張 振,徐志璇,王麗娜,李 強,陳春花,任仲海

山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院,山東果蔬優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心/農(nóng)業(yè)部黃淮地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室,作物生物學國家重點實驗室,山東 泰安271018

番茄（Solanum lycopersicum）是世界范圍內(nèi)的重要經(jīng)濟作物之一。MYB 轉(zhuǎn)錄因子參與植物的生長調(diào)節(jié)、對生物和非生物脅迫的響應等。在擬南芥和水稻中，MYB 家族已被鑒定和研究[1,2]。擬南芥R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子MYB15 參與ABA 信號轉(zhuǎn)導，MYB15過表達株系對ABA 的敏感性增強，抗逆性增強[3]。生長素作為一種重要的激素，在頂端優(yōu)勢、調(diào)控生長及向性等方面有重要作用，擬南芥轉(zhuǎn)錄因子MYB77 響應生長素信號，在MYB77突變體中生長素應答基因的表達量顯著下降[4]。研究表明，擬南芥AtMYB33 蛋白能夠結(jié)合在花分生組織特性基因LEAFY啟動子8 bp 的序列上，在開花時調(diào)控GA 信號[5]。擬南芥R2R3MYB 蛋白FLP 與MYB88 共同調(diào)控生長素輸出載體基因PIN從而來影響根系的向重力性[6]。已有研究證明番茄中MYB74、MYB92、MYB78、MYB102、MYB62、MYB2、MYB64、MYB116、MYB113、MYB11能夠被NaCl 所誘導[7]。番茄SLFSM1 是果實特異的MYB 類轉(zhuǎn)錄因子，它可以與FSB1和另一個MYB 轉(zhuǎn)錄因子形成三重復合物共同調(diào)控細胞的擴增，在SLFSM1高量表達番茄株系中，果實小、中果皮薄、中果皮細胞較小，且還抑制了下胚軸子葉細胞的伸長[8]。有研究報道，擬南芥AtMYB30 轉(zhuǎn)錄因子，可以影響ANNs 蛋白介導的特異的胞內(nèi)鈣信號的產(chǎn)生，從而調(diào)控植物響應氧化脅迫和熱脅迫[9]。擬南芥AtMYB97，AtMYB101和AtMYB120能夠調(diào)控花粉管接受花粉，從而影響受精作用[10]。過表達菊花CmMYB2植株較野生型開花延遲，葉片數(shù)目增多，在擬南芥中過表達CmMYB2，能夠增強轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱和鹽脅迫的耐受性[11]。

在番茄中過表達MYB75能夠增強番茄的抗熱性，在煙草中過表達MYB75能夠增強煙草抗冷性[12]，且MYB75在煙草中異源表達和番茄中過表達都能夠分別增加煙草和番茄花青苷的合成，并增強植株的非生物脅迫能力[13]。前人研究表明，在番茄中過表達MYB75能改變果實顏色，Kiferle 等在Ailsa Craig（AC）中過表達MYB75使果實顏色變?yōu)樽仙?；孟夏等在中? 號中過表達MYB75能使果實顏色由紅色變?yōu)槌赛S色，類胡蘿卜素含量顯著提高。

本文發(fā)現(xiàn)在AC 中過表達SlMYB75能夠改變果實顏色和大小，種皮以及幼苗下胚軸顏色也亦明顯變化，且能夠提高果實含糖量以及果實硬度等。這為進一步研究SlMYB75基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以AC 和AC 為背景過表達SlMYB75的轉(zhuǎn)基因番茄為實驗材料，分別培養(yǎng)于山東農(nóng)業(yè)大學園藝試驗站、山東農(nóng)業(yè)大學本部科技創(chuàng)新大樓植物培養(yǎng)室以及光照培養(yǎng)箱中。本研究所使用的的煙草為實驗室保存的本生煙，培養(yǎng)于山東農(nóng)業(yè)大學本部科技創(chuàng)新大樓植物培養(yǎng)室。

本試驗所用的大腸桿菌（E.Coli）菌株為DH5α，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；農(nóng)桿菌菌株為LBA4404，由本實驗室自行保存。本實驗所用的載體為克隆載體pEASY-Blunt，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；表達載體pBI121 由本實驗室自行保存。

