許曉輝，楊志敏，朱天虹,張虹艷，李晨曦，杜銳滸

(蘭州市食品藥品檢驗所，甘肅 蘭州 730050 )

青黛為爵床科植物馬藍(Baphicacanthuscusia(Nees)Bremek)或十字花科植物菘藍(IsatisindigoticaFort)的葉或莖葉經(jīng)加工制得的干燥粉末或團塊. 青黛具有涼血、清熱解毒的功效，常用于溫毒發(fā)斑、胸痛咳血、小兒驚癇等，是一種廉價易得的中藥材[1]. 《中國藥典》一部收載了青黛的質(zhì)量控制檢驗方法. 近年來，監(jiān)督抽檢發(fā)現(xiàn)，市售青黛質(zhì)量差異較大，存在摻偽染色現(xiàn)象[2-3]. 而非法摻入的染色物質(zhì)有毒、致癌，食用染色的青黛不僅無預(yù)期療效，反而會加重病情，對人體帶來嚴重的危害. 為了對青黛的質(zhì)量進行控制，有必要對青黛染色物質(zhì)進行全面監(jiān)測. 常用于青黛的染色物質(zhì)主要有孔雀石綠、隱色孔雀石綠、天青A、天青B、天青C、亞甲基藍等，其中，隱色孔雀石綠是孔雀石綠的代謝產(chǎn)物，在非法摻入時，都是以成品形態(tài)的化學(xué)化合物添加. 目前已報道的孔雀石綠的檢測方法主要有高效液相色譜法和拉曼光譜法[4-5]，其他與孔雀石綠相似的染色物質(zhì)未見文獻報道. 液相色譜難以分離復(fù)雜基質(zhì)樣品，導(dǎo)致準確地定性定量存在一定困難，而拉曼光譜的基底不容易制備. 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)作為一種適合于微量復(fù)雜基質(zhì)樣品的檢測技術(shù)，具有靈敏度高、準確性好等優(yōu)勢. 本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜(UPLC-MS/MS )，建立了以多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)定性定量測定青黛中非法摻入染色物質(zhì)孔雀石綠、隱色孔雀石綠、天青A、天青B、天青C、亞甲基藍的方法，該方法前處理簡單，一針進樣，在13 min內(nèi)可同時測定6種染色物質(zhì)，能夠?qū)η圜旆欠〒饺肴旧镔|(zhì)的監(jiān)測提供技術(shù)支撐.

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀6460：配有電噴霧離子源(美國安捷倫有限公司)；分析天平：感量0.1 mg和0.01 g(梅特勒-托利多有限公司)；真空泵(天津市津騰試驗設(shè)備有限公司)；移液槍：20、100 μL和1.00 mL(德國艾本德)；渦旋混合器(美國Scientific)；離心機(德國艾本德)；超聲波清洗器(美國Corning)； 容量瓶(天玻儀器)；超純水(密理博，純水凈化系統(tǒng))；乙腈(色譜純，德國Merk)，甲酸、乙酸銨(色譜純，東京化成工業(yè)株式會社)，青黛樣品：購自市場上的青黛粉末.

標準品： 孔雀石綠草酸鹽(Lot：107047，純度：95.8%，Dr. Ehrenstorfer GmbH)；隱色孔雀石綠(Lot：G139783，純度：99.6%，Dr. Ehrenstorfer GmbH)；孔雀石綠草酸鹽-D5(Lot：OP022，純度：99.6%，WiTEGA)；隱色孔雀石綠-D6(Lot：OP015，純度：100%，WiTEGA)；亞甲基藍(Lot：1-DRJ-57-1，純度：96%，Toronto Research Chemicals)；天青A(Lot：B420BA0016，純度：80%，BBI Life Sciences)；天青B(Lot：B326BA1467，純度：75%，BBI Life Sciences)；天青C(Lot：EC19BA0005，純度：50%，BBI Life Sciences) .

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18(3.0×100 mm，2.7 μm)；流速：0.5 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：3 μL; 流動相A為含0.1%甲酸-2 mmol/L乙酸銨的水溶液，B為含0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脫程序如表1所列.

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3 質(zhì)譜條件

電離方式：ESI，正離子模式(+)；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；霧化氣：N2；干燥氣流速：8 L/min；噴嘴電壓：500 V；氣流溫度：325 ℃；毛細管電壓：4 000 V；鞘氣流速：12 L/min；鞘氣溫度：350 ℃；定性離子對、定量離子、碎裂電壓、碰撞能量和離子化模式如表2所列.

