周蓓蓓 王沖 杜佳 周翠 劉海洋 張藝之 周鐵麗,*

(1 溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心，溫州 325035；2 浙江省腫瘤醫(yī)院檢驗科，杭州 310000)

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是社區(qū)獲得性感染和院內感染的常見條件致病菌，可以引起泌尿道感染、傷口感染、腹腔感染和呼吸道感染等[1]。近年來，抗菌藥物的不規(guī)范使用甚至濫用導致包括銅綠假單胞菌在內的絕大多數致病菌出現耐藥甚至多重耐藥的現象，使得可供治療的有效抗菌藥物越來越少，這給臨床治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)[2]。

銅綠假單胞菌具有較強的生物膜形成能力，可引起急慢性感染。有研究表明，至少65%的慢性銅綠假單胞菌感染與生物膜形成有關[3]。細菌生物膜是細菌吸附于惰性物體的內外表面后，細胞不斷聚集并分泌一些基質把自身包裹，形成的細菌細胞結構群體，是細菌為了適應環(huán)境的一種生存方式，具有很強的耐藥性，能夠抵抗百倍以上正常藥物劑量[4]，從而給臨床治療帶來了極大的挑戰(zhàn)。

碳青霉烯類藥物可以與β-內酰胺酶穩(wěn)定結合，是治療大部分革蘭陰性菌感染的有效藥物，為目前治療銅綠假單胞菌感染的首選藥物。Giwercman等[5]研究表明生物膜狀態(tài)下的銅綠假單胞菌比浮游狀態(tài)產生更多的β-內酰胺酶。Bagge等[6]也證實了銅綠假單胞菌在生物膜狀態(tài)時ampC基因的表達上調了150倍。重要的是，碳青霉烯類藥物可以顯著降低銅綠假單胞菌的生物膜形成能力[3]。

銅綠假單胞菌感染的治療過程中，生物膜可普遍形成于導管以及醫(yī)療裝置表面，因此需要更多的研究為臨床治療提供一定的依據。本實驗旨在探討碳青霉烯類藥物作用于銅綠假單胞菌生物膜后，對其細胞形態(tài)學和基因表達的影響，從而為臨床治療銅綠假單胞菌感染提供基本理論和分子基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

本研究中的3 株銅綠假單胞菌(菌株編號為TL1552、TL1728和TL947)均分離自溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院臨床患者的創(chuàng)面標本，VITEK-2 Compact全自動微生物分析儀進行菌株鑒定和初步藥敏試驗，其僅對碳青霉烯類藥物敏感。

1.2 抗菌藥物最低抑菌濃度(mininal inhibotory concentration, MIC)檢測

瓊脂稀釋法檢測菌株對頭孢他啶、頭孢吡肟、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、亞胺培南和美羅培南的最低抑菌濃度(MIC)，結果判讀參照美國臨床實驗室標準化研究協會(CLSI) 2016(M100-S26)標準[7]。每種藥物重復做3次試驗。銅綠假單胞菌ATCC27853為藥敏試驗質控菌株，購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.3 靜態(tài)生物膜形成能力檢測

參照O'Toole[8]的方法進行生物膜實驗。銅綠假單胞菌在含有LB肉湯的無菌96孔細胞培養(yǎng)板中，室溫下靜態(tài)培養(yǎng)過夜。然后，用100mL含有1%葡萄糖和0.3%酪氨酸的M63B1-GCAA培養(yǎng)基進行1:50稀釋，置于無菌96孔細胞培養(yǎng)板，37℃，培養(yǎng)24h。將96孔細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液棄去，用蒸餾水沖洗兩次，去除上層浮游細菌。分別取10μL不同濃度的亞胺培南和美羅培南(5×MIC, 10×MIC)與190μL新鮮配置的含1%葡萄糖的LB肉湯共同加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，37℃，培養(yǎng)24h。將96孔細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液棄去，用蒸餾水沖洗兩次，去除上層浮游細菌。生物膜附著于孔的表面，用125mL含有0.1%結晶紫的染液室溫下染色15min。將96孔細胞培養(yǎng)板中的染液棄去，用蒸餾水沖洗兩次。用33%的醋酸溶解貼壁細胞的結合色素，隨后檢測595nm的吸光度。同時進行兩個獨立的實驗，每個實驗中每株菌重復做2個復孔，結果取4個復孔的平均值。