1.2 總RNA 的提取以及實時熒光定量PCR 分析

采用TRIZOL 法來進行轉(zhuǎn)基因番茄各組織的RNA 提取，以提取的總RNA 為模板，按照北京全式金生物技術(shù)有限公司EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super mix 試劑盒說明書進行。PCR 反應體系為：1 μL Anchored Oligo(dT)18Primer(0.5 μg/μL)，10 μL 2×ES Reaction Mix，1 μLEasyScriptRT/RI Enzyme Mix，1 μL gDNA Remover，水與RNA 共7 μL。PCR 反應程序為：42 ℃15 min，85 ℃5 s；PCR 產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳。熒光定量PCR 使用的儀器為BIO-RAD IQ5，所有PCR 反應都設(shè)3 次重復。PCR 反應體系為：2×Realtime PCR Super mix 10 μL，上、下游引物濃度為0.5 μmol·L-1，模板1 μL，加去離子水至20 μL。PCR 反應程序為：95 ℃預變性1 min，95 ℃15 s，60 ℃15 s，72 ℃30 s 40 個循環(huán)[14]。

1.3 轉(zhuǎn)基因番茄果實可溶性糖含量的檢測

取成熟期轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因果實各30 個，用糖度計進行檢測果實含糖量并進行統(tǒng)計，記錄每個果實含糖量。本文所有多重比較分析方法均為LSD 單因素方差分析，P＜0.05 為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

1.4 過表達載體的構(gòu)建

克隆的含有BamHI 和SalI 酶切位點的SlMYB75的CDS 片段連接到pEASY 克隆載體上，連接后進行大腸桿菌DH5α的轉(zhuǎn)化、用PCR 技術(shù)進行陽性克隆菌落的篩選、加入相應抗性激素進行搖菌、之后送鉑尚公司進行序列測序、再提取質(zhì)粒、用限制性內(nèi)切酶BamHI 和SalI 分別酶切測序正確的克隆載體質(zhì)粒和pBI121 表達載體質(zhì)粒。通過瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下切去膠片段，用試劑盒進行目的條帶的回收，用T4連接酶將載體與目的片段25 ℃連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。進行PCR 檢測后選陽性菌點、進行質(zhì)粒提取，再進行酶切驗證，根據(jù)測序結(jié)果與已知序列比對確認，然后用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。

1.5 亞細胞定位

選取BamHⅠ和XhoⅠ兩個限制性內(nèi)切酶酶切位點，將SlMYB75基因從peasy-Blunt 載體切下，并用試劑盒進行回收，對pROKⅡ表達載體用相同的酶切位點進行酶切后回收，再用T4連接酶在25 ℃將兩者進行連接，之后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，鑒定陽性克隆。構(gòu)建pROKⅡ-SlMYB75-GFP 載體完成后通過凍融法將質(zhì)粒pROKⅡ-SlMYB75-GFP 和p19 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404。在進行本生煙的侵染時，我們采用農(nóng)桿菌注射法。挑取陽性克隆接種到含卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基(25 mg·L-1Rif,50 mg·L-1Kan)，以每分鐘220 rpm 在28 ℃振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)12 h。之后將以上兩種農(nóng)桿菌菌液在4000×g 的水平離心機中離心10 min，懸浮(懸浮緩沖液:10 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1MES，150 μmol·L-1As)。p19 的菌液與pROKⅡ-SlMYB75-GFP 菌液等體積混合成一管溶液，在分光光度計儀器中測定OD600值，并使其在在0.6～0.8 之間。室溫黑暗處靜置3 h 后用去針頭針管注射長勢較好的煙草葉片，48～96 h 內(nèi)觀察結(jié)果。進行熒光觀察時，要撕取出較薄的下表皮進行觀察。GFP 經(jīng)488 nm 激光激發(fā)，通過550～590 nm 濾鏡后獲得熒光信號[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SlMYB75 蛋白結(jié)構(gòu)域分析

