劉媛媛 解林奇 吳 棟 李 康 陳浩天 宋維平 閆 雪*

（1.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司飼用微生物工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100192；2.山東衛(wèi)康生物醫(yī)藥科技有限公司，山東臨沂276016；3.沈陽(yáng)科技學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110167）

2017 年6 月22 日，農(nóng)業(yè)部印發(fā)了《全國(guó)遏制動(dòng)物源細(xì)菌耐藥行動(dòng)計(jì)劃（2017-2020年）》提出，推進(jìn)獸用抗生素藥物減量化使用，在2020年底以前，將退出所有促生長(zhǎng)類(lèi)抗菌藥物添加劑品種，飼料端“禁抗”，養(yǎng)殖端減抗、降抗為必然！幼齡動(dòng)物是抗生素使用量最多的階段，飼用抗生素作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑對(duì)緩解仔豬早期斷奶應(yīng)激具有良好的作用效果，因此尋找有效的飼用抗生素替代品成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。目前飼用抗生素替代品主要包括微生態(tài)制劑、低聚糖、酶制劑、植物提取物等[1]。乳桿菌可以黏附、定植于動(dòng)物腸黏膜表面，對(duì)宿主腸道黏膜免疫系統(tǒng)具有調(diào)控作用，進(jìn)而改善仔豬腸道健康[2]。殼寡糖是由2～10個(gè)氨基葡萄糖通過(guò)β-1，4-糖苷鍵連接而成的寡糖，水溶性好，可提高斷奶仔豬生長(zhǎng)性能，提高血清抗氧化指標(biāo)，增加有益菌數(shù)量[3]。但目前尚未有關(guān)于飼料中共同添加殼寡糖和乳桿菌對(duì)斷奶仔豬應(yīng)用效果的研究報(bào)道，本試驗(yàn)通過(guò)研究殼寡糖和干酪乳桿菌對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、血清中抗氧化酶活性以及腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響，旨在為益生菌與益生元在畜禽飼料中科學(xué)配伍使用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

殼寡糖由山東衛(wèi)康生物醫(yī)藥科技有限公司提供，聚合度為2～10，相對(duì)分子量≤2 000 Da，脫乙酰度90%，純度80%。干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）粉劑由北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司飼用微生物工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，粉劑活菌含量為1×1011CFU/g，制備成活菌含量為1×1010CFU/kg，備用。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與日糧

試驗(yàn)動(dòng)物選用“杜×長(zhǎng)×大”三元雜交斷奶仔豬，基礎(chǔ)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在唐山大北農(nóng)豬育種科技有限責(zé)任公司動(dòng)物試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行，采用312頭30日齡體重為(7.06±0.02) kg杜×長(zhǎng)×大三元雜交斷奶仔豬，根據(jù)“體重相近、公母各半”的原則隨機(jī)分成4個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)13頭豬。分組情況為：飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)日糧的對(duì)照組(A)、每千克飼料添加0.5 g殼寡糖的試驗(yàn)組（B）、每千克飼料添加1010CFU 干酪乳桿菌的試驗(yàn)組（C）以及同時(shí)添加殼寡糖與干酪乳桿菌的試驗(yàn)組（D），見(jiàn)表2。豬只自由采食和飲水，試驗(yàn)進(jìn)行32 d。

表1 基礎(chǔ)日糧配方與營(yíng)養(yǎng)水平[4]

表2 不同添加劑試驗(yàn)分組

1.4 樣品采集與檢測(cè)

1.4.1 生長(zhǎng)性能的測(cè)定

試驗(yàn)第0 d、第14 d 和第32 d 分別對(duì)豬進(jìn)行空腹稱(chēng)重，試驗(yàn)期間準(zhǔn)確記錄每天采食量，計(jì)算平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）和料重比（F/G），并統(tǒng)計(jì)腹瀉率。

1.4.2 血清抗氧化酶活性測(cè)定

試驗(yàn)中期第14 d 和結(jié)束時(shí)(第32 d)，采集豬前腔靜脈血液，分離血清，于-80 ℃冷凍保存。采用南京建成生物科技有限公司試劑盒檢測(cè)血清中相關(guān)抗氧化酶活性，如總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）等。

1.4.3 糞便微生物的測(cè)定

采集第0、14 d 和第32 d 斷奶仔豬糞便，使用天根生化科技(北京)有限公司糞便基因組DNA 提取試劑盒，提取基因組DNA，-20 ℃保存待測(cè)。結(jié)合變性梯度凝膠電泳（DGGE）與16S rDNA測(cè)序技術(shù)，分析斷奶仔豬糞便微生物種群結(jié)構(gòu)與多樣性。試驗(yàn)操作參照曾燕等[5]方法，圖譜分析采用Quantity One(Bio-Rad)凝膠定量軟件。測(cè)序結(jié)果使用BLAST 在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SAS 軟件8.0 版GLM 程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用鄧肯氏法（Duncan's 法），以P＜0.05為顯著水平，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼寡糖與干酪乳桿菌對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響（見(jiàn)表3）

