陳新　徐麗　宗曉娟　王甲威　譚鉞　朱東姿　魏海蓉　洪坡　劉慶忠

摘要：為建立櫻桃種質(zhì)資源的FISH-AFLP技術(shù)體系并進行親緣關(guān)系分析，本研究以國內(nèi)外搜集的105份櫻桃種質(zhì)為對象，經(jīng)DNA提取、EcoRⅠ/MseⅠ雙酶切，再進行FISH-AFLP反應。擴增結(jié)果顯示，篩選得到8對EcoRⅠ/MseⅠ多態(tài)性引物，可擴增出1 148條譜帶，平均多態(tài)性比率98.61%。聚類分析和遺傳多樣性分析結(jié)果顯示，105份櫻桃栽培品種的遺傳相似性系數(shù)為0.54～0.89，當閾值為0.68時，可分成7個AFLP群;有效等位基因數(shù)、基因多樣度、Shannon信息指數(shù)分別為1.52、0.30、0.45，具有較高的遺傳多樣性。本研究結(jié)果可為今后櫻桃品種鑒別和遺傳多樣性研究等提供理論指導。

關(guān)鍵詞：櫻桃;FISH-AFLP;遺傳多樣性;親緣關(guān)系

中圖分類號：S662.5文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）11-0022-06

Genetic Relationship Analysis of 105 Accessions of

Cherry Germplasms by FISH-AFLP Technology

Chen Xin， Xu Li， Zong Xiaojuan， Wang Jiawei， Tan Yue，

Zhu Dongzi， Wei Hairong， Hong Po， Liu Qingzhong

（Shandong Institute of Pomology/Shandong Provincial Key Laboratory of

Fruit Tree Biotechnology Breeding， Taian 271000， China）

Abstract The objective of this study was to establish FISH-AFLP analysis system for cherry and analyze the genetic relationship of the main cultivars. One hundred and five cherry cultivars were selected as experiment materials. The high-quality genomic DNA was extracted and the purified DNA samples were digested with EcoRⅠ/MseⅠ;after ligation reaction， the samples were used to perform FISH-AFLP detection. The amplification results showed that eight pairs of EcoRⅠ/MseⅠ polymorphic primers were screened and 1 148 bands were obtained. The average percentage of polymorphic bands was 98.61%. The results of cluster analysis and genetic diversity analysis showed that the genetic similarity coefficient of the 105 cherry cultivars varied from 0.54 to 0.89. All the samples were divided into 7 groups when the threshold value was 0.68. The numbers of effective alleles， gene diversity and Shannon information index of the main cultivars were 1.52， 0.30 and 0.45， respectively， indicating high genetic diversity. This study could provide theoretical guidance for the identification and genetic diversity research of cherry varieties in the future.

Keywords Cherry; FISH-AFLP; Genetic diversity; Genetic relationship

櫻桃為多年生木本果樹，屬薔薇科櫻桃屬。目前世界上作為果樹栽培的櫻桃有4個種，品種繁多，僅栽培品種就超過2 000個。隨著我國新品種的不斷選育以及國外品種的引進，基于表型性狀標記鑒定不同品種以及確定品種分類地位及相互之間的親緣關(guān)系越來越困難。DNA分子標記在櫻桃上的應用已有報道。其中，RAPD[1-3]、SSR[4，5]皆曾用于櫻桃種質(zhì)資源的研究，但揭示的多態(tài)性位點較少;國外研究者曾利用cpSCAR分析櫻桃品種間的遺傳關(guān)系和多樣性[6]，但多集中在親緣關(guān)系較近的歐洲甜櫻桃品種上，尤其是一些老品種。

AFLP（amplified fragment length polymorphism，擴增片段長度多態(tài)性）檢測DNA多態(tài)性的方法，于1995年以論文形式發(fā)表[7]，是通過限制性內(nèi)切酶片段的不同長度檢測DNA多態(tài)性的一種DNA分子標記技術(shù)。AFLP具有多態(tài)性強、譜帶豐富和靈敏、分辨率高、快速高效、重復性好等特點，是一種較為理想的分子標記技術(shù)[8]，可用于檢測種及種以下水平上的差異。目前，科研人員已利用AFLP技術(shù)進行遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、抗病連鎖基因分析和品種親緣關(guān)系等研究[9-11]。而帶有熒光標記的FISH-AFLP技術(shù)在各種生物的遺傳多樣性分析、分子鑒定和群體遺傳結(jié)構(gòu)等研究中也得到廣泛應用[12-17]，但該技術(shù)應用于櫻桃資源的研究未見報道。基于此，本試驗利用FISH-AFLP技術(shù)標記對櫻桃種質(zhì)進行研究，并對遺傳多樣性的重要度量指標——有效等位基因數(shù)（Ne）、基因多樣度（H）及Shannon信息指數(shù)（I）進行分析，旨在建立櫻桃種質(zhì)FISH-AFLP分子標記的方法，并為品種鑒別、親緣關(guān)系劃分和遺傳多樣性研究等提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試樣品為105份櫻桃種質(zhì)資源（表1），均種植于山東省果樹研究所櫻桃品種資源圃。于2018年4月采集樹體中上部新鮮嫩葉，置于冰盒帶回實驗室，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 櫻桃基因組DNA制備及酶切反應