為了解SlMYB75蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，利用SMART[16]工具分析，發(fā)現(xiàn)SlMYB75含有275 個氨基酸，包含兩個典型的SANT 結(jié)構(gòu)域，構(gòu)成了經(jīng)典的R2R3MYB 結(jié)構(gòu)[17]。且含有兩個簡單的未知功能結(jié)構(gòu)域，根據(jù)以上分析結(jié)果，利用IBS.1.0 軟件繪制如圖1 所示SlMYB75結(jié)構(gòu)：

圖1 SlMYB75 蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.1 SlMYB75 protein domain

2.2 SlMYB75 的亞細胞定位

為了明確SlMYB75蛋白在細胞中的作用部位，利用農(nóng)桿菌介導的瞬時轉(zhuǎn)化法，將培養(yǎng)好的帶有SlMYB75與GFP 融合蛋白載體的農(nóng)桿菌注射到煙草葉片，培養(yǎng)兩天后在顯微鏡下觀察融合蛋白在煙草葉片細胞中的分布部位情況。以空載體注射煙草的結(jié)果作為對照。結(jié)果顯示：SlMYB75蛋白定位在細胞核中，說明該蛋白主要在細胞核中表達（圖2）。

圖2 SlMYB75-GFP 在煙草葉片細胞中的定位（標尺長度=20 μm）Fig.2 Localization of SlMYB75-GFP in tobacco leaf cells(Ruler length=20 μ m)

2.3 SlMYB75 基因的遺傳轉(zhuǎn)化、過表達株系表達量檢測以及組織表達特異性分析

為了探究SlMYB75基因在番茄中的功能，我們構(gòu)建了過表達載體，并在番茄中進行遺傳轉(zhuǎn)化。取野生型（wild type,WT）和轉(zhuǎn)基因植株兩個株系OE1 和OE2 的嫩葉，通過Trizol 法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再通過熒光定量檢測SlMYB75表達量。在兩個轉(zhuǎn)基因株系中，該基因表達量均顯著高于WT（圖3a）；另外，為了檢測SlMYB75基因在各組織中表達情況，分別取WT 與過表達SlMYB75株系幼根、嫩莖、幼葉、花（開花當天）、綠熟期果實，通過Trizol 法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過熒光定量檢測過表達株系中SlMYB75基因在各個組織中的表達量，發(fā)現(xiàn)SlMYB75基因在果實中表達量較高，在花中表達量較低（圖3b）。

圖3a SlMYB75 在WT 和過表達株系中的表達量（P＜0.01）；圖3 b SlMYB75 基因的組織表達分析；圖3 c 果實整體顏色觀察；圖3 d 果實外果皮顏色觀察；圖3 e 過表達與WT 果實解剖觀察；圖3 f 果實果肉顏色觀察（標尺=1 cm）Fig.3a Expression analysis of SlMYB75 in wild type and transgenic lines (P＜0.01)；Fig.3 b Tissue-specific expression profiles of SlMYB75；Fig.3 c Observation of the overall fruit color；Fig.3 d Observation of fruit outer skin color；Fig.3 e Overexpression and WT fruit anatomical observation；Fig.3 f Observation of fruit pulp color(Bars=1 cm)

2.4 過表達SlMYB75 改變果實顏色

通過觀察表型發(fā)現(xiàn)，過表達SlMYB75株系與WT 相比，完全成熟果實顏色發(fā)生明顯變化，解剖并分離果皮、果肉，發(fā)現(xiàn)過表達株系果實的果皮和果肉顏色均由紅色變?yōu)槌赛S色（圖3c-f）。

2.5 過表達SlMYB75 對果實重量以及含糖量影響

通過對果實重量測量統(tǒng)計，過表達株系完全成熟果實單果平均重量與WT 相比顯著下降（圖4a）。利用果實糖度計檢測成熟期轉(zhuǎn)基因與WT 番茄果實的含糖量，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)基因株系與WT 果實含糖量相比顯著上升，可溶性糖含量提高約18%，且具有顯著性差異（圖4b）。利用硬度計檢測成熟期轉(zhuǎn)基因與WT 番茄果實的硬度，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)基因株系與WT 果實硬度相比顯著上升。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)基因株系與WT 果實硬度相比顯著上升，硬度提高約42%，且具有顯著性差異（圖4c）。

