-miR-221-3pAGCTACATTGTCTGCTGGGTTT下調(diào)Down0.00120MYO1C、ARHGAP42、FBXW2ssc-miR-221-5pACCTGGCATACAATGTAGATTTCTGT下調(diào)Down0.00227PSAPL1、HHLA2、PEAR1、WDR45、TTL、ABRA、TENM1等ssc-miR-20bCAAAGTGCTCACAGTGCAGGTAG下調(diào)Down0.01418MYO10、HRASLS5、SLC25A15、FBXW9ssc-miR-4332CACGGCCGCCGCCGGGCGCC下調(diào)Down0.04465IL12RB2、FLT4、PLD4、TMEM176B、WNT2、GTF3C4

1，蛋白質(zhì)穩(wěn)定化；2，肺發(fā)育；3，中胚層細胞分化；4，JUN激酶的激活；5，組蛋白H3-K27去甲基化；6，膜蛋白水解；7，蛋白質(zhì)異源三聚體化；8，細胞內(nèi)雌激素受體信號通路的陽性調(diào)節(jié)；9，MAPKKK活性激活；10，細胞凋亡的執(zhí)行階段；11，網(wǎng)格蛋白包衣核；12，組蛋白甲基轉移酶復合物；13，應激纖維；14，皮質(zhì)細胞骨架；15，肌球蛋白復合物；16，組蛋白乙酰轉移酶復合物；17，BAT3復合物；18，Ada2Gcn5Ada3轉錄激活復合物；19，核包膜腔；20，MLL5-L復合物；21，p53結合；22，細胞外基質(zhì)結構成分；23，RNA聚合酶Ⅱ轉錄輔因子活性；24，肌動活動；25，蛋白質(zhì)錯折疊結合；26，組蛋白脫甲基酶活性(H3-K27特異性)；27，轉錄激活物活性，RNA聚合酶Ⅱ遠端增強子序列特異性結合；28，信號適配活性；29，微管負端結合；30，C-X-C趨化因子受體活性。1， Protein stabilization; 2， Lung development; 3， Mesodermal cell differentiation; 4， Activation of JUN kinase activity; 5， Histone H3-K27 demethylation; 6， Membrane protein proteolysis; 7， Protein heterotrimerization; 8， Positive regulation of intracellular estrogen receptor signaling pathway; 9， Activation of MAPKKK activity; 10， Execution phase of apoptosis; 11， Clathrin-coated pit; 12， Histone methyltransferase complex; 13， Stress fiber; 14， Cortical cytoskeleton; 15， Myosin complex; 16， Histone acetyltransferase complex; 17， BAT3 complex; 18， Ada2Gcn5Ada3 transcription activator complex; 19， Nuclear envelope lumen; 20， MLL5-L complex; 21， p53 binding; 22， Extracellular matrix structural constituent; 23， RNA polymerase II transcription cofactor activity; 24， Motor activity; 25， Misfolded protein binding; 26， Histone demethylase activity (H3-K27 specific); 27， Transcriptional activator activity， RNA polymerase II distal enhancer sequence-specific binding; 28， Signaling adaptor activity; 29， Microtubule minus-end binding; 30， C-X-C chemokine receptor activity.圖4 差異表達miRNA靶基因的GO分析Fig.4 GO analysis of differentially expressed miRNA target genes

3 討論

miRNA廣泛存在于動植物中，屬于一種長度22 nt左右的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，miRNA可通過轉錄后調(diào)控基因的表達，在動物免疫反應中發(fā)揮著重要作用[8]，因此，對感染動物免疫組織miRNA表達譜的研究可揭示動物進行免疫反應的遺傳基礎。本實驗重點研究地方豬種姜曲海豬感染肺炎支原體后，分析其病原的靶向組織肺組織中miRNA表達譜，探討miRNA及其預測的靶基因在姜曲海豬抗肺炎支原體感染中表達情況，揭示其免疫應答反應的遺傳基礎，為進一步研究miRNA在抗病過程中的作用機理奠定基礎。

表4 差異表達miRNA靶基因的KEGG分析

Table4KEGG analysis of differentially expressed miRNA target genes

序號No.通路編碼Pathway ID通路名稱Name of pathway基因數(shù)量Number of genesP值P-value1path:ssc00514O-聚糖生物合成的其他類型 Other types of O-glycan biosynthesis141.11×10-62path:ssc04911胰島素分泌 Insulin secretion220.0012953path:ssc04210細胞凋亡 Apoptosis340.0016644path:ssc04925醛固酮的合成和分泌 Aldosterone synthesis and secretion200.0017335path:ssc04915雌激素信號通路 Estrogen signaling pathway240.002626path:ssc04122硫磺中繼系統(tǒng) Sulfur relay system40.002797path:ssc04512ECM受體相互作用 ECM-receptor interaction250.0030278path:ssc04913卵巢類固醇生成 Ovarian steroidogenesis170.0039119path:ssc04022cGMP-PKG信號通路 cGMP-PKG signaling pathway330.00406810path:ssc04918甲狀腺激素合成 Thyroid hormone synthesis190.00412811path:ssc04510粘著斑 Focal adhesion470.00507712path:ssc04921催產(chǎn)素信號通路 Oxytocin signaling pathway330.00511413path:ssc04740嗅覺傳導 Olfactory transduction120.00515314path:ssc05216甲狀腺癌 Thyroid cancer100.0064615path:ssc00061脂肪酸生物合成 Fatty acid biosynthesis50.00734416path:ssc05211腎細胞癌 Renal cell carcinoma190.00786217path:ssc04974蛋白質(zhì)消化吸收 Protein digestion and absorption180.00923118path:ssc00524布地羅辛與新霉素生物合成 Butirosin and neomycin biosynthesis40.00967219path:ssc05206癌癥microRNAs microRNAs in cancer320.01128320path:ssc00534糖胺聚糖生物合成 Glycosaminoglycan biosynthesis60.011488

