趙家桔 高 玲 李莉萍 張如蓮 高錦合劉迪發(fā) 徐 麗 應(yīng)東山

(1 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所 海南?？?71101;2 海南省南繁生物安全與分子育種重點實驗室 海南?？?71101)

百香果（Passiflora edulis）有較高的市場價值，種植前景良好。目前我國熱區(qū)已將百香果種植業(yè)列為“短、平、快”的精準扶貧項目［1]。但我國百香果優(yōu)質(zhì)苗木較為缺乏，存在品種單一，產(chǎn)量低，品質(zhì)、抗病性差等問題。百香果種植中90%的種苗都是采用無性繁育方法獲得。無性繁育中的扦插繁殖種苗存在變異大、品種易退化、病害增加、產(chǎn)量降低等問題［2]。在百香果產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程中，病毒病很大程度上制約了其發(fā)展［3]。由于頻繁的跨地區(qū)苗木銷售及引種種植，百香果病害日益加?。?]。種苗攜帶有莖基腐病菌、馬鈴薯Y病毒屬的百香果木質(zhì)化病毒、黃瓜花葉病毒等［5]，豇豆蚜傳花葉病毒［6]和大戟曲葉病毒［7]，影響了百香果種植業(yè)和加工業(yè)的發(fā)展，給產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展帶了巨大風險。針對百香果種苗帶病毒問題，組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為目前最有效去除病毒的方法，其效率高、周期短；同時能克服生產(chǎn)上無性繁殖率低，繁殖速度慢等缺點。許多學者對百香果的離體再生培養(yǎng)展開了研究，并取得一定成果。根據(jù)文獻報道，百香果不同器官部位，如莖節(jié)間、腋芽、葉片、子房、子葉、下胚軸、卷須、胚乳［8-11]均可作外植體材料進行快繁體系的建立；極少文獻報道利用腋芽為外植體［12-13]，通過不同的外植體誘導，可得到愈傷組織或不定芽。陳發(fā)興［10]試驗比較了百香果不同部位的萌芽率，發(fā)現(xiàn)葉盤和卷須誘導不定芽比較困難，而葉柄相對容易，莖段萌芽率可達100%。楊冬業(yè)等［11]研究表明，葉片萌芽極其困難，莖段的出芽率達100%。本研究利用組織培養(yǎng)對百香果莖尖進行脫毒研究，旨在為百香果產(chǎn)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展提供優(yōu)質(zhì)健康種苗，進而促進百香果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2018年2月至2019年2月在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所內(nèi)進行。材料采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所新品種標準與測試中心資源圃，品種為“黃金百香果”。

MS 基本培 養(yǎng) 基：4.43 g/L MS 粉，30 g/L 蔗糖及7 g/L瓊脂，pH 5.8，經(jīng)121℃，0.1 MPa、30 min高溫高壓滅菌后備用。

初代（誘導培養(yǎng)基）培養(yǎng)基：4.43 g/L MS 粉，30 g/L 蔗糖，7 g/L 瓊脂，6-BA 2.0 mg/L，GA30.5 mg/L，NAA 0.1 mg/L，pH 5.8，經(jīng)121℃，0.1 MPa、30 min高溫高壓滅菌后備用。

繼代增殖培養(yǎng)基：4.43 g/L MS 粉，30 g/L 蔗糖及7 g/L 瓊脂，6-BA 1.5 mg/L，NAA 0.1 mg/L，pH 5.8，經(jīng)121℃，0.1 MPa、30 min 高溫高壓滅菌后備用。

生根培養(yǎng)基：2.17 g/L 1/2 MS 粉，30 g/L 蔗糖及7 g/L 瓊脂，NAA 0.1 mg/L，IBA 0.1 mg/L，pH 5.8，經(jīng)121℃，0.1 MPa、30 min 高溫高壓滅菌后備用

1.2 方法

在黃金百香果生長旺盛時，以其頂芽或帶腋芽莖段為外植體材料，剪取50 cm 左右的百香果嫩梢，留腋芽及頂芽，截成2～3 cm 的莖段。莖段先用自來水沖洗2～3 次，再用蒸餾水沖洗1 次，在無菌環(huán)境中用無菌水沖洗兩遍，用75%酒精消毒30 s，無菌水洗滌一次，隨后按照表1 中處理組A1～A4 進行消毒處理，處理時在消毒劑中滴加2～3滴吐溫，消毒期間不斷地晃動三角瓶，使消毒劑充分與材料接觸，消毒劑處理后用無菌水沖洗5～6 次，每次沖洗3 min，用濾紙吸干莖段表面的水分。于解剖鏡下剝?nèi)∏o尖（0.5～1.0 mm）作為外植體，接種于初代培養(yǎng)基中。