1.4 溶液制備

1.4.1 對照品溶液制備

6種染色物質(zhì)標準儲備溶液：分別精密稱取孔雀石綠、隱色孔雀石綠、天青A、天青B、天青C、亞甲基藍對照品10.0 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成單個質(zhì)量濃度均為 1 mg/mL的儲備液，置 4 ℃冷藏備用. 使用時用乙腈-水(體積比20∶80)稀釋配制成不同濃度的混合中間液和混合標準使用液.

表2 6種染色物質(zhì)的主要質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Major mass spectral parameters of 6 dyes

孔雀石綠草酸鹽-D5、隱色孔雀石綠-D6內(nèi)標儲備溶液：分別精密稱取孔雀石綠-D5、隱色孔雀石綠-D6對照品10.0 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容刻度，配制成單個質(zhì)量濃度均為 1 mg/mL的儲備液，置 4 ℃冷藏備用. 使用時用乙腈-水(體積比20∶80)稀釋配制成不同濃度的混合中間液和混合標準使用液.

1.4.2 供試品溶液制備

精密稱取樣品0.2 g(精確至0.000 1 g)，置于50 mL離心管中，精密加入含5%甲酸的乙腈溶液10 mL，渦旋1 min，超聲提取30 min，放冷至室溫，5 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)微孔濾膜過濾(0.22 μm，有機相)，取續(xù)濾液作為待測液.

1.4.3 陰性樣品溶液的制備

按照“1.4.2供試品溶液制備”步驟，取未檢出6 種染色物質(zhì)的青黛粉末樣品同法制成陰性樣品溶液，即空白基質(zhì)樣品溶液.

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件優(yōu)化

由于這6種染色物質(zhì)在乙腈和水中都具有較好的溶解度，另一方面，根據(jù)預(yù)試驗發(fā)現(xiàn),酸度對染色物質(zhì)的提取有影響. 因此，考察了含1%、3%、5%甲酸的乙腈溶液作為提取溶劑對回收率的影響，結(jié)果表明，酸度在1%～5%之間時，提取回收率變化差異不是很大. 考慮到這6種染色物質(zhì)在酸性溶液中更易溶解，為定量測定提供保障，最終選擇含5%甲酸的乙腈溶液作為提取溶劑. 在超聲提取時間上，考察了10、20、30 min的提取回收率，隨著時間的延長，提取回收率有所提高，但是無顯著差異，最終選擇超聲提取30 min.

2.2 色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

液相色譜分離條件的優(yōu)化：液相色譜檢測極性化合物時，分離常用的色譜柱有C18和C8 兩種. 本方法采用適合極性化合物分離的Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱，選擇流速為0.5 mL/min，使柱壓達到適宜的數(shù)值，有利于化合物的分離和峰型良好. 流動相的選擇和優(yōu)化：因為供試品溶液的制備使用乙腈，因此設(shè)計了乙腈-含0.1%甲酸的水溶液、含0.1%甲酸的乙腈-水溶液、含0.1%甲酸的乙腈-含0.1%甲酸的水溶液、含0.1%甲酸的乙腈-含2 mmol乙酸銨-0.1%甲酸水溶液等4種方案. 通過試驗發(fā)現(xiàn)，含0.1%甲酸的乙腈-含2 mmol乙酸銨-0.1%甲酸水溶液優(yōu)于其它方案，故本方法采用此流動相. 該流動相的優(yōu)勢是加入甲酸提供正離子化環(huán)境，加入乙酸銨改善被檢測化合物峰型. 質(zhì)譜條件的優(yōu)化：用二通閥聯(lián)接液相色譜與質(zhì)譜，將6種染色物質(zhì)儲備液稀釋至50 ng/mL，分別注入離子源中，在正離子監(jiān)測模式下對每種染色物質(zhì)進行一級質(zhì)譜分析，得到每種染色物質(zhì)的分子離子峰(Q1掃描). 對每種染色物質(zhì)的準分子離子峰進行二級質(zhì)譜分析(子離子掃描)，得到碎片離子信息. 選擇測定染色物質(zhì)的定性和定量離子對，然后對所選離子的碎裂電壓、碰撞能量進行優(yōu)化，使檢測靈敏度達到最佳. 然后，把質(zhì)譜與液相色譜連接，確定6種染色物質(zhì)出峰順序，進行電噴霧電壓、霧化氣、離子源溫度、輔助氣流速等優(yōu)化，使每種染色物質(zhì)的分子離子與碎片離子的離子強度達到最佳，據(jù)此最終確定為本方法的質(zhì)譜條件.

