何玲敏 蔡新 毛鑫鑫 李楠 馬曉杰 張俊輝 吳秋芳 游新勇

摘要?采用Biolog ECO板法研究小麥不同生育期、不同器官的內(nèi)生菌多樣性。結(jié)果表明，小麥整個(gè)生長(zhǎng)周期中，葉部?jī)?nèi)生菌多樣性水平顯著高于根、莖部位;揚(yáng)花期小麥內(nèi)生菌多樣性水平較高，其次是苗期和成熟期;且各組織部位內(nèi)生菌種群豐度和均一度均較高。該研究了解了小麥各生育期、各器官內(nèi)生菌的多樣性，為小麥內(nèi)生菌多樣性與宿主關(guān)系的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為小麥病蟲(chóng)害的生物防治提供材料。

關(guān)鍵詞?小麥;內(nèi)生菌;Biolog ECO;生物多樣性

中圖分類(lèi)號(hào)?S?182文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2019）23-0157-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.045

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Biodiversity Research of Wheat Endophytic Bacteria Based on Biolog ECO Plate Method

HE Ling?min，CAI Xin，MAO Xin?xin et al?（College of Biology and Food Engineering，Anyang Institute of Technology， Anyang，Henan 455000）

Abstract?The endophytic bacteria diversity in different growth stages and organs of wheatwas studied using Biolog ECO plate method.The results showed that the diversity of endophytic bacteria in leaves was significantly higher than that in roots and stems during the whole growth phase of wheat.The diversity of endophytic bacteria in wheat was the highest in the flowering stage，followed by that in the seedling stage and mature stage.Moreover，the abundance and uniformity of endophytic bacterial species were all high.This study discussed the diversity of endophytic bacteria in different growth stages and organs of wheat，which laid a foundation for further research on the relationship between endophytic bacteria diversity and the host plant，and provided materials for biological control of wheat diseases and pests.

Key words?Wheat;Endophytic bacteria;Biolog ECO;Biodiversity

小麥?zhǔn)俏覈?guó)重要糧食作物之一，其體表和體內(nèi)寄居著多種微生物。小麥在生長(zhǎng)過(guò)程中與內(nèi)生菌形成和諧共生的微生態(tài)體系，內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物具有抗病、防蟲(chóng)與促生等重要作用[1]。隨著植物微生態(tài)學(xué)的發(fā)展，人們更加重視利用微生物進(jìn)行小麥病害生物防治的研究和應(yīng)用。

植物內(nèi)生菌種類(lèi)多樣，普遍存在于各種水生和陸生植物中[2]。目前已在苔蘚[3]、藻類(lèi)[4]、地衣[5]、蕨類(lèi)[6]以及大量的裸子植物[7]和被子植物[8]中分離到內(nèi)生菌。在所有植物中尤其以高等植物中的內(nèi)生菌最為豐富。植物內(nèi)生菌主要分布于植物的根、莖、葉、葉鞘、花、種子等器官的細(xì)胞間隙或組織間隙。不同植物由于受到株齡、種類(lèi)、基因型、生長(zhǎng)地點(diǎn)、生育期、氣候條件、周?chē)渌参镱?lèi)群等條件的影響，其內(nèi)生菌的數(shù)量、種類(lèi)和分布往往不同，研究證明寄主植物與內(nèi)生細(xì)菌組成和多樣性存在密切關(guān)聯(lián)[9-10]。同時(shí)，同種農(nóng)作物內(nèi)生菌在不同器官的分布有很大差異，而且內(nèi)生菌在植物體內(nèi)并不是永遠(yuǎn)穩(wěn)定的，它會(huì)隨著環(huán)境變化而改變[11]。在植物不同生長(zhǎng)階段，其內(nèi)生菌的數(shù)量會(huì)有所差異。隨著植物的不斷生長(zhǎng)，其組織內(nèi)部的生理特征、外部表型特征發(fā)生改變，導(dǎo)致不同內(nèi)生細(xì)菌種群特征和分布也隨之發(fā)生變化。

Biolog ECO板是一種包含31種碳源和一個(gè)空白對(duì)照，共3個(gè)平行的96孔板。當(dāng)微生物利用孔中的碳源進(jìn)行呼吸代謝時(shí)，包含在碳源中的四唑紫染料會(huì)發(fā)生還原反應(yīng)，孔的顏色隨之發(fā)生變化。Biolog ECO板技術(shù)操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，且可最大限度地保留微生物群落原有的代謝特征，常用于環(huán)境微生物活性和功能多樣性的研究[12]。小麥內(nèi)生菌對(duì)小麥生長(zhǎng)、發(fā)育和抗逆過(guò)程起著至關(guān)重要的作用，且在植物病害生物防治中具有重要地位[13]。因此，研究小麥不同生育期、不同器官的內(nèi)生菌多樣性，可為小麥內(nèi)生菌多樣性與宿主關(guān)系的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為小麥病蟲(chóng)害的生物防治提供材料。

