黃坤，郭嘉

（1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430075；2.武漢工程大學(xué)綠色化工過程教育部重點實驗室，湖北武漢430205）

苯并（α）芘（benzo（α）pyrene，BaP）是一種含有5 個環(huán)的稠環(huán)芳烴化合物，由有機化合物在高溫條件下發(fā)生聚合反應(yīng)而產(chǎn)生，具有強烈的致癌、致畸、致突變作用[1-2]，因其污染引發(fā)的食源性疾病較為常見和廣泛[3]。工業(yè)三廢排放產(chǎn)生的苯并（α）芘通過空氣、水、土壤等進入農(nóng)作物體內(nèi)進行富集[4]，糧食烘干和晾曬過程也因與含有苯并（α）芘的煙道氣、瀝青路面接觸而受到污染[5]，作為日常生活的主要糧食消費品谷物及其制品，也因此類生產(chǎn)過程和環(huán)境污染等原因面臨著苯并（α）芘的污染，因此在分析測試過程中有效評定苯并（α）芘測量結(jié)果的質(zhì)量顯得尤為重要。我國GB 2715-2016《食品安全國家標準糧食》中明確規(guī)定谷物及其制品中苯并（α）芘的含量不能超過5.0 μg/kg。目前關(guān)于各類食品檢測方法的不確定度評定不少[6-8]，但谷物及其制品中苯并（α）芘采用分子印跡柱凈化、熒光檢測的結(jié)果不確定度評定基本空缺。為了評估方法的不確定度，本文參考GB 5009.27-2016《食品安全國家標準食品中苯并（α）芘的測定》，以小麥粉為例，對谷物及其制品中苯并（α）芘的測定不確定度進行分析評定，找出影響結(jié)果的相關(guān)分量，在實際操作中可據(jù)此對相關(guān)環(huán)節(jié)進行重點控制，從而提高提高檢測結(jié)果的可靠性和準確性，同時為其他產(chǎn)品中苯并（α）芘測定結(jié)果的不確定度評定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

谷物及其制品（包括大米、小麥粉、玉米渣等）：產(chǎn)自湖北云夢；乙腈、正己烷、二氯甲烷（色譜純）：美國Thermo Fisher Scientific 公司；苯并（α）芘標準品（純度為98.8%）：德國Dr.Ehrenstorfer 公司。

1.1.2 儀器

Waters e2695 高效液相色譜儀（Waters e2695 Sep arations Module，2475 FLR Detector）：美國Waters 公司；Phenomenex Luna C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）：美國菲羅門公司；XS204 型精密天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；Talboys 數(shù)顯型渦旋混合器：美國Troemner 公司；分子印跡固相萃取柱（500 mg，6 mL）：天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的處理

準確稱取已粉碎混勻的樣品1 g 左右（精確至0.000 1 g），置于15 mL 離心管中，加入10 mL 正己烷，渦旋混合0.5 min 使試樣完全分散，超聲提取10 min。高速離心后將上清液加入已活化好的分子印跡固相萃取柱，待液面降至柱床時，用6 mL 正己烷淋洗，棄去流出液。用6 mL 二氯甲烷分兩次洗脫并收集凈化液至離心管中，于40 ℃下氮吹至干，準確移取1 mL 乙腈渦旋復(fù)溶0.5 min，過0.22 μm 微孔濾膜，續(xù)濾液供液相色譜分析。

1.2.2 色譜條件

Phenomenex Luna C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流動相：A 為乙腈，B 為水，流速1.0 mL/min；等度洗脫：洗脫程序85%A，洗脫20 min；檢測器：熒光檢測器，激發(fā)波長365 nm，發(fā)射波長410 nm；進樣量20 μL。

1.2.3 標準溶液的配制

準確稱取14.6 mg 苯并（α）芘標準品（純度為98.8%），用乙腈超聲溶解并定容至100 mL，即得濃度為144 μg/mL 的苯并（α）芘標準儲備溶液。用1 mL 單標線吸量管（A 級）吸取標準儲備溶液1 mL 于100 mL單標線容量瓶（A 級）中，用乙腈定容至刻度，混勻，即得濃度為1.44 μg/mL 的標準中間儲備溶液；再用5 mL分度吸量管吸取標準中間儲備液2.5 mL 于100 mL 單標線容量瓶（A 級）中，用乙腈定容至刻度，混勻，即得濃度為36.0 ng/mL 的標準使用溶液。