采用改良CTAB法[18]提取葉片基因組DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量。

酶切和連接反應在同一反應中進行。總體系20 μL：10×AFLP digest-ligation Buffer 2 μL、AFLP digest-ligation Enzyme Mix 1.8 μL、EcoRⅠ/MseⅠAdaptor（10 μmol/L） 各1 μL、模板DNA 5 μL，補ddH2O至20 μL?；靹螂x心數(shù)秒，25℃保溫5 h。

1.3 AFLP分析

利用編號為4、25、26和91的樣本，從64對AFLP EcoRⅠ/MseⅠ引物中篩選出擴增圖譜清晰的8對引物：E41M56、E49M62、E44M58、E33M84、E59M72、E33M48、E38M86和E40M48（表2）。

預擴增反應總體系為20 μL，其中包括酶切-連接模板DNA 4 μL，2×PCR Mix 10 μL，EcoR Ⅰ和MseⅠ引物（20 μmol/L）各1 μL，ddH2O 4 μL。PCR反應程序：94℃ 3 min;94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán); 72℃ 5 min;4℃保存。預擴產(chǎn)物稀釋20倍作為選擴模板，選擇性擴增總體系20 μL，其中包括預擴增稀釋樣品 2 μL，2×PCR Mix 10 μL，EcoRⅠ和5′端帶有熒光標記的MseⅠ引物（20 μmol/L，表2）各1 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應程序為：95℃ 5 min;95℃ 35 s，65℃ 35 s，72℃ 1 min，每個循環(huán)退火溫度遞減0.7℃，擴增12輪; 94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，23個循環(huán);72℃ 5 min;4℃保存。

將甲酰胺與分子量內(nèi)標按100∶1的體積比混勻后，取15 μL加入上樣板，再加入1 μL稀釋10倍的上述PCR產(chǎn)物。使用3730XL測序儀進行毛細管電泳。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用GeneMarker 1.8 軟件將測序儀得到的原始數(shù)據(jù)進行分析，將電泳圖轉(zhuǎn)化為0/1數(shù)據(jù)矩陣，即有帶記為1，無帶記為0;用軟件NTSYS-pc 2.11對所得數(shù)據(jù)矩陣進行聚類分析，生成聚類圖;用軟件Popgene 1.32計算樣品遺傳多樣性的度量指標——有效等位基因數(shù)（Ne）、基因多樣度（H）及 Shannon 信息指數(shù)（I）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同引物組合 FISH-AFLP 擴增的多態(tài)性比較[HTSS]

由表3可以看出，8對引物共擴增得到1 148條譜帶，平均每對引物產(chǎn)生143.5條譜帶，多態(tài)性譜帶1 132條，平均多態(tài)性比率98.61%。不同引物組合在擴增帶數(shù)、帶型、條帶分布均勻度等方面皆有所差異。其中，引物組合E33M84和 E41M56多態(tài)性比例達到100%，其它引物組合的多態(tài)性比例也在95%以上。圖1為引物組合E40M48對所有樣品的擴增結(jié)果。

2.2 105份櫻桃種質(zhì)資源的親緣關(guān)系

2.2.1 遺傳相似性系數(shù) [HTSS]105份櫻桃種質(zhì)資源的遺傳相似性系數(shù)為0.54～0.89，平均值為0.72。其中桑緹娜和Stella的遺傳相似性系數(shù)最大，為0.89，親緣關(guān)系較近;哥倫比亞和毛櫻桃2號以及尤巨和M16之間的遺傳相似性系數(shù)最小，均為0.54，表明品種間的親緣關(guān)系較遠。

