鄭建宇，劉 晶，周桂園，，殷沛沛，董高峰，王保興，吳建霖，李美紅，周 瀟，尚可超

1. 中煙施偉策（云南）再造煙葉有限公司， 云南省玉溪市紅塔區(qū)大營(yíng)街蔡官屯89 號(hào) 653100

2. 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心， 昆明市五華區(qū)龍泉路548 號(hào) 650202

煙草提取物通常經(jīng)加熱提取和減壓濃縮制備得到。煙草提取物中對(duì)抽吸品質(zhì)有負(fù)面影響的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖等分子量較大的成分未被除去，而對(duì)感官特征有重要作用的小分子和易揮發(fā)成分未經(jīng)過(guò)富集，其質(zhì)量和功能特征的穩(wěn)定性主要取決于煙草原料［1-6］，由于煙草原料的波動(dòng)對(duì)料液特征的影響較大，因此有必要采用適當(dāng)?shù)姆蛛x純化技術(shù)對(duì)煙草提取物進(jìn)行處理。膜分離技術(shù)具有分離和濃縮同步進(jìn)行的特點(diǎn)［7］，采用該技術(shù)在室溫下處理煙草提取物時(shí)，可最大限度地富集熱敏性的致香物質(zhì)和易揮發(fā)成分［8-10］，減少這些成分的加工損失。通過(guò)超濾膜組合分離技術(shù)，可對(duì)提取物中各類(lèi)組分定向分離與截流，富集對(duì)感官特征有功能性作用的有效部分，去除對(duì)口感有負(fù)面影響以及煙氣中焦油和CO 前體物的成分［11］，從而實(shí)現(xiàn)各類(lèi)組分的重組和相關(guān)產(chǎn)品香韻的調(diào)節(jié)，提高其各類(lèi)化學(xué)成分的可調(diào)控性和在卷煙配方中的適用性。近年來(lái)，多級(jí)膜組合技術(shù)應(yīng)用廣泛，比如天然產(chǎn)物的分離純化及富集［12-16］，飲用水和工業(yè)用水的凈化與循環(huán)利用［17-19］，飲料及酒制品的濃縮和凈化［10，20］，制藥工業(yè)中活性成分的制備及細(xì)菌和熱原的去除［21-24］。目前，多級(jí)膜組合技術(shù)在煙草提取物的分離、除雜、濃縮及感官評(píng)價(jià)方面的應(yīng)用研究較少［4-5］。因此，設(shè)計(jì)5 級(jí)超濾膜組合，將煙草提取物按分子量大小進(jìn)行分組，考察各級(jí)膜截留液的主要化學(xué)成分及含量的變化，旨在篩選煙葉提取物中的有效部分，提高煙草提取物在再造煙葉上的應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

2016 年昆明石林生產(chǎn)的K326 品種C3F 等級(jí)的煙葉，由云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心提供。

二氯甲烷、無(wú)水硫酸鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙酸苯乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%，美國(guó)Sigma 公司）。

R-220SE 旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā) 儀（瑞 士Büchi 公 司）；Milli-Q Element 型超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）；GCM-S-02 卷式膜過(guò)濾系統(tǒng)（國(guó)初科技廈門(mén)有限公司）；10 kDa、2 kDa、1 kDa、700 Da、300 Da 的聚醚砜 膜 元 件（ 德 國(guó) Microdyn-Nadir 公 司）；BSA224S-CW 電子天平（感量0.000 1 g）、G-26C 高速離心機(jī)（德國(guó)Sartorius 公司）；7890B/5977A 氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent 公司）；FUTURA-II Alliance 連續(xù)流動(dòng)分析儀（法國(guó)Alliance 公司）。

1.2 方法

1.2.1 超濾樣品的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 000 g 煙葉，加入7 L 水加熱提取，60 ℃下提取2 次；合并煙草提取液，用濾紙減壓過(guò)濾，取200 mL 濾液留樣，供檢測(cè)和評(píng)價(jià)使用。將其余提取物加入過(guò)濾系統(tǒng)的進(jìn)樣端，依次經(jīng)過(guò)10 kDa、2 kDa、1 kDa、700 Da 和300 Da 五級(jí)膜分離。根據(jù)膜材的耐壓性和通量上限及樣品的實(shí)際通量，適當(dāng)調(diào)控進(jìn)出口壓力差（≤0.6 MPa），五級(jí)膜實(shí)際通量分別為86.5、22.0、19.0、10.0、3.0 L/h·m2，工作溫度低于30 ℃。當(dāng)截留液體積明顯減少，濾液流速明顯降低時(shí)，加入適量純化水繼續(xù)過(guò)濾，重復(fù)3 次后更換膜件進(jìn)行下一級(jí)過(guò)濾。分別收集截留液和濾液待用。