表3 殼寡糖與干酪乳桿菌對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

2.2 殼寡糖與干酪乳桿菌對(duì)斷奶仔豬血清抗氧化酶活性的影響（見(jiàn)表4）

表4 殼寡糖與干酪乳桿菌對(duì)斷奶仔豬血清中抗氧化酶活性的影響

由表4可知，與A組相比，在第14 d階段B組有提高血清中總抗氧化能力（T-AOC）與過(guò)氧化氫酶（CAT）活力的微弱趨勢(shì)，但同時(shí)也使血清中丙二醛（MDA）含量稍有升高；C組有增加血清中過(guò)氧化氫酶（CAT）活力并降低丙二醛（MDA）含量的趨勢(shì)；D 組則同時(shí)提高了血清中總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活力，且降低丙二醛（MDA）含量；但是各組差異均不顯著（P＞0.05）。與A組相比，第32 d階段，B組顯著提高了谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）的活力（P＜0.05），并降低丙二醛（MDA）的含量（P＞0.05）；B、C、D組均提高了血清中超氧化物歧化酶（SOD）與過(guò)氧化氫酶（CAT）的活力，但差異不顯著（P＞0.05）；C、D 組使丙二醛（MDA）含量稍有升高，但差異不顯著(P＞0.05)。

2.3 殼寡糖與干酪乳桿菌對(duì)斷奶仔豬糞便微生物多樣性的影響

2.3.1 飼喂殼寡糖與干酪乳桿菌14 d 斷奶仔豬的糞便DGGE檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)標(biāo)記條帶測(cè)序結(jié)果分析可見(jiàn)，仔豬飼喂各組產(chǎn)品14 d后44日齡仔豬糞便中的1號(hào)弗林氏丁酸桿菌（Flintibacter butyricus）菌屬的某些菌株在C、D組中較A、B組明顯增多；2號(hào)卷曲乳桿菌（Lactobacillus crispatusDSM 20584）菌屬中的某些菌株在D組中較其他組明顯增多（圖1、表5）。圖譜聚類(lèi)分析與樣品相似度結(jié)果顯示：仔豬飼喂各組日糧14 d后44日齡仔豬糞便微生物的聚類(lèi)現(xiàn)象明顯，說(shuō)明各組日糧在斷奶仔豬前期對(duì)仔豬糞便的微生物組成有明顯影響（圖2、圖3）。

圖1 試驗(yàn)14 d各組仔豬的糞便DGGE圖譜

表5 試驗(yàn)14 d各組斷奶仔豬糞便DGGE圖譜中標(biāo)記條帶測(cè)序結(jié)果

圖2 試驗(yàn)14 d各組仔豬糞便DGGE圖譜聚類(lèi)分析結(jié)果

圖3 試驗(yàn)14 d各組仔豬糞便DGGE圖譜樣品相似度結(jié)果

2.3.2 飼喂殼寡糖與干酪乳桿菌32 d 仔豬斷奶的糞便DGGE檢測(cè)結(jié)果

仔豬飼喂各組日糧32 d的62日齡仔豬糞便中的1號(hào)真桿菌屬（Eubacterium coprostanoligenesHL）中的某些菌株在A、D兩組中較其他組多；2號(hào)布氏瘤胃球菌（Ruminococcus bromiiATCC 27255）菌屬中的某些菌株和3 號(hào)羅氏弧菌（Roseburia intestinalisDSM 14610）菌屬中的某些菌株在C、D 組中的數(shù)量明顯高于A、B 組（見(jiàn)圖4、表6）。仔豬飼喂各組日糧32 d 的62日齡仔豬糞便的微生物組成沒(méi)有明顯聚類(lèi)現(xiàn)象，說(shuō)明隨著仔豬的成長(zhǎng)，個(gè)體差異占據(jù)主要作用，微生物組成也隨個(gè)體差異而聚類(lèi)分散（圖5、圖6）。

綜上所述，仔豬飼喂各組日糧14 d 后44 日齡仔豬糞便微生物組成區(qū)別較明顯。試驗(yàn)各組聚類(lèi)明顯，C、D 組對(duì)仔豬糞便的微生物組成中某些菌株的影響一致。

