龔 敏 孫慧潔 張春冬

(海南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)檢驗(yàn)檢測(cè)預(yù)警防控中心 海南?？?70100)

檳榔果實(shí)（Areca seed），又名賓門(mén)、仁頻、榔玉等，是棕櫚科常綠植物檳榔的成熟種子。由于檳榔含有獨(dú)特的植物化學(xué)成分，有抗抑郁、降血壓、抗炎、抗氧化、抗血栓等藥理作用［1]，臨床上對(duì)治療疳癥、積滯、痢疾、便秘、小兒感冒等兒科疾病均有療效［2-4]。檳榔為海南農(nóng)民脫貧致富的主要經(jīng)濟(jì)作物之一［5]。近幾年來(lái)檳榔炭疽病、果腐病、煤煙病、黃化病等［6-7]病蟲(chóng)害嚴(yán)重影響了海南檳榔的產(chǎn)量。目前較有效的檳榔病蟲(chóng)害防治方法之一是噴灑農(nóng)藥。但農(nóng)藥的使用在防治檳榔病蟲(chóng)害的同時(shí)也會(huì)影響檳榔的質(zhì)量安全，檳榔農(nóng)藥殘留的檢測(cè)是保障檳榔質(zhì)量安全的手段之一。

據(jù)文獻(xiàn)記載，目前農(nóng)藥殘留檢測(cè)常用的方法有：氣相色譜法（GC）［8-9]、氣質(zhì)聯(lián)用法（GCMS）［10-11]、液 相 色 譜 法（LC）［12]和 液 質(zhì) 聯(lián) 用 法（LC-MS/MS）［13-14]。農(nóng)藥殘留質(zhì)譜測(cè)定通常與色譜分離技術(shù)聯(lián)用，以同時(shí)提供保留時(shí)間、質(zhì)荷比和離子豐度信息，是目前農(nóng)藥多殘留分析方法的主導(dǎo)技術(shù)和未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)，該技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中得到了廣泛的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。液相色譜—質(zhì)譜法（LC-MS）是液相色譜和質(zhì)譜的有機(jī)結(jié)合，高分離性能的液相色譜可用于檢測(cè)極性強(qiáng)和熱穩(wěn)定性差的農(nóng)藥成分［15]，質(zhì)譜具備高選擇性、高靈敏度的特點(diǎn)，因此能對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測(cè)［16]。

串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM）的HPLC-MS/MS［17-18]因具有更好的靈敏度和準(zhǔn)確性而被廣泛地應(yīng)用于農(nóng)藥多殘留檢測(cè)技術(shù)中。本研究基于傳統(tǒng)的QuEChERS 法并進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化，結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM）的HPLC-MS/MS 法，建立了檳榔中42種農(nóng)藥多殘留的定性、定量檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

日本島津公司生產(chǎn)的Nexerax2 型超高效液相色譜儀；美國(guó)AB 公司生產(chǎn)的AB SCIEX QTRAP 550 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀；杭州佑寧公司生產(chǎn)的MIX-2500混合儀；Thermo 科技公司的高速冷凍離心機(jī)；梅特勒托利多公司的ME-203/02電子天平；德國(guó)默克公司的水純化系統(tǒng)。

德國(guó)MERCK 公司的乙腈，甲醇，甲酸，乙酸，乙酸銨（色譜純級(jí)別）；上海安譜的尼龍過(guò)濾膜（0.22 μm）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

所用的吡蟲(chóng)啉、三唑磷等42 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品均來(lái)自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，濃度均為100 μg/mL。準(zhǔn)確吸取各標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，用乙腈定容至100 mL，得到濃度為0.1μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。檢測(cè)時(shí)，再用檳榔空白基質(zhì)溶液分別配制成2、5、10、20、50 ng/mL 的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品前處理

將新鮮檳榔鮮果樣品于-18℃以下冷凍至脆，高速粉碎機(jī)破碎，剪碎其纖維；準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g（精確至0.01 g）至50 mL 具塞離心管中，加入一定量的超純水浸潤(rùn)水化30 min，再加入20 mL 1%乙酸-乙腈，渦旋震蕩5 min；加入6 g MgSO4，1.5 g 乙酸鈉，渦旋混合1 min，8000 r/min 離心10 min，取0.5 mL 上清液與0.5 mL 超純水混勻過(guò)濾膜（0.22 μm）待測(cè)。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：phenomenex Kinetex 50 mm×3.0 mm，2.6 μm，填料為C18；柱溫：40℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相：A，0.1%甲酸-0.005 mol/L乙酸銨水；B，乙腈。洗脫條件見(jiàn)表1

表1 液相色譜洗脫條件

1.2.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

離子源：電噴霧離子源（ESI）；離子源溫度350℃；離子源電壓5500V；正離子掃描；數(shù)據(jù)采集運(yùn)用多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM）；CUR氣簾氣：30 psi，GS1噴霧氣：50 psi；GS2（輔助加熱器）：55 psi。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理方法的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