圖4(a) SlMYB75 過表達株系與WT 完全成熟果實平均重量比較（P＜0.01）；圖4 (b)SlMYB75 過表達株系與WT 完全成熟果實平均可溶性糖含量比較（P＜0.01）；圖4 (c)SlMYB75 過表達株系與WT 完全成熟果實平均硬度比較（P＜0.01）；Fig.4(a) Average weight comparison between SlMYB75 overexpression lines and the total mature fruit of WT(P＜0.01)；Fig.4 (b)Average soluble sugar content comparison between SMYB75 overexpression lines and the total mature fruit of WT(P＜0.01)；Fig.4 (c)Average firmness comparison between SlMYB75 overexpression strain and WT fully mature fruit(P＜0.01)

2.6 過表達SlMYB75 使果實外果皮細胞變小

通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，相同發(fā)育時期（完熟期）的過表達SlMYB75株系果實外果皮細胞的平均面積與WT 相比明顯變小，通過掃描電鏡拍照、Image.J 軟件統(tǒng)計，表皮細胞面積顯著下降（圖5）。

圖5a WT果實外果皮細胞，標尺=100 μm；圖5 b,c SlMYB75 過表達轉(zhuǎn)基因果實外果皮細胞標尺=100 μm；圖5d 面積大小統(tǒng)計（P＜0.01）Fig.5a:Scanning electron micrographs of wild-type fruit exocarp cells,bars=100 μm；Fig.5b-c: SlMYB75 over-expressed transgenic fruit outer rind cells,scanning electron microscope,Bars=100 μm；Fig.5d:picture shows area size statistics.(P＜0.01)

2.7 過表達SlMYB75 株系種皮顏色與WT 存在明顯差異，種子千粒重沒有變化

將同時期收取的轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因種子烘干后，通過觀察發(fā)現(xiàn)，過表達株系種皮顏色明顯深于WT 種皮。為了檢測種子千粒重是否發(fā)生變化，隨機挑選OE1、OE2 和WT 種子進行測重，結(jié)果顯示：過表達SlMYB75并沒有使種子千粒重發(fā)生改變（圖6）。

圖6a 轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因種子的顏色比較。標尺=1 cm；圖6 b 轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因烘干后的種子千粒重量化圖；圖6 c,d 轉(zhuǎn)基因與WT 種子萌發(fā)率統(tǒng)計（P＜0.01）Fig.6a:Color comparison between transgenic and non-transgenic seeds.(Bar=1 cm)；Fig.6 b:Thousand seed weight after transgenic and non-transgenic drying；Fig.6 c,d:Germination rate statistics of transgenic and wild-type seeds(P＜0.01).

2.8 過表達SlMYB75 株系種子萌發(fā)率降低

為了檢測過表達株系種子萌發(fā)能力，取WT、OE1 與OE2 三個株系的種子，分別用75%酒精和4%次氯酸鈉徹底消毒后，均勻播種于MS 固體培養(yǎng)基表面，放置于恒溫培養(yǎng)箱（28 ℃）進行暗培養(yǎng)，每天觀察拍照并統(tǒng)計種子萌發(fā)情況，統(tǒng)計結(jié)果如圖6c,d，圖6(c)為0～4 d 種子萌發(fā)情況，圖6(d)為萌發(fā)率量化統(tǒng)計。結(jié)果顯示：過表達株系種子萌發(fā)率顯著低于WT，第6 d 時，WT 種子基本完全萌發(fā)，但轉(zhuǎn)基因兩個株系種子萌發(fā)率不超過70%，因此，過表達SlMYB75使種子萌發(fā)率顯著下降。

2.9 過表達SlMYB75 株系幼苗下胚軸紫色消失

轉(zhuǎn)基因與WT 幼苗下胚軸顏色有明顯差異，WT 子葉下胚軸呈現(xiàn)紫色，而過表達轉(zhuǎn)基因株系下胚軸沒有紫色物質(zhì)積累，紫色物質(zhì)應是花青素，說明過表達SlMYB75抑制了花青素的合成或積累（圖7）。

