張新東 金保方 李曉琴 孫大林 楊文濤 李群生 劉建國 趙紅樂

1.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院生殖中心（南京 210008）；2.東南大學附屬中大醫(yī)院中西醫(yī)結合男科；3.廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院男科；4.陜西省中醫(yī)醫(yī)院男科

隨著體外受精胚胎移植（IVF-ET）技術的發(fā)展，精液常規(guī)參數(shù)已經不足以準確評價男性的生育能力。卵胞漿內單精子顯微注射 （intracytoplasmic sperm injection,ICSI）技術的出現(xiàn)，使得對精子密度的要求下降，精液常規(guī)參數(shù)對ICSI結局的預測價值有局限性。近年來，許多研究認為精子DNA碎片指數(shù)（DNA fragmentation Index,DFI）可以更客觀，更準確的評估男性生育能力，對預測IVF-ET的結局具有重要的參考價值[1]。

由于精子DNA損傷的病因及機制至今沒有完全闡明，目前，對于DFI增高還缺乏特異性的治療手段。大量研究表明，睪丸微循環(huán)障礙是精子發(fā)生異常的病理基礎和病機之一[2]，由于代謝不良，超氧自由基異常增加，精子DNA遭受氧化應激損傷。臨床上我們應用能夠補腎抗氧化作用的中藥二仙膏聯(lián)合具有改善微循環(huán)的胰激肽原酶（怡開），治療DFI增高的重度少精子癥患者，取得了較好的臨床效果，可以顯著降低DFI，而且在進行ICSI助孕后，可以顯著增加優(yōu)質胚胎數(shù)，改善妊娠結局?，F(xiàn)報告如下。

臨床資料及方法

一、研究對象

本研究由東南大學附屬中大醫(yī)院、南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院、廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院、陜西省中醫(yī)醫(yī)院多中心搜集2018年3月～2019年3月因男方重度少精子癥而擬行ICSI助孕的患者，采用流式細胞儀檢測DFI參數(shù)，DFI異常增高者作為研究對象。納入標準：（1）婚后未避孕1年以上未育擬行ICSI治療者；（2）精子濃度≤5×106/mL；（3）DFI≥20%；（4）女方（配偶）年齡≤38歲，且卵巢功能（生殖內分泌、基礎卵泡計數(shù)）、子宮及內膜基本正?；蛘呤菃渭円蜉斅压芄Ｗ枰蛩夭辉姓摺?/p>

排除標準：（1）男方染色體異?；蚓影l(fā)生基因缺失者；（2）男方年齡≥50歲；（3）男方有乙肝、生殖器皰疹等傳染性疾病患者；（4）男方有前列腺炎、尿道炎、精囊炎等泌尿生殖系統(tǒng)感染患者；（5）男方接觸輻射或高溫工作環(huán)境患者；（6）男方有精索靜脈曲張的患者。

二、分組及治療方法

采用分層隨機數(shù)字表法，將患者分為觀察組和對照組。觀察組80例口服二仙膏（山東廣育堂國藥有限公司），20g/次，2次/d，同時加服怡開（胰激肽原酶，常州千紅生化制藥股份有限公司）240U/次，3次/d；對照組60例口服維生素E（VE）（青島雙鯨藥業(yè)有限公司）100 mg/次，3次/d。研究開始前，征得患者的知情同意權。兩組患者每治療一個月，復查一次精液常規(guī)參數(shù)及DFI，若DFI已經在正常范圍（≤15%），則提前進入ICSI周期。藥物最多服用3個月，觀察并統(tǒng)計最終療效。

三、超排卵方案及胚胎質量評定

所有女性患者均采用GnRH-a長方案，于降調理想后，注射促性腺激素（Gn，果納芬），取卵后3～4h手淫排精，優(yōu)化精子后行ICSI，受精后72h后進行胚胎形態(tài)學評估，選擇1～2個胚胎進行移植，剩余胚胎冷凍保存。

胚胎質量評定標準：Ⅰ級：胚胎卵裂球大小均勻，透明帶完整，胞質碎片≤5%，胞質均勻透明。Ⅱ級：卵裂球大小稍不均勻，胞質碎片5%～20%，胞質存在少量空泡。Ⅲ級：卵裂球大小明顯不均勻，形狀不規(guī)則，胞質碎片20%～50%，可能存在胞質顆粒不均或大量空泡。Ⅳ級：卵裂球大小嚴重不均勻，胞質碎片＞50%，存在胞質顆粒不均或大量空泡。其中Ⅰ-Ⅱ級為優(yōu)質胚胎，Ⅰ-Ⅲ級為可移植胚胎，Ⅳ級為不可移植胚胎。