1材料與方法

1.1?材料

1.1.1?小麥品種。供試小麥品種為安陽(yáng)工學(xué)院培育的AG1218。

1.1.2?培養(yǎng)基及組成。

內(nèi)生細(xì)菌分離培養(yǎng)基為胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）;配方：胰蛋白胨 15.0 g/L，大豆蛋白胨 5.0 g/L，氯化鈉 5.0 g/L，瓊脂 15.0 g/L，pH 7.3。

內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）;配方：馬鈴薯浸粉 3.0 g/L，葡萄糖 20.0 g/L，瓊脂 14.0 g/L，pH 5.6。

1.1.3?試劑。75%乙醇，95%乙醇，0.1%升汞，次氯酸鈉（有效氯3.0%）。

1.2?方法

1.2.1?小麥樣品采集及處理。

分別在小麥苗期、揚(yáng)花期、成熟期，采用5點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)取10株。采集樣本時(shí)將小麥植株連根拔起（保持根部完整）輕輕抖落根部的大塊土壤后裝入無(wú)菌自封袋，并做好標(biāo)記，放入冰盒冷藏。帶回實(shí)驗(yàn)室后立即處理，或置于-80 ℃冰箱保藏備用。

1.2.2?小麥植株體表最適消毒方法的建立。

消毒方法1：材料在75%乙醇中浸泡l min后，用無(wú)菌水沖洗3次，然后用次氯酸鈉浸泡（各部位時(shí)間不同：根50 s～4 min，莖50 s～3 min，葉50 s～3 min，籽粒3～5 min），再用75%乙醇浸泡30 s，之后用無(wú)菌水清洗3次，用無(wú)菌濾紙吸干表面水分[14]。

消毒方法2：將材料浸入95%乙醇溶液中30 s，再轉(zhuǎn)入消毒劑（95%乙醇∶次氯酸鈉溶液=1∶1）中浸泡10 min取出，無(wú)菌水沖洗3次[15]。

消毒方法3：稱(chēng)取小麥根、莖、葉、籽粒各1.5 g（鮮重），用自來(lái)水沖洗干凈，75%乙醇表面消毒30 s后，再用0.1%升汞進(jìn)行表面消毒（根部6～8 min，莖4～5 min，葉2～3 min），無(wú)菌水沖洗5～6次后晾干[16]。

1.2.2.1?小麥內(nèi)生菌菌懸液的制備。

取2 g表面消毒后的小麥樣本，轉(zhuǎn)入盛有5 mL無(wú)菌水的滅菌研缽中，充分研磨，靜置5 min，上清液即為小麥內(nèi)生菌混合菌懸液。

1.2.2.2?小麥內(nèi)生菌的分離和培養(yǎng)。

取上述菌懸液1 mL，梯度稀釋10-1～10-6，取100 μL不同濃度梯度的稀釋液分別涂布于TSA平板（分離細(xì)菌）和PDA平板（分離真菌）上，每處理重復(fù)5次，倒置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，3 d后進(jìn)行菌落觀察，并統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量和形態(tài)。

1.2.2.3?小麥體表消毒效果檢驗(yàn)。

將消毒后的組織置于5 mL無(wú)菌水中振蕩1 min，取100 μL懸浮液涂布于分離培養(yǎng)基上，倒置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d，記錄是否有菌落生長(zhǎng)。

1.2.3?Biolog ECO板法測(cè)定小麥內(nèi)生菌多樣性。

當(dāng)微生物利用孔中的碳源進(jìn)行呼吸代謝時(shí)，孔的顏色隨之發(fā)生變化。微生物的整體活性用每孔顏色平均變化率（average well color development，AWCD）來(lái)描述，碳源利用程度越大，AWCD值越大。用McIntosh指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)對(duì)小麥各生長(zhǎng)期、各組織部位內(nèi)生菌的功能多樣性、種群豐度和均勻度進(jìn)行評(píng)估。McIntosh指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)的具體描述及計(jì)算公式見(jiàn)表1。

取10-3稀釋液接種至Biolog ECO板上，每孔接種量為150 μL。將生態(tài)板于25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，期間每隔24 h用Biolog自動(dòng)讀板儀在590 nm下讀取OD值，根據(jù)表1中的公式計(jì)算各指數(shù)。由AWCD值、McIntosh指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)共同評(píng)估不同生長(zhǎng)期、不同組織部位小麥內(nèi)生菌的群落多樣性。

2?結(jié)果與分析

2.1?小麥植株體表最適消毒方法

通過(guò)對(duì)常用的3種小麥組織表面消毒方法進(jìn)行比較，篩選出小麥根、莖、葉、籽粒組織部位的最適表面消毒方法。用IBM SPSS Statistics 20.0軟件對(duì)平板菌落數(shù)量及種類(lèi)進(jìn)行多重比較分析（Tukey檢驗(yàn)法，P<0.05）。

由圖1a和1c可知，無(wú)論是小麥根、莖、葉部位還是籽粒部位，采用消毒方法3消毒小麥植株體表，平板涂布法分離得到的小麥內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌的數(shù)量均介于消毒方法1和消毒方法2之間。消毒方法1分離得到的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量最多，而消毒方法2篩選得到的內(nèi)生真菌數(shù)量最多。