用1 mL 單標線吸量管（A 級）吸取標準使用溶液（36.0 ng/mL）1 mL 于10 mL 單標線容量瓶（A 級）中，用乙腈定容至刻度，搖勻，即得3.6 ng/mL 的標準工作溶液；用2 mL 單標線吸量管（A 級）吸取標準使用溶液2 mL 于10 mL 單標線容量瓶（A 級）中，用乙腈定容至刻度，搖勻，即得7.2 ng/mL 的標準工作溶液；用5 mL分度吸量管（A 級）分別吸取標準使用溶液3、4、5 mL于10 mL 單標線容量瓶（A 級）中，用乙腈定容至刻度，搖勻，分別得到10.8、14.4、18.0 ng/mL 的標準工作溶液；用10 mL 分度吸量管（A 級）吸取標準使用溶液8 mL 于10 mL 單標線容量瓶（A 級）中，用乙腈定容至刻度，搖勻，即得28.8 ng/mL 的標準工作溶液；直接將標準使用溶液作為36.0 ng/mL 的標準工作溶液。分別取以上7 種不同濃度的系列標準工作溶液各進樣2 次進行液相色譜分析，以系列標準溶液的濃度C 為橫坐標、色譜峰面積Y 為縱坐標，采用最小二乘法進行擬合得到標準工作曲線和線性回歸方程Y=A1C+A2（A1為斜率，A2為截距）。

1.2.4 重復(fù)測定與加標回收試驗

取同一陽性樣品，按1.2.1 下項方法、1.2.2 項下條件對苯并（α）芘的含量進行6 次重復(fù)測定，取其平均值作為最終結(jié)果；取同一陰性樣品，按3.6 μg/kg 的水平進行加標回收試驗，測定9 次，計算平均回收率。

1.3 數(shù)學(xué)模型的建立

谷物及其制品中苯并（α）芘的含量計算公式如下：

式中：X 為谷物及其制品中苯并（α）芘的含量（重復(fù)測定6 次，取平均值作為最終結(jié)果），μg/kg；C 為從標準工作曲線計算得到的樣品溶液中苯并（α）芘的濃度，ng/mL；V 為樣品復(fù)溶的定容體積，mL；m 為樣品的稱樣質(zhì)量為回收率校正因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

從1.3 項下計算公式結(jié)合實際測定過程可知，苯并（α）芘測定結(jié)果不確定度urel（X）的主要來源包括：（1）樣品溶液濃度引入的不確定度urel（C）；（2）樣品最終定容引入的不確定度urel（V）；（3）樣品稱量引入的不確定度urel（m）；（4）測量重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度urel（x）；（5）測量回收率產(chǎn)生的相對標準不確定度urel（R）。

2.2 不確定度的評定

2.2.1 樣品溶液濃度引入的相對標準不確定度urel（C）

樣品溶液濃度的不確定度來源于標準溶液配制產(chǎn)生的不確定度和標準工作曲線擬合產(chǎn)生的不確定度兩部分。標準溶液配制包括儲備液的配制、儲備液的稀釋和標準工作曲線制備3 個過程。

2.2.1.1 標準儲備溶液的配制引入的相對標準不確定度urel（C1）

由1.2.3 項下的配制過程可知不確定度來源主要有以下3 個方面：

（a）標準品純度引入的相對標準不確定度urel（C1a）根據(jù)標準品證書可知，苯并（α）芘標準品的純度誤差為±0.5%，按照均勻分布，則由純度引入的不確定度為：

（b）標準品稱量引入的相對標準不確定度urel（C1b）由2.2.3 項下處理可知由稱量引入的不確定度為：

（c）標準儲備溶液定容引入的相對標準不確定度urel（C1c）按照JJG 196-2006《常用玻璃量器》規(guī)定，20 ℃時100 mLA 級單標容量瓶容量允差為±0.10 mL，按矩形分布計算，其標準不確定度為參照2.2.2 項下處理，定容過程中100 mL 容量瓶由于環(huán)境溫度變化產(chǎn)生的標準不確定度為0.158 20 mL。則標準儲備溶液定容引入的相對標準不確定度為：

綜上所述，標準儲備溶液的配制引入的相對標準不確定度為：

2.2.1.2 標準儲備溶液的稀釋引入的相對標準不確定度urel（C2）

根據(jù)1.2.3 項下的稀釋過程，按均勻分布處理，相關(guān)器具及溫度波動引入的不確定度見表1。

表1 標準儲備溶液稀釋過程引入的不確定度Table 1 Uncertainty resulting from dilution of standard stock solution

因此，由標準儲備溶液稀釋過程引入的相對標準不確定度為：

2.2.1.3 標準工作曲線制備過程引入的相對標準不確定度urel（C3）

由1.2.3 項下的制備過程可知由吸量管、容量瓶及溫度波動引入的不確定度見表2。

因此，由標準工作曲線配制過程引入的相對標準不確定度為：

表2 標準工作曲線制備過程引入的不確定度Table 2 Uncertainty resulting from preparation of standard curve

2.2.1.4 標準工作曲線擬合引入的相對標準不確定度urel（C4）

根據(jù)1.2.3 項下的方法處理，測定數(shù)據(jù)及擬合結(jié)果如表3 所示。

表3 標準工作曲線結(jié)果Table 3 Results of standard curve

取一陽性樣品重復(fù)測定6 次，將其峰面積代入線性回歸方程計算測定濃度，然后根據(jù)1.3 項下的公式計算含量，其測定結(jié)果見表3（測定液平均濃度C0為3.750 ng/mL）。則由標準工作曲線擬合所引入的標準不確定度為：