3 討論

同時(shí)添加殼寡糖與干酪乳桿菌（D 組）對(duì)斷奶仔豬在15～32 d 階段生長(zhǎng)性能的影響效果顯著，料肉比下降了0.15。劉媛媛等[3]在基礎(chǔ)日糧中添加0.5 g/kg殼寡糖可提高28 日齡斷奶仔豬15～35 d 和0～35 d 這兩個(gè)階段的平均日增重并顯著降低料重比。劉偉學(xué)等[6]在基礎(chǔ)日糧中添加干酪乳桿菌能夠提高仔豬生長(zhǎng)性能。由此可見(jiàn)復(fù)合添加D組效果優(yōu)于單獨(dú)使用B組、C組。這與徐晨希等[7]研究殼寡糖和丁酸梭菌對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能的影響結(jié)果不一致，復(fù)合添加并未優(yōu)于單獨(dú)使用的結(jié)果。C組降低了斷奶仔豬腹瀉率，本次試驗(yàn)周期內(nèi)斷奶仔豬腹瀉并不明顯。張魏偉等[8]研究指出飼喂干酪乳桿菌能有效保護(hù)腸道組織結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)和發(fā)育，可預(yù)防斷奶仔豬腸道疾病，但在已出現(xiàn)炎癥時(shí)，直接飼喂干酪乳桿菌不會(huì)起到明顯的保護(hù)和治療作用?？h怡涵等[9]也指出灌喂干酪乳桿菌對(duì)斷奶前仔豬ADFI、ADG 和F/G 均無(wú)顯著影響，但能顯著降低仔豬腹瀉率，提高斷奶后仔豬ADFI 和ADG，顯著降低F/G，但對(duì)斷奶后腹瀉率無(wú)顯著影響。

圖4 試驗(yàn)32 d各組仔豬的糞便DGGE圖譜

表6 試驗(yàn)32 d各組斷奶仔豬糞便DGGE圖譜中標(biāo)記條帶測(cè)序結(jié)果

圖5 試驗(yàn)32 d各組仔豬糞便DGGE圖譜聚類(lèi)分析結(jié)果

圖6 試驗(yàn)32 d各組仔豬糞便DGGE圖譜樣品相似度結(jié)果

試驗(yàn)14 d B、C、D組均對(duì)提高血清中各抗氧化指標(biāo)有一定作用，但效果并不顯著（P＞0.05）；試驗(yàn)32 d B 組顯著提高了血清中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSHPx）的含量（P＜0.05），并降低了丙二醛（MDA）的含量（P＞0.05）。這與劉媛媛等[3]研究結(jié)果基本一致，0～35 d階段，基礎(chǔ)日糧中添加0.5 g/kg 殼寡糖顯著提高了血清中超氧化物歧化酶（SOD）的含量。本次研究結(jié)果再次證明，使用該劑量殼寡糖可以提高血清中超氧化物歧化酶（SOD）與過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性，但差異不顯著。說(shuō)明殼寡糖作為飼料添加劑單獨(dú)使用，在提高動(dòng)物機(jī)體抗氧化酶活性方面有很好的功效。飼糧中同時(shí)添加殼寡糖和干酪乳桿菌對(duì)因斷奶導(dǎo)致的氧化應(yīng)激也具有一定的作用效果，D組14 d與32 d血清中超氧化物歧化酶（SOD）與過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性與A組相比有所提高，但差異不顯著。由此可推測(cè)殼寡糖與干酪乳桿菌之間存在協(xié)同效果，這與李陽(yáng)等[10]研究肉雞飼糧中添加殼寡糖和干酪乳桿菌可顯著改善動(dòng)物機(jī)體抗氧化性能結(jié)果一致。

試驗(yàn)14 d，C、D 組中弗林氏丁酸桿菌（Flintibacter butyricum）與卷曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus）較A、B 組明顯增多。前一種細(xì)菌具有利用糖類(lèi)和蛋白生產(chǎn)丁酸的能力[11]，而丁酸是腸道菌群的主要代謝產(chǎn)物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等生理功能，對(duì)腸道疾病具有有益影響；同時(shí)可減少不耐酸的致病菌數(shù)量，如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和彎曲桿菌，并能促進(jìn)腸道有益微生物的生長(zhǎng)[12]，丁酸還能通過(guò)影響腸道pH值而影響消化酶的活性[13]。后一種乳酸菌是可產(chǎn)生雙氧水的益生菌，常用于預(yù)防與治療細(xì)菌性陰道炎[14]，可降低因致病菌引起的促炎因子的表達(dá)預(yù)防腹瀉[15]。飼喂干酪乳桿菌或與殼寡糖配伍可有效增加仔豬腸道抗炎性與產(chǎn)丁酸的益生菌數(shù)量。試驗(yàn)32 d，A、D兩組中真桿菌屬（Eubacterium coprostanoligenes）較其他組多；C、D 組中布氏瘤胃球菌（Ruminococcus bromii）和羅氏弧菌（Roseburia intestinalis）的數(shù)量明顯高于A、B組。以上三種菌均為有益菌：Eubacterium coprostanoligenes可使膽固醇降解為能被腸道吸收的糞醇并排出體外，布氏瘤胃球菌（Ruminococcus bromii）通過(guò)消化食物釋放能量[16]，羅氏弧菌（Roseburia intestinalis）通過(guò)分解糖產(chǎn)生丁酸[17]。

綜合以上分析結(jié)果，殼寡糖作為飼料添加劑有顯著的抗氧化效果；干酪乳桿菌則可提高腸道益生菌數(shù)量改善斷奶仔豬腹瀉率；同時(shí)添加殼寡糖和干酪乳桿菌可以有效提高斷奶仔豬的飼料轉(zhuǎn)化率，并提高腸道有益微生物數(shù)量，使仔豬腸道更健康。