由圖1b和1d可知，小麥根、莖、葉、籽粒組織，采用消毒方法3分離得到的細(xì)菌種類(lèi)和真菌種類(lèi)均顯著高于消毒方法1和消毒方法2。

綜上所述，消毒方法3的消毒能力和作用時(shí)間分離得到的小麥內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌的數(shù)量和種類(lèi)均較優(yōu)。因此，采用消毒方法3對(duì)小麥體表進(jìn)行消毒，從而準(zhǔn)確評(píng)估小麥各生長(zhǎng)期、各器官內(nèi)生菌的多樣性。

2.2?小麥內(nèi)生菌多樣性評(píng)估

利用Biolog全自動(dòng)微生物鑒定儀測(cè)定小麥各生長(zhǎng)期、各器官內(nèi)生菌的多樣性。由圖2可知，小麥整個(gè)生長(zhǎng)周期中，葉部?jī)?nèi)生菌的多樣性水平遠(yuǎn)高于根、莖部位，而根、莖部位內(nèi)生菌多樣性水平較接近且變化幅度較小;而揚(yáng)花期葉部?jī)?nèi)生菌多樣性水平較高，其次是苗期和成熟期。

用McIntosh指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)對(duì)小麥各生長(zhǎng)期、各器官內(nèi)生菌的功能多樣性、種群豐度和均勻度進(jìn)行評(píng)估。由圖3可知，小麥各生長(zhǎng)期葉部的McIntosh指數(shù)和Shannon指數(shù)均顯著高于根部和莖部，而根、莖、葉和籽粒部位的McIntosh指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)差異不大。由此可知，在小麥整個(gè)生長(zhǎng)周期中，葉部?jī)?nèi)生菌多樣性水平最高，且各組織部位內(nèi)生菌種群豐度和均一度均較高。

3?結(jié)論與討論

在小麥內(nèi)生菌分離過(guò)程中，表面消毒方法很關(guān)鍵。植株表面消毒方法不當(dāng)，可能混入部分體表菌，導(dǎo)致內(nèi)生菌的數(shù)量或種類(lèi)偏多;或使部分內(nèi)生菌被殺死，導(dǎo)致內(nèi)生菌的數(shù)量或種類(lèi)偏少。因此，使用合適的表面消毒方法對(duì)保證小麥內(nèi)生菌的分離效果非常必要[17]。該研究對(duì)小麥體表消毒方法進(jìn)行了篩選，得到最適的小麥體表消毒方法：稱(chēng)取小麥根、莖、葉、籽粒各1.5 g（鮮重），用自來(lái)水沖洗干凈，75%乙醇表面消毒30 s后，0.1%升汞消毒（根部6～8 min，莖4～5 min，葉2～3 min），無(wú)菌水沖洗5～6次后晾干，然后進(jìn)行組織研磨、平板涂布。整個(gè)消毒過(guò)程均在無(wú)菌操作臺(tái)中進(jìn)行。

隨著小麥的不斷生長(zhǎng)，其組織內(nèi)部的生理特征、外部表型特征、環(huán)境變化等，導(dǎo)致不同內(nèi)生菌種群特征和分布也隨之發(fā)生變化。該研究采用Biolog ECO板技術(shù)評(píng)估小麥品種AG1218的內(nèi)生菌多樣性，結(jié)果表明，在小麥整個(gè)生長(zhǎng)周期中，葉部?jī)?nèi)生菌多樣性水平顯著高于根、莖部位，而根、莖部位內(nèi)生菌多樣性水平較接近且變化幅度較小;揚(yáng)花期小麥內(nèi)生菌多樣性水平較高，其次是苗期和成熟期;且各組織部位內(nèi)生菌種群豐度和均一度均較高。該研究結(jié)果與前人相關(guān)研究結(jié)果一致[13-14，16]。

小麥抽穗揚(yáng)花期是小麥由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)完全轉(zhuǎn)化為生殖生長(zhǎng)的標(biāo)志，也是決定麥穗籽粒多少的關(guān)鍵期。該階段是小麥需水、肥的高峰期，水肥供應(yīng)充足，小麥內(nèi)生菌也會(huì)快速增殖，故在小麥揚(yáng)花期時(shí)內(nèi)生菌多樣性水平較高。小麥揚(yáng)花期葉片部位存在大量的內(nèi)生菌，這可能與葉片光合作用有關(guān)。

同時(shí)，在對(duì)小麥品種AG1218內(nèi)生菌多樣性研究中，還篩選到幾株對(duì)小麥赤霉病菌有較強(qiáng)拮抗作用的內(nèi)生菌。下一步將對(duì)這些拮抗菌株的生防能力及對(duì)小麥赤霉病的生防效果進(jìn)行研究，深入探討拮抗菌對(duì)小麥赤霉病的生物防治機(jī)理，旨在為小麥赤霉病的生物防治提供候選菌株。

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