1.2.2 常規(guī)化學(xué)成分的檢測(cè)

使用連續(xù)流動(dòng)分析儀，分別按照YC/T 159—2002、YC/T 160—2002 和YC/T 161—2002 對(duì)各級(jí)膜截留液的總糖、還原糖、總植物堿和總氮進(jìn)行含量測(cè)定［25-27］，檢測(cè)結(jié)果通過(guò)各級(jí)膜截留液的得率換算為100 g 煙葉中4 類(lèi)化學(xué)成分的質(zhì)量，評(píng)價(jià)各級(jí)膜對(duì)總糖、還原糖、總植物堿和總氮的富集效果。

1.2.3 揮發(fā)性香味成分的檢測(cè)

前處理：分別稱(chēng)取1.2.1 節(jié)中制備的相當(dāng)于1 g固含物的截留液，濃度較高時(shí)加水稀釋至相近體積，再加入等體積的二氯甲烷分別萃取3 次；合并萃取液，加入無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜；轉(zhuǎn)入燒瓶中，并加入內(nèi)標(biāo)物（乙酸苯乙酯）50 μg，于40 ℃下常壓濃縮至1 mL，待測(cè)。GC-MS 分析條件為：

色譜柱：HP-5MS 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；程序升溫：初始溫度50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 升至260 ℃，保持1 min，再以16 ℃/min升至300 ℃，保持4 min；載氣：高純氦氣，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比10∶1；進(jìn)樣體積：1 μL。離子源：EI；電離能：70 eV；離子源溫度：180 ℃；傳輸線溫度：260 ℃；檢測(cè)模式：全離子掃描監(jiān)測(cè)；質(zhì)量掃描范圍：30～750 amu；溶劑延遲：2 min；根據(jù)NIST11 譜庫(kù)檢索，以匹配度≥80%進(jìn)行定性。

GC-MS 半定量方法：根據(jù)某化合物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比與濃度比成正比，計(jì)算該化合物的含量。假設(shè)內(nèi)標(biāo)物的相對(duì)校正因子為1，按公式Wi=Ai/As·Ws計(jì)算。其中，Wi為組分i 的質(zhì)量，Ai為組分i峰面積，As為內(nèi)標(biāo)物峰面積，Ws為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量。最終組分含量單位換算為μg/g，各化合物含量再對(duì)應(yīng)到各級(jí)膜截留液的總量和得率，換算為100 g 煙葉中各化合物的質(zhì)量。

1.2.4 再造煙葉樣品的制備和感官評(píng)價(jià)

根據(jù)各級(jí)膜截留液和原提取物的固含量，以等量方式加入涂布配方中制樣，在恒溫恒濕條件下平衡24 h，切絲卷制后進(jìn)行感官評(píng)吸。

2 結(jié)果與討論

2.1 各級(jí)膜截留液的固含量和得率

將1.2.1 節(jié)中制備的樣品準(zhǔn)確稱(chēng)量，得到各級(jí)膜截留液總量，采用烘箱法［28］測(cè)試固含量，計(jì)算公式：得率=樣品總量×固含量/原煙葉質(zhì)量，結(jié)果見(jiàn)表1?？梢钥闯觯瑢⒃崛∥镞M(jìn)行超濾膜組合分級(jí)過(guò)濾后，10 kDa、300 Da 膜截留液和300 Da 膜濾液的得率較高，2 和1 kDa 膜截留液的得率偏低。截留液和濾液的固含物累加值僅為原液固含物質(zhì)量的86%，可能是由于在各級(jí)膜分離過(guò)程中，特別是更換下一級(jí)膜時(shí)有一定量的物質(zhì)損失，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將2 和1 kDa 膜截留液合并，即樣品經(jīng)過(guò)10 kDa 過(guò)濾后，不再進(jìn)行2 kDa 過(guò)濾，依次通過(guò)1 kDa、700 Da 和300 Da 膜 繼 續(xù) 過(guò) 濾，從 而 提 高得率。

表1 各級(jí)膜截留液的固含量和得率Tab.1 Solid content and yield of retentate of each membrane

2.2 常規(guī)化學(xué)成分的變化

采用連續(xù)流動(dòng)分析法對(duì)1.2.1 節(jié)中制備的樣品進(jìn)行測(cè)試，根據(jù)各級(jí)膜截留液的總量和固含量，以100 g 原煙葉計(jì)，換算得到總糖、還原糖、總氮和總植物堿隨著超濾膜孔徑變化的富集量，結(jié)果見(jiàn)表2和圖1。