提取溶劑一般根據(jù)待測(cè)樣品和農(nóng)藥成分的特性進(jìn)行選擇，農(nóng)藥殘留分析常用的提取溶劑有甲醇、丙酮、乙酸乙酯和乙腈［19]。本研究對(duì)甲醇、丙酮、乙酸乙酯和乙腈4種有機(jī)溶劑進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)考察。結(jié)果表明：乙腈作為一種極性有機(jī)溶劑，能夠產(chǎn)生很好的相分離作用。本實(shí)驗(yàn)的樣品為檳榔鮮果，其含有大量的纖維，水分較少，為使樣品在試劑中分布均勻從而達(dá)到充分提取的目的，加入提取溶劑前先加入一定量的水進(jìn)行浸潤(rùn)水化，再在乙腈中加入1%的乙酸可使樣品提取液處于平衡緩沖狀態(tài)，從而提高并穩(wěn)定回收率。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇1% 的乙酸乙腈溶液作為提取溶劑。

2.1.2 凈化條件的選擇本試驗(yàn)分別考察了QuEchERS 的前處理方法中加PSA和不加PSA 的凈化效果。結(jié)果表明，使用PSA 對(duì)樣品進(jìn)行凈化時(shí)，PSA 在吸附極性雜質(zhì)的同時(shí)也會(huì)對(duì)某些農(nóng)藥成分有不同程度的吸附；不加PSA 時(shí)，雖然一定程度上存在雜質(zhì)干擾和基質(zhì)效應(yīng)，但目標(biāo)農(nóng)藥成分也可完全分離，回收率也能滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需求。因此本研究基于QuEchERS 前處理方法進(jìn)行改進(jìn)，省去PSA過(guò)程，直接提取分層后的上清液，與超純水混勻后過(guò)膜上機(jī)檢測(cè)。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜條件優(yōu)化

本研究分別考察了流動(dòng)相A（水、0.1%甲酸水溶液、5mmol/L 乙酸銨、0.1%甲酸水溶液和5 mmol/L 乙酸銨混合水溶液）以及流動(dòng)相B（乙腈、甲醇溶液）對(duì)峰形、響應(yīng)值等影響。結(jié)果表明，以流動(dòng)相A（0.1%甲酸水溶液和5 mmol/L乙酸銨混合水溶液）及流動(dòng)相B（乙腈溶液）作為流動(dòng)相時(shí)峰形更好，響應(yīng)值更高。42種農(nóng)藥的MRM總離子流色譜圖詳見(jiàn)圖1。

2.2.2 質(zhì)譜條件的確定

ESI 正離子模式下，采用針泵流動(dòng)注射進(jìn)樣方式對(duì)42 種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行Q1 SCAN，先確定待測(cè)物的分子離子質(zhì)荷比，找到目標(biāo)化合物母離子；再通過(guò)Product Ion Scan，確定子離子的質(zhì)荷比。通過(guò)選出的母、子離子，組建MRM離子對(duì)，對(duì)化合參數(shù)CE、DP 進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)對(duì)離子源參數(shù)（氣簾氣、離子化電壓、溫度、噴霧氣等）進(jìn)行優(yōu)化，建立MRM 模式下42 種農(nóng)藥的掃描方法，詳見(jiàn)表2。

表2 MRM模式下42種農(nóng)藥的掃描參數(shù)

續(xù)表2 MRM模式下42種農(nóng)藥的掃描參數(shù)

續(xù)表2 MRM模式下42種農(nóng)藥的掃描參數(shù)

2.3 方法評(píng)價(jià)

2.3.1 線(xiàn)性范圍和檢出限

分別配制了2、5、10、20、50 ng/mL 的42 種系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化好的儀器工作條件下依次進(jìn)樣，分別以峰面積Y為縱坐標(biāo)，濃度值X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。由表3 可知，42種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度在2～50 ng/mL，濃度與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）均高于0.999，符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范》（GB/T 27404-2008）中對(duì)校準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)不低于0.99的要求。

通過(guò)檢測(cè)檳榔空白基質(zhì)中添加已知低濃度農(nóng)藥參數(shù)的樣品和檳榔空白基質(zhì)樣品的測(cè)量信號(hào)進(jìn)行比較，考察檢出限，檢出限為信噪比（S/N）的3 倍，通過(guò)檢測(cè)計(jì)算，本方法農(nóng)藥多殘留的檢出限在0.1～3.2 μg/kg，詳見(jiàn)表3。

2.3.2 精密度和回收率試驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)用篩選好的檳榔樣品空白基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)，添加低、中、高3 個(gè)水平（10、50、100 μg/kg）進(jìn)行LC-MS/MS 分析，計(jì)算平均回收率和精密度，每個(gè)添加濃度做6個(gè)平行試驗(yàn)，用于考察本方法的回收率和精密度，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3 可知，3 個(gè)添加水平下，42 種農(nóng)藥的平均回收率范圍為75.9%～105.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于13.4%，表明該方法有較高的精密度和準(zhǔn)確度，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中對(duì)靈敏度、精準(zhǔn)度、準(zhǔn)確度及重復(fù)性、穩(wěn)定性的要求。

3 結(jié)論

通過(guò)調(diào)研，選取檳榔種植過(guò)程中使用較為普遍的農(nóng)藥，建立了檳榔中42 種農(nóng)藥多殘留的檢測(cè)方法，該方法采用改進(jìn)優(yōu)化的QuEChERS 前處理方法，并利用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析測(cè)定。結(jié)果表明：該QuEChERS-液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法操作簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確且重現(xiàn)性好，具有較好的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，能滿(mǎn)足檳榔鮮果中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)要求，適用于食用檳榔鮮果中農(nóng)藥殘留含量測(cè)定。