2.2.2 聚類分析 [HTSS]在相似系數(shù)0.68處做結(jié)合線，該線將試驗樣品分成7個AFLP群（AFLP Groups，簡稱 AG）：AG1含有1個品種，即灰毛葉櫻桃;AG2含有3個品種，即大青葉、泰山紅櫻和泰山干櫻;AG3含有1個品種，即東北紅櫻; AG4含有5個品種，即多毛櫻桃、馬哈利×草原櫻桃、馬哈利實生后代、M16和奧德; AG5含有17個品種，即六倍體（吉塞拉）、B5、六倍體實生、草原櫻桃、美麗、SC1、ZY-1、SC6、SC4、早生、SDL-1、聶美人、colt、東塘、短枝櫻桃、F8和艾雜; AG6含有1個品種，即毛櫻桃2號;AG7中含有其它77個品種。

2.2.3 遺傳多樣性分析 [HTSS]根據(jù)數(shù)據(jù)矩陣計算不同引物組合的遺傳多樣性度量指標（表4），進行遺傳多樣性分析。8對引物檢測到樣品不同位點的有效等位基因數(shù)為1.43～1.57，平均為1.52;基因多樣度為0.26～0.32，平均為0.30;Shannon信息指數(shù)為0.39～0.48，平均為0.45。

3 討論與結(jié)論

本試驗采用FISH-AFLP方法，對105個櫻桃種質(zhì)資源進行多樣性分析，選用的8對引物組合共產(chǎn)生1 148條譜帶，平均每對引物產(chǎn)生143.5條譜帶，其中，多態(tài)性譜帶1 132條，多態(tài)性位點數(shù)高達98.61%。該方法得到的譜帶數(shù)與其它樹種FISH-AFLP所獲數(shù)值相近[19，20]，高于普通銀染AFLP所獲譜帶數(shù)[17-21]。由此可見，作為一種新型的分子標記，F(xiàn)ISH-AFLP技術(shù)在櫻桃資源的系統(tǒng)分類、親緣關(guān)系鑒定、品種鑒別、親本選擇等方面具有潛在的應用前景。本試驗確立的FISH-AFLP體系、篩選的引物組合及所得親緣關(guān)系和遺傳多樣性等數(shù)據(jù)均可為后續(xù)相關(guān)研究提供參考，對其它物種的AFLP研究也有一定的參考價值。

本研究通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，蘇1號、泰山紅日和泰山朝陽櫻桃品種聚在一亞類，體現(xiàn)了它們較近的親緣關(guān)系，說明具有相同的遺傳背景。這與三者是從那翁為母本、大紫為父本雜交產(chǎn)生的實生群體中選育出的優(yōu)良品種的事實相符合。另外，吉塞拉6號和吉塞拉7號是灰毛葉櫻桃和酸櫻桃雜交育成的優(yōu)良櫻桃砧木，具有矮化、抗性強、嫁接親和性好等特點。Y1是從吉塞拉6號自然受粉獲得的種子后代中篩選出的四倍體新種質(zhì)，Y1和吉塞拉6號親緣關(guān)系較近，優(yōu)先聚在一起，然后再與吉塞拉7號聚集。

評價群體遺傳多樣性水平的重要指標包括有效等位基因數(shù)（Ne）、基因多樣度（H）和Shannon指數(shù)（I）。本研究得到的遺傳多樣性參數(shù)為Ne=1.52，H=0.30，I=0.45。本試驗對櫻桃主栽品種進行研究，其遺傳相似系數(shù)為0.54～0.89，平均為0.72。由于研究樣品中既有歐洲引進的甜櫻桃（Prunus avium L.）品種，又有酸櫻桃（P. cerasus L.）、中國櫻桃（P. pseudocerasus LindI.）、雜交品種和野生櫻桃屬植物，所處環(huán)境和地域較廣，而櫻桃的種植年限長，遺傳背景豐富，因此遺傳相似系數(shù)閾值范圍比較大。

參 考 文 獻：

[1]陳曉流， 陳學森， 束懷瑞， 等. 15個櫻桃品種的RAPD分析[J]. 果樹學報， 2004， 21（6）： 556-559.

[2]王彩虹， 田義軻， 趙靜， 等. 櫻桃品種資源間遺傳差異的RAPD分析[J]. 西北植物學報， 2005， 25（12）：2431-2435.

[3]蔡宇良， 曹東偉， 李珊， 等. 甜櫻桃品種及其砧木的RAPD分析[J]. 西北植物學報， 2006， 26 （6）：1125-1132.