2.3 6種染色物質(zhì)的總離子流圖

在 MRM 模式下，測定 6種染色物質(zhì)的定性和定量離子對色譜圖，共 12 個離子監(jiān)測通道. 其總離子流圖如圖 1所示. 由圖1可見，各個化合物峰形對稱，每個檢測通道互補無干擾，定量準確可靠，其MRM圖如圖2所示.

圖1 6種染色物質(zhì)的總離子流圖Fig. 1 Total ion flow of 6 dyes

圖2 6種染色物質(zhì)的MRMFig. 2 MRM of 6 dyes(a) 孔雀石綠，(b) 隱色孔雀石綠，(c) 天青A，(d) 天青B, (e) 天青C, (f) 亞甲基藍, (g) 孔雀石綠-D5,(h)隱色孔雀石綠-D6

續(xù)圖2

2.4 專屬性考察

取陰性樣品溶液 3 μL，按“1.2色譜條件”和“1.3質(zhì)譜條件”進樣采集數(shù)據(jù)，得到6種染色物質(zhì)陰性樣品溶液的MRM色譜圖，均未見有其他色譜峰干擾6種染色物質(zhì)的目標物成分. 結(jié)果表明，上述青黛樣品基質(zhì)不干擾目標物的測定，方法專屬性良好.

2.5 線性關(guān)系、檢出限、定量限及回收率

取混合標準使用溶液，利用空白基質(zhì)樣品溶液稀釋配制標準曲線溶液，得到質(zhì)量濃度為0.5、1、2、4、6 、8、10、20、30 ng/mL的標準曲線點，外標法定量，X軸為濃度，Y軸為峰面積響應(yīng)值，得到各個染色物質(zhì)的線性回歸方程(如表3所列)，用于計算實際樣品中待測物的濃度. 結(jié)果顯示，6 種染色物質(zhì)在 1～30 ng/mL之間線性關(guān)系良好，R2在 0.998 8～0.999 6之間. 取陰性樣品，混合標準使用溶液通過最小添加量，按“1.4.2供試品溶液制備”同法處理后上機進樣，以信噪比為3計算各個染色物質(zhì)的檢出限(LOD)，以信噪比為10計算各染色物質(zhì)的定量限(LOQ). 6種染色物質(zhì)的檢出限在0.5～1.0 ng/g之間，定量限在1.0～2.0 ng/g之間，結(jié)果如表3所列.

表3 6種染色物質(zhì)線性關(guān)系、檢出限、定量限、回收率Table 3 Linear relationships, detection limits, quantitation limits and recovery rates of 6 dyes

2.6 回收率考察

向陰性樣品中添加低、中、高三個水平的混合標準中間溶液，按“1.4.2供試品溶液制備”進行處理，上機測試，每個添加水平平行制備3份樣，每個樣平行測定6次，做加標回收試驗，3個水平的回收率在79.7%～119.7%之間，結(jié)果如表3所列.

2.7 精密度考察

取質(zhì)量濃度均為 8 ng/mL 的混合標準使用溶液3 μL，按“1.2色譜條件”和“1.3質(zhì)譜條件”進樣測定，連續(xù)測定 6 次，分別計算孔雀石綠、隱色孔雀石綠、天青A、天青B、天青C、亞甲基藍的精密度，其 RSD%分別為1.8%、1.8%、1.7%、0.7%、1.8%、1.4%，RSD%范圍在0.7%～1.8%之間，表明方法的精密度良好.

2.8 樣品測定

應(yīng)用本方法對市場采購的8批青黛樣品進行測定，未檢出染色物質(zhì)孔雀石綠、隱色孔雀石綠、天青A、天青B、天青C、亞甲基藍，青黛樣品的總離子流圖如圖3所示.

圖3 青黛樣品的總離子流圖Fig. 3 Total ion flow of indigo naturalis sample

3 結(jié)論

本文以青黛中非法摻入染色物質(zhì)為研究對象， 通過優(yōu)化樣品前處理條件和色譜質(zhì)譜條件，建立了青黛中非法摻入染色物質(zhì)的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法. 對建立的方法進行了方法學(xué)驗證，其檢測限、定量限、準確性和精密度良好，并使用本方法進行了實際樣品測定. 結(jié)果表明，本方法前處理簡單高效快速、靈敏度高、專屬性強，可以用于對青黛中非法摻入染色物質(zhì)進行快速篩查，為青黛質(zhì)量控制提供了保障.