高通量測序發(fā)現(xiàn)，姜曲海豬感染肺炎支原體28 d后，感染組肺組織獲得14 265 786條純凈序列，對照組肺組織獲得14 000 588條純凈序列，感染組相對于對照組篩選出73個顯著差異表達的miRNAs，其中，8個與免疫相關的miRNAs，包括ssc-miR-30c-5p、ssc-miR-128、ssc-miR-125b、ssc-let-7c、ssc-miR-221-3p、ssc-miR-221-5p、ssc-miR-20b、ssc-miR-20b、ssc-miR-4332等?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，miR-let-7家族可以參與調(diào)控機體對病原免疫應答反應[9]，其中，miR-let-7c通過靶向調(diào)控STAT3基因從而可調(diào)控肺泡巨噬細胞的炎癥反應[16]。miR-125b通過結合B淋巴細胞，調(diào)節(jié)IFN基因表達，從而調(diào)控細胞凋亡和分化[17]。miR-128在呼吸道上皮細胞中可以調(diào)控靶向基因IL-6的表達，影響呼吸道疾病的免疫反應[18]。免疫相關miRNAs的篩選結果提示，miRNA在豬感染肺炎支原體后的機體免疫反應中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

感染組中篩選到與免疫相關的miRNA進行靶基因預測，結果預測到TLR6、CD6、CCDC180、CCDC120、HHLA2、IL12RB2、WNT2等免疫相關的基因。TLR6、CD6、HHLA2是動物機體免疫反應的關鍵基因，TLR6是Toll樣受體家族的重要成員，定位于細胞表面，可識別機體病原，并激活跨膜信號分子，激活傳遞機體免疫及炎癥級聯(lián)反應[3，19]。方曉敏等[14]利用基因芯片技術分析人工感染肺炎支原體后的豬肺組織mRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)Toll樣受體在肺炎支原體感染的炎癥反應調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。CD6是T淋巴細胞外膜上的一種蛋白質(zhì)，對T細胞激活的持續(xù)起重要作用，與炎癥性疾病相關[20]。HHLA2是單核細胞表面的蛋白質(zhì)配體，通過結合T淋巴細胞上的受體并抑制這些細胞的增殖來調(diào)節(jié)細胞介導的免疫反應[21]。因此，靶基因預測結果提示miRNA可以通過調(diào)控靶向免疫基因的表達來調(diào)控機體的免疫反應。

通過預測靶基因的GO分析，發(fā)現(xiàn)miRNA廣泛參與生物過程、細胞組成和分子功能的調(diào)控，其中，細胞凋亡的執(zhí)行、MAPKKK活性的激活、C-X-C趨化因子受體活性等表現(xiàn)活躍。通過對靶基因的KEGG分析，發(fā)現(xiàn)細胞凋亡、ECM受體相互作用、粘附斑通路等信號通路呈現(xiàn)活躍狀態(tài)。相關研究報道，ECM受體相互作用、粘附斑通路是病原識別過程，抗原遞呈加工過程和免疫應答過程中的重要信號通路[22-23]。因此，差異表達miRNA在豬感染肺炎支原體過程中，很可能參與調(diào)控機體病原識別、抗原遞呈、免疫應答等免疫反應過程。另外，病原感染機體后，細胞凋亡通路的啟動是機體自我保護的功能，能有效阻止病原的繁殖和增殖[24]。已有實驗證實，肺炎支原體感染豬的組織或細胞后，細胞凋亡、粘附斑通路等信號通路表現(xiàn)活躍，并參與調(diào)控免疫反應[14，25]。因此，通過對預測靶基因功能以及相關信號通路分析，揭示miRNA在豬感染肺炎支原體過程中可以參與調(diào)控免疫相關信號通路來調(diào)節(jié)機體的免疫反應。

綜上所述，本研究使用高通量測序技術獲得姜曲海豬人工感染肺炎支原體28 d后肺組織miRNA表達譜，通過生物信息學分析篩選到與免疫調(diào)控相關的miRNAs，預測靶基因功能分析發(fā)現(xiàn)miRNA參與調(diào)控感染肺炎支原體機體免疫應答反應過程中的信號通路。由于miRNA在免疫調(diào)控的研究還處于起步階段，其作用機制還未清楚，miRNA功能和作用機制還需進一步研究和驗證。