四、觀察指標及數(shù)據(jù)分析

檢測并記錄兩組患者治療前后精液常規(guī)參數(shù)及DFI值，分別進行組內及組間對比，分析藥物治療效果。進行ICSI助孕后，記錄兩組患者受精率、優(yōu)胚率及臨床妊娠成功率，分析藥物對妊娠結局的影響。

妊娠結果判定：胚胎移植14d，HCG升高者（＞10mIU/mL）為生化妊娠，移植4周，B超檢查顯示胎心搏動者確認為臨床妊娠。如果懷孕，隨訪至胎兒出生。

五、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，治療前后組內比較采用配對樣本t檢驗。計數(shù)資料采用卡方檢驗，累計頻數(shù)＜5時，采用Fisher精確概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、一般資料對比

兩組患者年齡、治療前精液常規(guī)參數(shù)、DFI值以及女方（配偶）年齡、基礎卵泡（Antral Follicle Count,AFC）計數(shù)比較均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05，表1）。

表1 兩組患者一般資料對比

二、治療前后精液參數(shù)及DFI比較

觀察組80例患者治療期間脫落5例，對照組60例患者脫落4例。觀察組治療后，精子濃度及活力都有顯著提升，對照組治療前后，精子濃度及活力無明顯變化。觀察組 DFI值由治療前的39.16±11.52降低至9.86±7.32，組內比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；對照組 DFI由治療前的39.35±11.62降低至23.54±9.12；觀察組與對照組相比，治療后 DFI參數(shù)（9.86±7.32 vs 23.54±9.12）有顯著性差異（P＜0.01，表2）。就治療效率來講，觀察組有34.7%（26例）患者在治療1個月后DFI恢復正常（＜15%），而對照組在治療1個月后僅有14.3%（8例）的患者恢復正常。這說明二仙膏聯(lián)合怡開的治療效率比VE更加高效，這也為患者盡快進入ICSI周期爭取了時間。

表2 治療前后精子質量對比

三、患者配偶獲卵數(shù)、優(yōu)胚數(shù)及臨床結局比較

兩組患者均采用ICSI助孕治療，配偶獲卵數(shù)、受精率無顯著性差異。觀察組優(yōu)胚率顯著高于對照組，分別為 5.72±1.45、3.16±1.58，兩組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。臨床妊娠率比較，觀察組和對照組分別為65.3%，60.7%，兩組對比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。從臨床結局來看，觀察組流產3例，對照組流產6例，兩組對比有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，表3）。

表3 配偶獲卵數(shù)、優(yōu)胚數(shù)及臨床結局

討 論

精子DNA損傷程度（DFI）是評價精液質量和預測男性生育能力的重要指標，生殖系統(tǒng)疾病、環(huán)境污染、年齡、藥物、感染、吸煙、放化療、睪丸溫度升高等均可造成精子DNA損傷。精子DNA完整性對于父系基因遺傳給子代至關重要，如果進入卵細胞的精子DNA受損會影響胚胎的發(fā)育潛能、胎兒的生長發(fā)育等。精子DNA損傷可能與受精率、胚胎發(fā)育、種植率、妊娠率、流產率以及子代的先天性異常等有關[3]。

目前關于精子DNA損傷的病因依然沒有完全清楚，但是普遍認為各種因素導致的睪丸損傷（比如精索靜脈曲張、睪丸炎和睪丸外傷等），其最終的病理特征均表現(xiàn)為睪丸微循環(huán)障礙。由于代謝不良，超氧自由基異常增加，而氧自由基介導的氧化應激反應在精子DNA損傷過程中起著關鍵作用[4]。精子細胞膜富含多聚不飽和脂肪酸，易受到活性氧自由基（reactive oxygen Species,ROS）攻擊并引起脂質過氧化反應。精子膜的流動性和完整性受到不同程度的損傷，導致精子核DNA變性或者斷裂。同時ROS攻擊精子核內DNA，使其不能正常包裝和修復，導致DNA斷裂、堿基修飾及染色質交聯(lián)異常。

針對DFI異常增高，目前還沒有推薦性的治療藥物。根據(jù)精子DNA損傷發(fā)生的過程，可以推斷睪丸微循環(huán)障礙以及氧化應激損傷可能是精子DNA碎片增加的主要發(fā)生機制，而改善微循環(huán)已經被作為男性不育的基礎性治療方法寫入中華醫(yī)學會男科學分會 《中國男科疾病診斷與治療指南（2016版）》。據(jù)此，我們在臨床運用補腎養(yǎng)血抗氧化及改善睪丸微循環(huán)的治療理念，聯(lián)合使用二仙膏（補腎養(yǎng)血抗氧化）和胰激肽原酶（改善微循環(huán)），降低ICSI患者的DFI參數(shù)，探討這種治療方法的有效性，為臨床治療DFI異常增高，提供一種診療思路和行之有效的方案。