1.4 掃描電子顯微鏡分析

挑取血平板上過夜培養(yǎng)的單個菌落配置1.5×108CFU/mL濁度的菌液。將1cm×1cm無菌蓋玻片放入無菌6孔細胞培養(yǎng)板中，取100μL上述菌液和1900μL新鮮配置的含1%葡萄糖的新鮮LB肉湯共同加入6孔細胞培養(yǎng)板中，37℃，培養(yǎng)24h。將6孔細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液棄去，用蒸餾水沖洗兩次，去除上層浮游細菌。分別取100μL 5×MIC的亞胺培南和美羅培南與1900μL新鮮配置的含1%葡萄糖的LB肉湯共同加入到6孔細胞培養(yǎng)板中，37℃，培養(yǎng)24h。將6孔細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液棄去，用蒸餾水沖洗兩次，去除上層浮游細菌。將蓋玻片放置于含有戊二醛的無菌6孔細胞培養(yǎng)板中4℃固定2h，再用系列梯度濃度(50%、70%、80%、90%、95%和100%)乙醇分別脫水6min，之后將蓋玻片放置于無菌6孔細胞培養(yǎng)板中，35℃干燥1～2h。用掃描電子顯微鏡觀察碳青霉烯類藥物作用后銅綠假單胞菌的形態(tài)學改變。

1.5 RNA提取、轉錄組測序分析及生物膜相關基因分析

選取銅綠假單胞菌臨床分離株TL1552用于轉錄組測序。提取未經碳青霉烯類藥物處理以及經5×MIC亞胺培南或美羅培南處理的TL1552生物膜狀態(tài)下總RNA。將用于RNA轉錄組測序文庫制備的總RNA經過DNAase處理，之后參照mRNA-Seq Sample Preparmion Kit試劑盒的操作說明進行，構建所需的cDNA文庫。轉錄組文庫測序及差異基因分析均由深圳華大基因科技有限公司完成，所用的測序平臺是Illumina-HiSeq 2500/4000。將測序所得原始圖像的數據轉化成序列數據，并采用生物信息學工具對RNA測序數據進行基因注釋分析。

1.6 實時熒光定量PCR

提取銅綠假單胞菌總RNA，逆轉錄成cDNA后用于實時熒光定量PCR分析。應用qRT-PCR的方法來驗證碳青霉烯類藥物處理后銅綠假單胞菌生物膜形成相關多糖合成基因algD、pslA和pelA表達的差異情況。proC作為內參基因，每個標本的目的基因以及內參基因均做3個復孔。

1.7 統(tǒng)計學分析

所有數據通過SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。對于靜態(tài)生物膜形成能力試驗，用非配對t-檢驗(雙側檢驗)，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 抗菌藥物最低抑菌濃度檢測

檢測結果顯示3株銅綠假單胞菌(TL1552、TL1728和TL947)只對碳青霉烯類藥物敏感(MIC為1mg/L)，其中TL947對美羅培南MIC為2mg/L，對其他臨床常用抗菌藥物均耐藥。

2.2 靜態(tài)生物膜形成能力檢測

結果發(fā)現5×MIC的亞胺培南和美羅培南均能顯著地抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成(圖1)。但是，5×MIC的亞胺培南和美羅培南對已經形成的生物膜卻只產生輕微影響，并不能導致其存活力的顯著下降，直到10×MIC或者是更高濃度時才出現銅綠假單胞菌生物膜細胞存活力的顯著下降(圖2)。

2.3 掃描電子顯微鏡分析

圖1 5×MIC碳青霉烯類藥物對銅綠假單胞菌生物膜形成的影響Fig.1 Effect of 5×MIC carbapenems on the biofilm formation of P.aeruginosa

圖2 10×MIC碳青霉烯類藥物對銅綠假單胞菌生物膜形成的影響Fig.2 Effect of 10×MIC carbapenems on the biofilm formation of P.aeruginosa

掃描電子顯微鏡結果(圖3)顯示，5×MIC碳青霉烯類藥物不能殺死銅綠假單胞菌生物膜細胞，但鏡下顯示生物膜細胞數量以及形態(tài)發(fā)生顯著改變，包括數量減少、細胞變大、變圓以及空泡化等。為了驗證生物膜細胞的變化是否是暫時性改變，本研究將5×MIC碳青霉烯類藥物處理后的銅綠假單胞菌生物膜繼續(xù)在不含抗菌藥物的培養(yǎng)基上孵育6h，結果發(fā)現生物膜細胞的形態(tài)基本上得到了恢復并且存活力也沒有顯著變化。

2.4 差異基因表達，亞胺培南和美羅培南處理后銅綠假單胞菌的基因功能分析

圖3 掃描電子顯微鏡下銅綠假單胞菌生物膜細胞形態(tài)變化Fig.3 Morphological changes of P.aeruginosa biofilm cells under scanning electron microscopy

轉錄組測序分析顯示5×MIC亞胺培南處理后(圖4)，上調的基因有732個，下調的基因764個，基因功能分析后發(fā)現有功能的上調基因有55個，下調的基因72個(表1)；5×MIC美羅培南處理后(圖5)，上調的基因有802個，下調的基因866個，其中具有功能的上調基因有59個，下調的基因69個(表2)。經過碳青霉烯類藥物處理后，可引起蛋白質涉及運輸、代謝及周轉的基因在表達水平上出現總體的上調趨勢，大量參與氨基酸轉運及代謝的基因如甘氨酸脫氫酶、β-丙氨酸-丙酮酸氨基轉移酶、2-異丙基蘋果酸合酶LeuA、天冬酰胺合成酶B(AsnB)等表達水平均有所上調，而只有相對較少的參與氨基酸轉運及代謝的基因表達水平下調。經碳青霉烯類藥物處理后，主要參與生物膜細胞形成、發(fā)展的基因表達水平有所下調。此外，還可影響參與細胞應激反應的基因表達水平。