由表2 和圖1 可以看出，各級(jí)膜截留液和濾液的糖含量累加值僅為原液中糖含量的50%左右，若按2.1 節(jié)的得率計(jì)，應(yīng)該為80%左右。煙草提取物原液是固含量為2.73%的低濃度樣品，而各級(jí)膜截留液的測(cè)試樣品是濃縮后固含量較高的樣品，部分分子量較大的糖類(lèi)物質(zhì)溶解性降低，在進(jìn)行樣品前處理時(shí)形成部分沉淀，例如，10 kDa 膜截留液的沉淀就比較多，這些沉淀可能包含部分糖類(lèi)物質(zhì)。為了符合儀器測(cè)試需求，需將這些沉淀濾去，從而導(dǎo)致各級(jí)膜截留液的糖類(lèi)物質(zhì)實(shí)測(cè)值累加后低于原液中的糖含量。

10 kDa 膜截留液的總糖含量最高，還原糖含量較低，10 kDa 膜截留液中非還原糖含量為2.88 g/100 g，而其他各級(jí)膜截留液和濾液中的非還原糖總量為0.85 g/100 g。由于大部分多糖無(wú)還原性，因此認(rèn)為10 kDa 膜截留了煙葉提取物中的大部分多糖，截留總量約為4.03 g/100 g 煙葉。

從2 kDa～300 Da，隨著超濾膜孔徑的降低，還原糖含量呈逐漸上升趨勢(shì)。還原糖在300 Da 膜的截留液和濾液中含量較高，分別為2.32 和3.31 g/100 g 煙葉。

總植物堿主要富集在300 Da 膜截留液中，其含量超過(guò)了其他各級(jí)膜截留液的總和。300 Da 膜濾液中的總植物堿富集量約為其他各級(jí)膜截留液煙堿量的55%。兩部分的煙堿量之和占原煙葉總植物堿含量的70%以上。

表2 各級(jí)膜截留液的化學(xué)成分①Tab.2 Chemical components in retentate of each membrane （g）

對(duì)比總氮和總植物堿可知，10 kDa 膜截留液的總氮遠(yuǎn)高于總植物堿，因此認(rèn)為10 kDa 膜截留液的總氮主要為除生物堿之外的以蛋白質(zhì)為主的有機(jī)氮成分，這也說(shuō)明10 kDa 膜具有截留煙葉提取物中蛋白質(zhì)類(lèi)成分的重要作用。

圖1 各級(jí)膜截留液的化學(xué)成分比較Fig.1 Comparison of chemical components in retentate of each membrane

2.3 揮發(fā)性成分的變化

按1.2.3 節(jié)的前處理和檢測(cè)方法對(duì)1.2.1 節(jié)中制備的樣品進(jìn)行分析測(cè)試，共鑒定出71 個(gè)成分，其中醇類(lèi)11 個(gè)，酮類(lèi)19 個(gè)，醛類(lèi)1 個(gè)，酯類(lèi)10 個(gè)，酚類(lèi)3 個(gè)，酸類(lèi)4 個(gè)，雜環(huán)類(lèi)17 個(gè)，烴類(lèi)6 個(gè)；采用AMDIS 方式進(jìn)行積分，通過(guò)半定量法計(jì)算后結(jié)合各級(jí)膜截留液的固含量和得率，將各成分換算為100 g 煙葉中的質(zhì)量，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3 可以看出，與其他截留液相比，300 Da膜濾液中的特有成分較多，包括：乙酸-1-羥基-2-丙酯、泛酰內(nèi)酯、N-甲基吡咯烷酮、甲基吡咯烷酮、N-甲基丁二酰胺、麥芽酚、琥珀酰亞胺、2-己烯-4-醇、戊二酰亞胺、2-氮己環(huán)酮、γ-羥甲基-γ-丁內(nèi)酯、苯甲酸、乙琥胺、苯乙酸、吲哚、2,6-二甲基-2,7-辛二烯-1,6-二醇、對(duì)羥基苯乙醇、N-甲基煙酰胺、香草乙酮、2,3'-聯(lián)吡啶、高香草醇、2,4-二羥基苯甲醛、乙酰丁香酮、3-吲哚乙醇、6,7-二甲氧基香豆素、新植二烯和正二十六烷。

300 Da 膜截留液的特有成分包括：乙酸丁酯、1-辛烯-3-酮、苯甲醇、1,3,7,7-四甲基-2-氧雜雙環(huán)［4.4.0］-5-葵烯-9-酮、八氫-2,5,5,8a-四甲基-7H-1-苯并吡喃-7-酮、4-羥基-β-二氫大馬酮、6-甲基煙酸。