[4]黃曉姣. 基于SSR標記的中國櫻桃栽培資源的遺傳多樣性及群體遺傳結(jié)構(gòu)研究[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學，2013.

[5]Wünsch A， Hormaza J I. Molecular evaluation of genetic diversity and S-allele composition of local Spanish sweet cherry （Prunus avium L.） cultivars[J]. Genetic Resources and Crop Evolution， 2004， 51： 635-641.

[6]Turkec A， Sayar M， Heinze B. Identification of sweet cherry cultivars（Prunus avium L.） and analysis of their genetic relationships by chloroplast sequence-characterised amplifed regions （cpSCAR） [J]. Genetic Resources and Crop Evolution， 2006， 53（8）： 1635-1641.

[7]Vos P， Hogers R， Bleeker M， et al. AFLP： a new technique for DNA fingerprinting[J]. Nucleic. Acids Res.，1995， 23（21）：4407-4414.

[8]王斌，翁曼麗. AFLP的原理及其應用[J]. 雜交水稻， 1996（5）：27-30.

[9]田清震.中國野生大豆與栽培大豆AFLP指紋技術(shù)分析及生態(tài)群體遺傳關(guān)系研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學， 2000.

[10]Chen H L， Mehlenbacher S A， Smith D. AFLP markers linked to eastern filbert blight resistance from OSU 408.040 hazelnut[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science， 2005， 130（3） ： 412-417.

[11]Ferrari M， Mugnozza G， Monnanni R， et al. DNA fingerprinting of Corylus avellana accessions revealed by AFLP molecular markers[J]. Acta Horticulturae，2005（686）： 125-134.

[12]Kafkas S， zgen M， Dog Y， et al. Molecular characterization of mulberry accessions in Turkey by AFLP markers[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science， 2008， 133（4）： 593-597.

[13]Kafkas S， Erci瘙塂li S，Dogan Y， et al. Polymorphism and genetic relationships among tea genotypes from Turkey revealed by amplified fragment length polymorphism markers[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science， 2009， 134（4）：428-434.

[14]李鳳霞，王衛(wèi)鋒，王魯，等. 煙草屬植物遺傳多樣性和親緣進化關(guān)系的熒光AFLP分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2010， 43（12）：2418-2427.

[15]Ma Q G， Zhang J P， Pei D. Genetic analysis of walnut cultivars in China using fluorescent amplified fragment length polymorphism[J].Journal of the American Society for Horticultural Science， 2011， 136（6）：422-428.

[16]馬慶華，陳新，趙天田，等. 應用FISH-AFLP技術(shù)分析平歐雜種榛主栽品種的遺傳關(guān)系[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，2013， 46（23）：5003-5011.

[17]王紅霞，趙書崗，高儀，等. 普通核桃遺傳多樣性的AFLP分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，2011， 44 （7）：1434-1442.

[18]陳新. 榛子花芽轉(zhuǎn)錄組文庫的Solexa測序及冷調(diào)節(jié)基因的表達譜分析[D]. 北京：中國林業(yè)科學研究院，2011.

[19]Wang L， Xing S Y， Yang K Q， et al. Genetic relationships of Ornamental cultivars of Ginkgo biloba analyzed by AFLP techniques [J]. Acta Genetica Sinica， 2006， 33 （11）： 1020-1026.

[20]寧德魯，馬慶國，張雨，等. 云南省核桃品種遺傳多樣性的FISH-AFLP分析[J]. 林業(yè)科學研究，2011， 24（2）：189-193.

[21]劉衛(wèi)國，易干軍，劉巖，等. 菠蘿種質(zhì)鑒定及親緣關(guān)系的AFLP分析[J]. 果樹學報，2008，25（4）： 516-520.

收稿日期：2019-06-10

基金項目：山東省農(nóng)業(yè)科學院青年科研基金項目（2016YQN25）;山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系果品創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-06-04） ;科技部科技基礎(chǔ)平臺項目（NICGR2018-048）

作者簡介：陳新（1980—），男，博士，副研究員，主要從事果樹種質(zhì)資源與分子生物學研究。E-mail： sdaucx@163.com

通訊作者：劉慶忠（1963—），男，博士，研究員，研究方向：果樹種質(zhì)資源與生物技術(shù)育種。E-mail： qzliu001@126.com

徐麗（1983—），女，博士，助理研究員，主要從事果樹種質(zhì)資源和分子生物學研究。E-mail： xuli1245@ 163.com