表1 亞胺培南處理后基因功能分析Tab.1 Analysis of gene function after IPM treatment

2.5 實時熒光定量PCR對轉錄組測序結果的驗證

圖4 亞胺培南處理后差異基因表達分析Fig.4 Differential gene expression analysis after IPM treatment

圖5 美羅培南處理后差異基因表達分析Fig.5 Differential gene expression analysis after MEM treatmen

表2 美羅培南處理后基因功能分析Tab.2 Analysis of gene function after MEM treatment

qRT-PCR結果(表3)顯示處理組多糖合成相關基因algD、pslA和pelA的表達量均比校準狀態(tài)低，這與轉錄組測序的結果一致。

3 討論

銅綠假單胞菌是醫(yī)院感染的重要條件致病菌，能引起人和動物的感染，也是慢性感染的常見致病菌，治療非常困難[9]。近年來，由于抗菌藥物的廣泛使用甚至濫用，使得銅綠假單胞菌耐藥現象越來越嚴重；同時，銅綠假單胞菌極易黏附在人體組織或者是醫(yī)學材料表面進而形成生物膜，引發(fā)機體的免疫反應，從而造成組織損傷以及持續(xù)性慢性感染，這些都給臨床上治療銅綠假單胞菌引起的感染造成了較大的困難。

靜態(tài)生物膜形成能力檢測結果發(fā)現5×MIC碳青霉烯類藥物能抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成但對已經形成的生物膜影響甚微，表明無論菌株對抗菌藥物是否具有耐藥性，如果已經形成生物膜感染，治療都存在較高的難度，因此防止生物膜形成的預防性抗菌藥物治療是至關重要的。同時，掃描電子顯微鏡結果顯示，5×MIC碳青霉烯類藥物能導致銅綠假單胞菌生物膜細胞變大、變圓、空泡化以及數量減少，但去除藥物后繼續(xù)孵育發(fā)現生物膜細胞形態(tài)基本恢復正常，表明了碳青霉烯類藥物只能引起生物膜細胞暫時的形態(tài)改變，去除碳青霉烯類藥物后可使生物膜恢復正常狀態(tài)，這提示了臨床治療時持續(xù)用藥的重要性。

表3 碳青霉烯類藥物處理后多糖合成相關基因的相對表達量Tab.3 Expressions of polysaccharide synthesis related genes in three P.aeruginosa isolates with carbapenems treatment

轉錄組測序分析及基因功能分析發(fā)現，經過碳青霉烯類藥物處理后，可引起涉及運輸、代謝及周轉蛋白質的基因的表達水平總體出現上調趨勢，主要參與生物膜細胞形成、發(fā)展的基因表達水平有所下調。qRT-PCR結果發(fā)現處理組多糖合成相關基因algD、pslA和pelA的表達量均比校準狀態(tài)低，這與轉錄組測序的結果一致。algD基因是編碼藻酸鹽生物合成酶操縱子上的第一個基因，該基因的轉錄激活與藻酸鹽的合成密切相關[10]，研究表明在銅綠假單胞菌生物膜形成過程中藻酸鹽可以起到重要作用[11]。pslA是銅綠假單胞菌psl操縱子上的第一個基因，可編碼葡萄糖轉移酶；pelA是銅綠假單胞菌高度保守序列，研究表明這兩個多糖合成相關基因均在銅綠假單胞菌的黏附以及生物膜形成中起到關鍵作用[12-13]。

此外，有研究表明[14-15]碳青霉烯類藥物的主要作用位點為銅綠假單胞菌菌體內的青霉素結合蛋白(PBPs)，碳青霉烯類藥物處理后，銅綠假單胞菌生物膜細胞呈現出球形改變，這可能是由于碳青霉烯類藥物與細胞壁上PBP2結合，抑制了糖苷酶以及內肽酶的作用，這兩者可以參與細胞壁黏肽的合成。細胞壁合成被破壞后，進而導致細菌形成了無壁球狀體[16]。這個結果從分子水平上解釋了掃描電子顯微鏡下所觀察到的銅綠假單胞菌生物膜細胞形態(tài)變化。

總之，本研究表明經碳青霉烯類藥物處理后的銅綠假單胞菌通過一系列復雜的調控途徑，使其生物膜細胞出現短暫的形態(tài)學改變。這些結果將為我們治療由銅綠假單胞菌引起的生物膜感染奠定基礎。