700 Da 膜截留液的特有成分包括：甲酸異丁酯、苯乙醇、α-亞甲基-γ-戊內(nèi)酯、茄酮、二烯煙堿、巨豆三烯酮、松柏醇。

1 kDa 膜截留液的特有成分包括：丙酸、乙酸丙酯、吡啶、丙酸丙酯和乙酸正十七烷基酯。

2 kDa 膜截留液的特有成分為乙酸仲丁酯。

10 kDa 膜截留液的特有成分為N,N-二甲基乙酰胺。

表3 各級(jí)膜截留液的揮發(fā)性成分及含量Tab.3 Volatile components and their contents in retentate of each membrane （μg·100 g-1）

表3 （續(xù)）

表3 （續(xù)）

部分組分存在于各級(jí)膜截留液中，如保留時(shí)間在2～6 min 的小分子化合物，原液中沒(méi)有檢出。原因是不同孔徑的超濾膜對(duì)各類(lèi)成分有富集作用，即使原液中上述成分的含量低于檢出限，而富集后可被檢出。

有些組分在原液中含量較高、但截留液和濾液中檢出值較低。這是由于這些組分的水溶性稍差，分離過(guò)程中在膜件上形成了死吸附［29-32］，因此原液中這些組分的含量遠(yuǎn)高于各級(jí)膜截留液中的含量。

10、2 和1 kDa 膜截留液的揮發(fā)性香味成分的種類(lèi)和含量均較低，對(duì)產(chǎn)品香氣特征的貢獻(xiàn)較小；煙葉中的特征性成分茄酮、巨豆三烯酮和二烯煙堿主要富集在700 Da 膜截留液中；煙堿及其衍生物去氫新煙堿、可替寧和6-甲基煙酸主要富集在300 Da 膜截留液中；300 Da 膜濾液富集的小分子化合物最多，若不計(jì)煙堿，以原煙葉提取物計(jì)，該部分的揮發(fā)性成分總量最高，達(dá)到207.81 μg/g。

2.4 各級(jí)膜截留液對(duì)再造煙葉感官質(zhì)量的影響

參考杜銳等［4］的評(píng)價(jià)方法，由5 名具有專(zhuān)業(yè)資質(zhì)的感官評(píng)吸人員對(duì)1.2.4 節(jié)中制備的樣品進(jìn)行對(duì)比評(píng)吸，結(jié)果見(jiàn)表4?？梢钥闯觯?0、2 和1 kDa 膜截留液加入配方后，香氣質(zhì)和香氣量等指標(biāo)均較對(duì)照（原提取液）差，具體表現(xiàn)為焦煳味重，刺激性大，香氣不清晰；而700 Da、300 Da 膜截留液和300 Da 膜濾液對(duì)上述感官指標(biāo)有明顯的改善作用，具體表現(xiàn)為煙氣的清甜感和綿柔感增加，香氣更豐富，雜氣和刺激性明顯降低。原煙葉（K326）的頭香和體香特征較明顯。

表4 各級(jí)膜截留液的感官評(píng)價(jià)結(jié)果①Tab.4 Sensory evaluation result of retentate of each membrane

3 結(jié)論

采用超濾膜組合工藝進(jìn)行煙葉提取物處理時(shí)，10 kDa、300 Da 膜截留液和300 Da 膜濾液的得率較高，2 和1 kDa 膜截留液的得率較低，300 Da超濾膜有利于還原糖和總植物堿的富集，10 kDa超濾膜有利于多糖和蛋白質(zhì)類(lèi)成分的富集。通過(guò)10 kDa 和300 Da 兩級(jí)膜組合可以實(shí)現(xiàn)煙葉提取物中多糖、蛋白質(zhì)和還原糖及總植物堿的調(diào)控。

10、2 和1 kDa 膜截留液的揮發(fā)性香味成分的種類(lèi)和含量都較低，對(duì)產(chǎn)品香氣特征的貢獻(xiàn)較小。煙葉的特征性成分在700 和300 Da 兩級(jí)膜上的富集各有特色，多數(shù)煙葉中常見(jiàn)的小分子醇、酮、酯和雜環(huán)類(lèi)成分都富集在300 Da 膜的濾液中，其對(duì)產(chǎn)品的香氣特征有重要作用。通過(guò)適當(dāng)?shù)某瑸V膜組合可以富集和制備目標(biāo)組分，從而可實(shí)現(xiàn)各類(lèi)成分的調(diào)控。

10、2 和1 kDa 膜截留液對(duì)再造煙葉感官品質(zhì)有明顯的負(fù)面影響，而700 Da、300 Da 膜截留液和300 Da 膜濾液對(duì)感官特征有明顯的改善作用，具體表現(xiàn)為香氣較豐富，原煙葉的頭香和體香特點(diǎn)突出。本研究結(jié)果可為應(yīng)用膜分離技術(shù)開(kāi)發(fā)各種煙用香料和對(duì)其各類(lèi)化學(xué)成分進(jìn)行調(diào)控提供參考。