式中：SR為標準溶液峰面積殘差的標準差，計算公式如下為標準工作曲線的斜率73 493；p 為對C0的測定次數(shù)，p=6；n 為標準工作溶液測試次數(shù)，本試驗中7 個濃度各測定2 次為標準系列溶液的平均濃度，822。因此由標準工作曲線擬合所引入的相對標準不確定度為

綜上所述，由樣品溶液濃度引入的相對標準不確定度為：

2.2.2 樣品最終定容體積引入的相對標準不確定度urel（V）

樣品最終定容采用1 mL 移液器，其引入的不確定度來源于其校準和環(huán)境溫度變化兩部分。按照校準證書給出的擴展不確定度U=0.04 μL（k=2），可知由校準引入的標準不確定度試驗過程中雖有中央空調(diào)控溫，但由于各種原因環(huán)境溫度很難保證在20 ℃一成不變，設(shè)定室溫在（20±2）℃之間波動。已知乙腈的體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3/℃，按照矩形分布考慮則移液過程中由于環(huán)境溫度變化產(chǎn)生的標準不確定度0.001 58 mL。

綜上所述樣品最終定容1 mL 引入的相對標準不確定度為：

2.2.3 樣品稱樣質(zhì)量引入的相對標準不確定度urel（m）

樣品稱量的不確定度主要來源于稱量的重復(fù)性和天平校準。天平校準的不確定度與其靈敏度和線性相關(guān)，因稱量在較窄的范圍內(nèi)進行，靈敏度可以忽略不計。

1）稱量重復(fù)性引入的不確定度u1（m）由天平的校準證書得到擴展不確定度U=0.32 mg（k=2），轉(zhuǎn)化為標準不確定度為

2）天平校準引入的不確定度由天平的說明書得到其線性誤差為±0.000 5 g，服從矩形分布，轉(zhuǎn)化為標準不確定度為

試驗中樣品的平均稱樣量為1.002 7 g，因此由樣品稱量引入的相對標準不確定度為：

2.2.4 測量重復(fù)性產(chǎn)生的相對標準不確定度

按照1.2.4 項下的方法測定，重復(fù)性的試驗結(jié)果見表4。

表4 重復(fù)性試驗結(jié)果Table 4 Results of repeatability test

根據(jù)JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》規(guī)定，試驗結(jié)果為正態(tài)分布，采用極差法可知單次測定的標準差則標準不確定度因此由測量重復(fù)性引入的相對標準不確定度為：

2.2.5 測量回收率產(chǎn)生的相對標準不確定度

按照1.2.4 項下的方法測定，回收率（R）的結(jié)果分別為92.14 %、90.51 %、96.03 %、93.85 %、94.71 %、93.68%、91.69%、93.55%、96.46% （平均回收率=93.62%），應(yīng)用貝塞爾公式可知單次測定回收率的標準偏差則標準不確定度因此由測量重復(fù)性引入的相對標準不確定度為：

為了確定回收率是否計入苯并（α）芘含量的計算中，對平均回收率與1.0 進行顯著性檢驗說明與1.0 具有高度顯著性差異，因此在計算公式中必須采用回收率校正因子對結(jié)果進行修正。

2.3 合成相對標準不確定度

樣品溶液的濃度、定容體積、樣品稱樣量以及測量重復(fù)性等不確定度分量相互獨立，各相對標準不確定度分量的數(shù)值及其貢獻見圖1，將上述不確定度進行合成，得到合成相對標準不確定度，如下所示：

圖1 相對標準不確定度分量及其貢獻Fig.1 Relative standard uncertainty components and their contributions

2.4 擴展不確定度

依據(jù)JJF 1135-2005《化學(xué)分析測量不確定度評定》，取包含因子k=2（置信概率p≈95%）衡量，則擴展不確定度為：

3 測量結(jié)果及其不確定度報告

用高效液相色譜-熒光法測定谷物及其制品中的苯并（α）芘，測定結(jié)果報告如下：

由測量結(jié)果可知依據(jù)GB 5009.27-2016《食品安全國家標準食品中苯并（α）芘的測定》采用正己烷提取、分子印跡固相萃取凈化、高效液相色譜-熒光法測定谷物及其制品中苯并（α）芘的不確定度較小，測量結(jié)果具有較高的可信度和準確度，能夠滿足日常檢測的質(zhì)量控制要求。

4 結(jié)論

試驗過程中，稱量、定容、稀釋、儀器測定等操作過程都會引入不確定度，從本文不確定度的分析和計算過程可以發(fā)現(xiàn)，影響谷物及其制品中苯并（α）芘測定結(jié)果不確定度的因素主要為測量重復(fù)性、樣品溶液濃度和測量回收率，其次為樣品最終定容體積和樣品稱樣質(zhì)量。其中樣品溶液濃度因素中貢獻較大的分量是標準儲備溶液的配制、標準工作曲線的擬合和制備。因此在實際檢測過程中要嚴格控制溶液配制和測量操作，尤其要注意標準溶液相關(guān)操作過程的規(guī)范性和一致性，以及平行樣品的測定問題，定期對所涉儀器進行檢定和提高實驗人員的操作能力，以此減小測量不確定度，從而保證檢測結(jié)果的準確度和可信度。