黃和軍，楊軍輝，陳國寶，蔣贏，俞賓，柳佳，李書霖

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)江陰附屬醫(yī)院，江蘇 江陰 214400; 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，“富貴病”比如糖尿病、高脂血癥等發(fā)病率越來越高，近30年來我國國民“高脂血癥”的發(fā)病率已經(jīng)超過了40%，西醫(yī)治療主要以他汀、貝特類為主，療效確切，但肝損傷、肌溶解等安全性問題不容小視。中醫(yī)藥治療高脂血癥有著其獨(dú)特的優(yōu)勢，但對于本病的辨證分型尚未達(dá)成統(tǒng)一，各醫(yī)家常根據(jù)自己的辨證模型遣方用藥。邢祝喬等[1]運(yùn)用疏肝、健脾、補(bǔ)腎、化痰方法辨證施治，郭海山[2]運(yùn)用化痰降濁、活血化瘀、溫腎健脾方法辨證施治，劉晶晶等[3]以健脾化痰、清胃熱、活血化瘀、滋補(bǔ)肝腎、疏肝理氣方法辨證施治，黃煌擅長運(yùn)用大柴胡湯、五苓散、桂枝茯苓丸等經(jīng)方進(jìn)行辨治[4]。

我科常用自擬的降脂合劑用于治療高脂血癥。本方主要成分是紫丹參、澤瀉、決明子、蒼術(shù)、荷葉、枸杞子、山楂和石菖蒲，是江蘇省名老中醫(yī)袁士良的臨床效方，用于健脾祛濕、化濁降脂、活血行氣及補(bǔ)益肝腎。臨床上適用于痰濕脂濁，痰阻血脈，氣血瘀滯之高脂血癥和脂肪肝，或伴有冠心病、肝功能不全、動脈粥樣硬化等疾病。方中澤瀉，歸膀胱、腎經(jīng)，功效利水滲濕、泄熱、化濁降脂，具有降脂、降糖、降血壓、抗脂肪肝、抗動脈粥樣硬化等藥理作用[5-6]。枸杞子，歸肝、腎、心經(jīng)，功效滋補(bǔ)肝腎、潤肺、明目，有著改善血糖、調(diào)節(jié)血脂、抑制腫瘤、抑制動脈粥樣硬化、增強(qiáng)免疫力等藥理作用[7]。石菖蒲，歸心、脾、膀胱經(jīng)，功效化濕濁、醒脾胃、行氣滯、消脹滿，具有降脂、抗炎、鎮(zhèn)靜、增強(qiáng)免疫等藥理作用[8]。決明子,走厥陰肝經(jīng)，功效清肝明目、潤腸通便，具有降脂降壓、清肝明目、抗氧化等藥理作用[9]。丹參，歸心、心包、肝經(jīng)，活血祛瘀、涼血消癰、養(yǎng)血安神，擁有抵抗動脈粥樣硬化、調(diào)脂、保肝、防止血栓形成、改善心肌供血防止心肌缺血等藥理作用[10-12]。蒼術(shù)，入脾、胃經(jīng)，功效燥濕健脾，山楂，入脾、肝經(jīng)，功效消積破結(jié)，行血開瘀，蒼術(shù)配山楂可有效調(diào)制糖脂代謝，明顯降低甘油三酯及膽固醇[13]。荷葉，歸肝、脾、胃經(jīng)，形如仰孟，可升少陽清氣、清暑利濕、涼血止血，現(xiàn)代藥理研究荷葉提取物可通過影響脂肪酸合成代謝的相關(guān)蛋白而達(dá)到降低血脂的目的[14]。

根據(jù)中藥新藥6類標(biāo)準(zhǔn)擬開發(fā)降脂合劑成為醫(yī)院制劑，為了更好的控制降脂合劑的質(zhì)量，確保臨床療效，有必要建立制劑內(nèi)部質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)采用TLC法對降脂合劑中澤瀉、枸杞子、石菖蒲和決明子進(jìn)行薄層鑒別，采用HPLC法測定降脂合劑中丹酚酸B含量，為創(chuàng)設(shè)降脂合劑質(zhì)量控制高標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀，VWD可變波長紫外檢測器；SQP型十萬分之一天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；XP-6型百萬分之一天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；KQ-250B型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司)；TGL-16G型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；ZF-8暗箱三用紫外分析儀(上海貝倫儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥

丹酚酸B對照品(批號：111562-201313，純度：97.0%)；澤瀉對比藥材(批號：121081-201105)、枸杞子對比藥材(批號：121072-201109)、石菖蒲對比藥材(121098-201105)、決明子對比藥材(121011-201109)均購自于中國藥品生物制品檢定研究院。甲醇、乙腈(色譜純，Tedia公司)；水為娃哈哈純凈水；其它試劑都為分析純(南京化學(xué)試劑有限公司)。

降脂合劑(批號：20180228、20180312、20180314)，缺丹參、澤瀉、石菖蒲、枸杞子和決明子的陰性對照樣品均由江陰市中醫(yī)院制劑室生產(chǎn)。