表1 不同消毒時間的處理

1.2.1 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光照強度2000 lx 左右，光照時長12 h/d。

1.2.2 初代培養(yǎng)

按照第一步篩選的消毒時間剝?nèi)∏o尖接種于不同濃度的GA3，NAA和6-BA 1.0～2.0 mg/L 處理的培養(yǎng)基上，每個處理接種20 個大小較為一致的莖尖。在初代培養(yǎng)基上培養(yǎng)35 d 后，轉(zhuǎn)接到繼代增殖培養(yǎng)基中，每瓶接種2 個芽尖，每處理接種60個芽尖，培養(yǎng)30 d，觀察芽增殖情況，以選取最佳濃度激素組合。

1.2.3 繼代增殖培養(yǎng)

待初代培養(yǎng)后得到的無菌外植體莖尖長至5～7 cm時，切段繼代培養(yǎng)，每段0.5 cm左右，帶一個節(jié)間，接種到激素組合為6-BA＋NAA 的MS 培養(yǎng)基（每升培養(yǎng)基附加30 g蔗糖，7 g瓊脂）中進行繼代培養(yǎng)，每兩個月繼代一次，反復(fù)繼代4～5次之后，統(tǒng)計其增殖系數(shù)和玻璃化程度，重復(fù)3次。

1.2.4 生根培養(yǎng)

挑選健康、長勢好且均勻的組培苗進行生根誘導，長度2～3 cm 的增殖芽，將嫩芽從基部切下，接 入0.05、0.1、0.15、0.2 mg/L NAA 配 合0.1 mg/L IBA 的1/2 MS 的培養(yǎng)基中進行壯苗生根，培養(yǎng)25 d進行結(jié)果統(tǒng)計分析。

1.2.5 練苗移栽

待組培苗根長到2～3 cm 時，進行練苗5～7 d左右。移栽到育苗缽內(nèi)，以透氣性、保水性較好的腐殖土為基質(zhì)，苗不僅生長旺盛，移栽成活率也高。

1.2.6 計算方法及數(shù)據(jù)處理

接種后7～15 d分別統(tǒng)計污染率、褐化率、存活率，相關(guān)計算公式如下：

污染率＝污染外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

褐化率＝外植體褐化數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

存活率＝（外植體接種總數(shù)－外植體污染數(shù)－褐化及被殺死的外植體數(shù)）/外植體接種總數(shù)×100%

采用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時間對百香果莖尖的影響

對黃金百香果外植體的消毒時間設(shè)置不同組合，統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在0.1%HgCl2作消毒劑的處理組，污染率隨著消毒時間的延長而降低，并且呈現(xiàn)顯著差異，褐化率則隨著消毒時間的延長而升高，但是3個試驗組的結(jié)果無顯著差異。處理組A3的存活率較高，但是隨著消毒時間的增長，10和12 min的試驗組無顯著差異。

根據(jù)各處理組污染率、褐化率和存活率的分析，處理組A3 為黃金百香果外植體的最佳消毒方式，具體操作為75%乙醇消毒30 s，0.1 HgCL2消毒10 min，可以獲得較低的污染率、褐化率以及較高的存活率（表2）。

表2 不同消毒時間對百香果莖尖的影響 單位：%

2.2 初代培養(yǎng)叢生芽誘導

在培養(yǎng)基中添加GA3莖尖萌動早，長勢較快，不易分化成從生芽；不同6-BA 濃度處理的莖尖萌發(fā)慢，且不同6-BA 濃度對外植體生長和分化有明顯影響。6-BA 濃度很小時，愈傷組織不易分化成從生芽。隨著6-BA 濃度的增加，愈傷化越早，越容易形成愈傷組織；分化類型隨著6-BA 濃度的增加，叢生芽越多。當6-BA 濃度為2 mg/L 時，外植體芽易形成愈傷組織，且愈傷組織大量生長，易分化成為叢生芽且較健壯（表3）。由此認為，培養(yǎng)基MS＋6-BA 2.0 mg/L＋GA30.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L是最適初代培養(yǎng)基。