圖7 轉(zhuǎn)基因與WT 株系子葉下胚軸對比Fig.7 Comparison of cotyledon hypocotyls between transgenic and WT strains

3 討論

MYB 作為植物轉(zhuǎn)錄因子中最大家族之一，主要參與調(diào)控植物激素的應答[18]、植物的非生物脅迫響應[19]、調(diào)控植物的形態(tài)建成[20]、調(diào)控植物次生代謝反應[21,22]等過程。本文通過組織表達特異性分析發(fā)現(xiàn)，SlMYB75基因在WT 番茄的根、葉和果實中表達量較高，在根和果實中最高；檢測過表達株系各組織中SlMYB75的表達量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系植株的根、葉和果實表達量升高較顯著，其中果實中表達量最高。另外，結(jié)合表達量(圖3)與種子萌發(fā)率(圖6c,d)發(fā)現(xiàn)，基因表達量越高種子萌發(fā)率越低。這說明SlMYB75基因可能在番茄種子萌發(fā)以及幼苗和果實的生長發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用。

類黃酮物質(zhì)的合成是由一系列轉(zhuǎn)錄因子包括MYB、bHLH和WD重復蛋白組成的三重復合物共同調(diào)節(jié)的[23]。目前，已有擬南芥AtMYB75/PAP1的研究報道，擬南芥中PAP1能夠促進愈傷組織中花青苷的合成。在擬南芥中通過RNAi的方法沉默PAP1基因?qū)е掠酌缰谢ㄇ嘬盏姆e累減少，另外，沉默PAP1基因的同源基因PAP2，MYB113和MYB114也會降低花青素的合成[24]。在啤酒花中異源表達AtPAP1/MYB75會顯著增加啤酒花幼葉和花中花青素的積累[25]。研究表明，在番茄(AC)中過表達擬南芥At/PAP1/MYB75同源基因SlMYB75，會導致番茄花和果實等器官中花青素的積累，果實顏色由紅色變?yōu)樽仙玔26]。孟夏等在中蔬六號中過表達SlMYB75使果實顏色由紅色變?yōu)辄S色，且花雄蕊中花青素積累增多。在本文中，在AC過表達SlMYB75使果實顏色由紅色變?yōu)辄S色，且幼苗子葉下胚軸中花青素積累減少(圖7)，該表型與之前研究不同。因此，SlMYB75基因在番茄中的功能有待進一步研究。

番茄果實內(nèi)可溶性葡萄糖和果糖的合成是在果實的發(fā)育和成熟過程中進行的，蔗糖濃度在開花后會不斷下降，在果實成熟期由于轉(zhuǎn)化酶的作用使其持續(xù)保持較低水平[28,29,30]。我們利用糖度計檢測成熟期轉(zhuǎn)基因與WT 果實含糖量，結(jié)果顯示（圖4b），WT 番茄含糖量在4.53 g/100 g 鮮重，過表達SlMYB75轉(zhuǎn)基因株系果實可溶性糖含量在5.31 g/100 g 鮮重，兩者之間存在顯著性差異。這說明過表達SlMYB75能夠提高成熟番茄果實可溶性糖含量。通過種子萌發(fā)實驗發(fā)現(xiàn)過表達SlMYB75株系種皮顏色變深（圖6a），幼苗期子葉下胚軸與WT 相比紫色物質(zhì)積累消失（圖7），且種子萌發(fā)率降低（圖6c,d）。這說明SlMYB75能夠影響番茄種子和幼苗的發(fā)育。但是SlMYB75基因影響番茄果實含糖量以及對種子和幼苗發(fā)育的機理尚不清楚需進一步研究。

4 結(jié)論

番茄SlMYB75編碼275 個氨基酸，該蛋白定位在細胞核中。過表達番茄SlMYB75能夠改變成熟番茄果實顏色和大小，果實含糖量顯著升高。種皮顏色加深，種子萌發(fā)率下降，且幼苗下胚軸顏色消失。這說明番茄SlMYB75基因能夠在番茄種子、幼苗和果實中發(fā)揮作用。