降脂合劑制備方法：麩炒蒼術(shù)75 g,石菖蒲30 g,山楂150 g,荷葉50 g,澤瀉150 g,丹參75 g,炒決明子75 g,枸杞子75 g，以上八味，加8～12倍量水，浸泡0.5 h，煎煮2次，每次1.5 h，合并兩次煎液，濾過，取上清液濃縮至近1 000 mL，相對密度為1.03～1.07(60℃)，加苯甲酸鈉3 g,羥苯乙酯0.3 g溶解，攪勻，濾過，加水至1 000 mL，測定pH值、相對密度，合格后，灌裝，流通蒸汽滅菌45 min，貼簽，即得。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 枸杞子

取本品15 mL，用乙酸乙酯萃取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，揮干，用1 mL乙酸乙酯溶解殘余物，作為供試品溶液。另外選擇枸杞0.5 g作為對比藥材，加35 mL水煮沸15 min，放冷，濾過，用15 mL乙酸乙酯萃取續(xù)濾液，分取乙酸乙酯層，揮干，殘余物加入1 mL乙酸乙酯溶解，作為對比藥材溶液。按照TLC法試驗(yàn)(《中國藥典》2015年版四部通則0502)，分別取10 μL 供試品和對比藥材溶液點(diǎn)在同一硅膠G薄層板上，把甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶5∶2)當(dāng)作展開劑，展開、取出、晾干，并且擺放在波長為365 nm的紫外等下仔細(xì)觀察。供試品的色譜圖中，在和對比藥材色譜對應(yīng)的位置上，顯示出相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性對照沒有干擾，結(jié)果見圖1。

圖1 枸杞子鑒別TLC圖1.枸杞子對照藥材；2～4.供試品溶液；5.缺少枸杞子的陰性對照

2.1.2 決明子

取本品20 mL，加入1 mL鹽酸，水浴加熱30 min ，放冷，使用乙醚萃取，共萃取2次，每次均為20 mL，然后將其與乙醚液合并，再揮干，加入1 mL三氯甲烷到殘渣中讓他它溶解，作為供試品溶液。另外選取決明子對照藥材粉末1 g，加入10 mL甲醇，浸1 h，過濾，濾液揮干，殘渣加水10 mL溶解，然后加鹽酸1 mL，水浴中加熱30 min，冷卻后用乙醚進(jìn)行2次萃取，每次萃取20 mL，將它與乙醚液合并，揮干后加1 mL三氯甲烷到殘渣中使其復(fù)溶，作為對比藥材溶液。遵照TLC法試驗(yàn)(《中國藥典》2015年版四部通則0502)，分別取溶液10 μL，點(diǎn)在同一硅膠H薄層板上，把石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)作為展開劑，展開、取出、晾干。供試品的色譜中，在和對比藥材色譜相對應(yīng)的位置上，結(jié)果顯示出顏色一致的斑點(diǎn)，陰性對照未被干擾，結(jié)果見圖2。

圖2 決明子鑒別TLC圖1.決明子對照藥材；2～4.供試品溶液；5.缺乏決明子的陰性對照

2.1.3 石菖蒲

取本品20 mL，用石油醚(60～90℃)萃取2次，每次萃取20 mL，將它和乙醚溶液混合，揮干，把1 mL石油醚(60～90℃)加入殘渣中使其復(fù)溶，作為供試品溶液。另取石菖蒲0.5 g作為對照藥材，加石油醚(60～90℃)20 mL，超聲處理混合液0.5 h(工作頻率40 kHz，輸出功率250 W)，濾過，濾液揮干，加1 mL石油醚(60～90℃)到殘渣中復(fù)溶，作為對比藥材溶液。參照TLC法試驗(yàn)(《中國藥典》2015年版四部通則0502)，分別取各溶液10 μL，將他們分別點(diǎn)在同一硅膠G薄層板上，把石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(8∶2)作為展開劑，展開、取出、晾干，使用波長365 nm的紫外光燈對其進(jìn)行觀察。發(fā)現(xiàn)在供試品的色譜里，在與對比藥材色譜相對應(yīng)的位置上，顯示出顏色一致的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾，結(jié)果見圖3。

圖3 石菖蒲鑒別TLC圖1.石菖蒲對照藥材；2～4.供試品溶液；5.缺石菖蒲的陰性對照

2.1.4 澤瀉

取本品30 mL，加入2 mL飽和氯化鈉，混勻，用乙醚萃取2次，每次萃取30 mL，將它和乙醚液混合，揮干，加1 mL乙酸乙酯到殘渣復(fù)溶，作為供試品溶液。另外取澤瀉2 g作為對照組藥材，加適量水，煎煮30 min，濾過，濾液濃縮到約20 mL，加入飽和氯化鈉2 mL，混勻，用乙醚振搖提取2次，每次30 mL，與乙醚液混合，揮干，殘渣加1 mL乙酸乙酯復(fù)溶，作為對照藥材溶液。參照TLC法試驗(yàn)(《中國藥典》2015年版四部通則0502)，各溶液均取10 μL，分別點(diǎn)在同一硅膠H薄層板上，把環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(10∶6∶0.2)作為展開劑，展開、取出、晾干，噴上熒光增強(qiáng)劑(10%硫酸乙醇液)，80℃烘到斑點(diǎn)清楚顯色。供試品的色譜在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示出顏色一致的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾，結(jié)果見圖4。