表3 不同培養(yǎng)基對百香果莖尖叢生芽誘導情況

2.3 繼代增殖培養(yǎng)

觀察NAA 濃度為0.1 mg/L，6-BA 濃度分別為0.5、1.0、1.5和2.0 mg/L 繼代 培養(yǎng) 上培 養(yǎng)4 周后的增殖生長狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在6-BA 濃度為1.5 mg/L 的增殖培養(yǎng)基中的莖尖長勢快，葉片粗壯，顏色濃綠（圖1-A）；而6-BA 濃度為1.0 mg/L的增殖培養(yǎng)基中莖尖苗長勢緩慢，葉片細，植株矮?。▓D1-B）。

2.4 生根培養(yǎng)

誘導組培苗生根的重要條件是生根培養(yǎng)基，植物調(diào)節(jié)劑是提高百香果組培苗不定根的關(guān)鍵因素。把叢生芽（圖2）切割成單株小苗，接入不同生根培養(yǎng)基，25 d 后觀察。由表4 可知，生根培養(yǎng)基以1/2 MS 附加0.1 mg/L NAA和IBA 為最好，在此培養(yǎng)基上誘導的根粗壯，數(shù)目多，生長良好（圖3）。

2.5 煉苗移栽

煉苗（圖4）是組培苗生根不可缺少的環(huán)節(jié)。將經(jīng)生根壯苗培養(yǎng)獲得根長為2～3 cm 的苗，移入室外遮陰棚煉苗5～7 d，然后將培養(yǎng)瓶瓶蓋打開，在自然光下鍛練2～3 d。經(jīng)過鍛煉的幼苗用攝子輕輕地取出，放入濃度為0.1%多菌靈溶液中浸泡5 min，再用清水沖洗2～3次，把根部的培養(yǎng)基沖洗干凈，栽入體積比椰糠∶表土∶蛭石＝2∶1∶1 的混合基質(zhì)中，澆足定根水，放置于遮陽棚內(nèi)，保持濕潤，移栽后待10～15 d 新根與新葉長出，移栽成活率可達95%以上。

3 討論與結(jié)論

以百香果莖尖為材料，在解剖鏡下剝?nèi)∏o尖，莖尖需要在短時間內(nèi)誘導出大量的叢生芽，以芽生芽的方式建立再生體系是最快捷的途徑，再進行生根誘導，以便短時間內(nèi)可以得到大量的植株［11，14]，從而加快百香果繁殖速度，有利于脫毒苗及優(yōu)良種源的繁殖與保存。本試驗結(jié)果表明，最佳的消毒方式為75%的酒精溶液消毒30 s后再用0.1%HgCl2消毒10 min，這與焦楠［13]的最佳消毒方式類似，具體操作為75%乙醇消毒30 s，0.1%氯化汞消毒12 min，可以獲得較低的污染率、褐化率以及較高的存活率。最適初代培養(yǎng)基為MS＋6-BA 2.0 mg/L＋GA30.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，有利于叢生芽的誘導。本研究通過添加不同濃度的6-BA和NAA，對百香果莖尖初代培養(yǎng)基進行了篩選，發(fā)現(xiàn)2.0 mg/L 6-BA 可使百香果莖尖誘導出大量愈傷組織；在培養(yǎng)基中添加GA3，莖尖萌動早，長勢較快；最適繼代培養(yǎng)基為MS＋6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，適宜芽的增殖且利于壯苗；最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS＋NAA 0.1 mg/L＋IBA 0.1 mg/L，形成的苗健壯，生根率高達95%。本試驗采用1/2 MS 作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基效果較好，這與前人研究一致［11，13，15]。史沉魚等「14]在誘導百香果生根時發(fā)現(xiàn)，活性炭的加入可促進二級根的生成。

表4 不同培養(yǎng)基對百香果生根誘導的影響

莖尖培養(yǎng)的成功率主要取決于莖尖的大小，莖尖過大，脫毒不徹底；莖尖過小，則容易引起褐化。本文認為切取莖尖控制在0.5～1.0 mm 有利于其成活。繼代次數(shù)不能超過5次，長期繼代的試管苗有可能再感染病毒，還會引起芽變的可能。因此，脫毒試管苗組織快繁，需二年更換一次基礎(chǔ)苗，以提高試管苗的質(zhì)量。試管苗要及時進行繼代培養(yǎng)，因為長時間培養(yǎng)，不能及時轉(zhuǎn)移，容易出現(xiàn)“玻璃化”苗。