中醫(yī)學認為“腎藏精，主生殖”、“精血同源”，并在男子不育癥的治療方面，積累了豐富的經驗。目前認為補腎養(yǎng)血中藥一般都具有抗氧化及延緩衰老的作用[5]。二仙膏是在著名古方龜鹿二仙膏基礎上加味制備而成，已成功申請國家非物質文化遺產。龜鹿二仙膏首見于《醫(yī)方考·虛損勞瘵門》，由鹿角、龜板、枸杞子、人參四味中藥組成。此方以溫腎益精的鹿角與滋陰補血的龜板二藥作為主藥，輔以補益生津的枸杞子和人參，四藥合用，性味平和。其功能主治為：“男婦真元虛損，久不孕育；男子酒色過度，消爍真陰，婦人七情傷損血氣，諸虛百損，五勞七傷?！倍筛嘣诖嘶A上加入熟地黃、何首烏、沙苑子、山藥、黃芪、五味子、遠志、牛膝、丹參、核桃仁、牛鞭、黑芝麻，增強了補腎填精功效，并通過益氣養(yǎng)血，達到精血互補的作用。前期的研究表明[6]，二仙膏可以通過提高免疫細胞因子的表達，改善機體的免疫功能，而機體的免疫功能和氧化應激密切相關，共同維護人體的內環(huán)境穩(wěn)態(tài)。在炎癥過程中，免疫細胞產生一系列的炎癥因子如細胞因子和反應性ROS對于消除病原是非常關鍵的，但過量ROS氧化血清白蛋白，進而誘導自身抗體合成，引發(fā)系統(tǒng)功能紊亂，產生疾病。某些細胞因子還可抑制氧化應激，如TNF-α激活NF-κB，上調錳超氧化物歧化酶（MnSOD）和鐵蛋白重鏈（FHC）表達，清除過量 ROS，這是 ROS 和 NF-κB 交聯(lián)調控免疫系統(tǒng)和氧化應激的重要途徑[7]。現(xiàn)代藥理學研究也表明[8-10]，二仙膏中的多種成分均有抗氧化作用。

胰激肽原酶（pancreatic kininogenase）又稱胰激肽釋放酶、血管舒緩素，是激肽系統(tǒng)的一個重要組成部分，屬蛋白水解酶類，具有擴張毛細血管，增加毛細血管血流量，改善微循環(huán)和器官代謝的作用。胰激肽原酶廣泛存在于生殖系統(tǒng)的各種組織和體液中，通過刺激前列腺素PGE2的生成，增加睪丸和附睪的血流量[11]，改善末梢血液循環(huán)，從而抑制氧化應激，減少ROS的產生[12]；此外，通過增加睪丸的血流量，改善生精小管的管狀結構和間質組織的營養(yǎng)，刺激Sertoli細胞的生長，促進睪丸組織核酸的合成，為精子發(fā)生提供理想的生精微環(huán)境[13,14]。

鑒于此，本研究聯(lián)合使用二仙膏和怡開，治療DFI增高的重度少精子癥患者，結果發(fā)現(xiàn)，治療后觀察組精子濃度明顯升高，精子DFI值顯著下降，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義。就時間效率而言，觀察組的治療效果更快，有34.7%的患者，在服用藥物1個月后，DFI即恢復正常，為患者進入ICSI周期節(jié)約了時間成本。

患者經過ICSI助孕后觀察其結局，結果發(fā)現(xiàn)，在配偶獲卵數(shù)相似的情況下，觀察組優(yōu)胚率明顯高于對照組。臨床妊娠率比較，觀察組高于對照組，但無統(tǒng)計學差異。盡管兩組患者的臨床妊娠率差別不大，但是考慮到鮮胚移植的妊娠率僅有60%左右，以及部分患者有再次生育的需求，那么觀察組擁有更多優(yōu)質胚胎，為下次移植及再次生育做好了胚胎儲備。就最終妊娠結局而言，觀察組流產3例（4.0%），對照組流產6例（10.7%），觀察組有更好的臨床結局。

總之，本研究的結果表明，通過改善睪丸微循環(huán)和補腎抗氧化治療可以顯著降低不育癥患者精子DNA碎片率，增加優(yōu)胚率，有利于IVF結局。因此，這一診療理念值得臨床推廣應用，并且迫切需要對其作用機制進行進一步深入研究。