圖4 澤瀉鑒別TLC圖1.澤瀉對照藥材；2～4.供試品溶液；5.缺乏澤瀉的陰性對照

2.2 HPLC含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Sepax C18賽芬液相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為0.1%甲酸水-乙腈，程度洗脫0～30 min，20%～25%乙腈，流速為1 mL/min，檢測波長為289 nm，柱溫定為30℃。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對照品溶液的制備

把甲醇加入進(jìn)精密稱量的丹酚酸B對照品溶液里，即配制成每1 mL含410.8 μg的溶液。

2.2.2.2 供試品溶液的制備

在10 mL容量瓶中加入精密量取的降脂合劑1 mL，再加入200 μL 1 mol/L的鹽酸溶液，并用75%的甲醇定容至刻度，超聲(功率250 W，頻率40 kHz)，放冷，搖勻，離心(12 000 r·min-1，10 min)取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.2.3 陰性對照溶液的制備

依照制劑處方，取1 mL缺丹參的降脂合劑陰性對照樣品，按供試品溶液制取方法，制取陰性對照溶液。

2.2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取丹酚酸B對照品溶液(410.8 μg·mL-1)，用甲醇稀釋依次制成濃度為410.8、205.4、102.7、51.35、25.68、12.84μg·mL-1對照品溶液，分別吸取10 μL，注入液相色譜儀，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，縱坐標(biāo)、橫坐標(biāo)分別為峰面積值、丹酚酸B濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=7.540 6X-5.812 4(r=0.999 9)，線性范圍為12.84～410.8 μg·mL-1。

2.2.4 專屬性

精密吸取10 μL對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定。結(jié)果顯示在供試品溶液色譜峰中，陰性對照溶液在對應(yīng)的保留時間內(nèi)無吸收峰，而與丹酚酸B對照品相應(yīng)的保留時間有吸收峰，說明陰性對照無干擾。結(jié)果見圖5～7。

圖5 丹酚酸B對照品HPLC圖譜

圖6 降脂合劑HPLC圖譜

圖7 缺丹參的陰性對照HPLC圖譜

2.2.5 精密度

精密吸取丹酚酸B對照品溶液10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，不間斷連著進(jìn)6針，記錄丹酚酸B峰面積，結(jié)果RSD為0.50%，提示儀器的精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性

取批號為20180228的降脂合劑，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果丹酚酸B的平均含量為1.12 mg·mL-1，RSD值為0.64%，說明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性

取批號為20180228的降脂合劑，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于配制后0，2，4，6，8，12 h各取10 μL進(jìn)樣測定，計算丹酚酸B峰面積RSD，結(jié)果RSD為0.55%，提示供試品水溶液在12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率

取批號為20180228的降脂合劑，精密移取0.5 mL，放入10 mL容量瓶中，加入0.53 mg丹酚酸B對照品，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法平行制取6份供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，以10 mL中的絕對量算出加樣回收率，計算公式：[(實(shí)測量-樣品量)/對照品加入量]×100%，結(jié)果見表1。丹酚酸B的平均回收率為103.93%,RSD為1.94%，表明該方法的加樣回收率良好。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2.9 樣品測定

取不同批號的降脂合劑，按“2.2.2.2”項(xiàng)下作法制取供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，把樣品中丹酚酸B的濃度計算出來，結(jié)果見表2。

表2 降脂合劑含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

前期預(yù)試驗(yàn)我們分別考察了處方中蒼術(shù)、澤瀉、枸杞子、石菖蒲和決明子的TLC鑒別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)陰性制劑存在干擾，而澤瀉、枸杞子、石菖蒲和決明子TLC中無陰性干擾，可特異性鑒別，故暫將此四味藥的TLC鑒別作為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制項(xiàng)目。方中其他藥味的TLC鑒別，之后將進(jìn)一步對其展開研究。

HPLC含量測定中有機(jī)相考察了甲醇和乙腈兩種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇作為流動相樣品分離度不佳，因此，本文選流動相選取乙腈。同時，該實(shí)驗(yàn)研究也研究了把0.1%甲酸、0.1%乙酸和0.1%磷酸作為流動相，但是考慮到磷酸鹽一定程度上會損害高效液相儀器和色譜柱，權(quán)衡后還是選擇了把0.1%甲酸作為流動相。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用TLC法和HPLC法對降脂合劑分別進(jìn)行了定性鑒別和定量分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所建立方法簡單可行，為降脂合劑的質(zhì)量控制提供了方法和依據(jù)。