李 麗，張 煥，曾祥聰，丁 嬌，馬 峻，祝 宏*

1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430205；

2.武漢市金銀潭醫(yī)院，湖北 武漢 430023

雜合技術(shù)越來越受到人們的關(guān)注，其原理是將不同生物活性物質(zhì)的藥效團部分組合以產(chǎn)生與相應(yīng)藥物相比具有改善的親和力和功效的新的化合物。且從已經(jīng)建立的藥物中設(shè)計和開發(fā)藥物分子，以期望發(fā)現(xiàn)更加有效的新藥物［1-3］。例如，羅氏公司利用喹諾酮類藥物與β-內(nèi)酰胺類藥物結(jié)合的雜合藥物ro-23-9424。體外實驗表明，ro-23-9424的抗菌譜較廣，對喹諾酮類和頭孢類藥物的耐藥菌均有效，特別是對銅綠假單胞菌有較強的作用［4］。

吡嗪酰胺、氧氟沙星是WHO推薦的抗結(jié)核藥物，具有殺菌力強、選擇性高、副作用少的優(yōu)點［5-6］。水楊酸類藥物是應(yīng)用最早和最普遍解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥物［7］。磺胺醋酰是一種廣譜抑菌劑［8］。在雜合藥物的制備過程中，通過對原有抗結(jié)核藥物進行結(jié)構(gòu)修飾來改變原來藥物對受體的作用方式，增加藥物的靶向性，從而改變藥物作用于受體的方式，以利于擴大該類藥物的整體抗菌作用范圍，減少藥物耐藥性，降低藥物毒副作用［9-10］，獲得比原有抗結(jié)合藥物更好的效果等［11-13］。根據(jù)以上雜合設(shè)計策略，本研究合成了乙酰水楊酸-吡嗪酰胺和氧氟沙星-磺胺醋酰兩種雜合藥物，具體合成路線如圖1和圖2所示。

圖1 乙酰水楊酸-吡嗪酰胺的合成路線Fig.1 Synthesis route of acetylsalicylic acid-pyrazinamide

圖2 氧氟沙星-磺胺醋酰的合成路線Fig.2 Synthesis route of ofloxacin-sulfacetamide

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

吡嗪酰胺（天津市博迪化工有限公司）；氧氟沙星（宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司）；乙酰水楊酸（上海麥克林生化科技有限公司），其余反應(yīng)所用的試劑均為分析純，并按要求進行純化處理。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；RY-1熔點儀；AB204-N型電子天平；ZF7三用紫外分析儀；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52C；Mercury Plus 400型核磁共振儀；Perkin Elmer型傅里葉紅外光譜儀，KBr壓片；UltiMate3000戴安高效液相色譜儀；Agilent 6460 LC/MS液質(zhì)聯(lián)用儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 目標(biāo)化合物乙酰水楊酸-吡嗪酰胺的合成 稱取1 g（0.005 mol）乙酰水楊酸于單口燒瓶中，加入10 mL二氯甲烷，再加入 5 mL（0.025 mol）二氯亞砜，接著滴加2滴N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF），將上述反應(yīng)瓶置于恒溫加熱磁力攪拌器上，室溫條件下攪拌，發(fā)現(xiàn)有氣體產(chǎn)生后再緩慢升溫至50℃回流，待不再有氣體產(chǎn)生停止，濃縮得到乙酰水楊酸酰氯備用。稱取0.5 g（0.004 mol）吡嗪酰胺溶于20 mL氯仿中，再加入1 mL三乙胺，39℃條件下磁力攪拌。將濃縮得到的乙酰水楊酸酰氯用5 mL二氯甲烷稀釋，滴入反應(yīng)瓶中，升溫到45℃下回流，用硅膠層析板［silica gel chromatography，TLC；GF254硅膠板，V（二氯甲烷）∶V（甲醇）=15∶1］監(jiān)控反應(yīng)，直至原料吡嗪酰胺消失，減壓濃縮得到粗產(chǎn)品。粗產(chǎn)品通過柱色譜法分離［柱色譜中硅膠粒徑為70～100 μm；洗脫劑為二氯甲烷-甲醇（體積比20∶1）］，得到乙酰水楊酸-吡嗪酰胺純品；純度為98%。

乙酰水楊酸-吡嗪酰胺：淺棕色固體；收率76%；mp：92～95 ℃；IR（ KBr，cm-1）：3 331.55，1 733.96，1 649.15，1 618.32，1 578.68，1 476.52，1 400.55，1 294.12，1 288.35，1 199.95；1H NMR（400 MHz，CDCl3），δ：11.21（s，1H），9.56（s，1H），8.90（d，J=12Hz，1H），8.70（d，J=4 Hz，1H），8.13（d，1H），7.83（d，J=8 Hz，1H），7.43～7.41（m，1H），7.20～7.22（m，1H），2.33（s，3H）；13C NMR（400MHz，CDCl3） δ：169.43，168.63，166.63，151.21，147.57，145.55，144.43，142.55，132.43，129.97，126.50，126.22，122.51，21.10.HRMS-ESI（m/z）calculated for［2M+Na+］：593.14；found：593.20。

1.2.2 目標(biāo)化合物氧氟沙星-磺胺醋酰的合成 稱取 1 g（0.003 mol）氧氟沙星和 0.6 g（0.003 mol）磺胺醋酰于單口燒瓶中，加入20 mL DMF中，接著加入0.57 g縮合劑二環(huán)己基碳二亞胺，將上述反應(yīng)瓶置于恒溫加熱磁力攪拌器上，80℃條件下磁力攪拌。TLC［GF254硅膠板，V（二氯甲烷）∶V（甲醇）=10∶1］監(jiān)控反應(yīng)，直至原料氧氟沙星消失。冷卻至室溫，析晶，過濾，濾餅在40～50℃下鼓風(fēng)干燥得到粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物通過柱色譜法分離［柱色譜中硅膠粒徑為70～100 μm；洗脫劑為二氯甲烷-甲醇（體積比20∶1）］，得到乙酰水楊酸-吡嗪酰胺純品；純度為96%。

氧氟沙星-磺胺醋酰：黃色固體；收率65%；mp： 120～123 ℃ ； IR（KBr，cm-1）：3 841.23，3 695.02，3 252.43，2 926.45，2 793.44，2 325.09，1 972.25，1 649.80，1 540.90，1 470.62，1 447.98，1 148；1H NMR （400 MHz，CDCl3），δ：7.6 6（s，1H），7.6（s，1H），7.5（d，J=12.0，1H），7.24（d，J=3.20，1H），6.96（d，J=4.0，1H），4.19（s，2H），3.35（s，H），2.66（s，3H），2.56（s，2H），2.56（s，3H），2.46（d，J=4.0 HZ，2H），2.36（s，3H）2.56（s，1H），1.46（s，3H）；13C NMR（400MHz，CDCl3）δ：173.52，164.77，156.68，154.13，153.86，139.16，139.11，139.07，131.51，124.43，121.66，121.64，121.59，119.93，104.43，104.19， 118.93，77.05，55.70，55.23，54.14，50.47，49.69，46.31，24.46，18.25；HRMS-ESI（m/z） calculated for［M+1/H2O］：569.18，found：569.30。

2 生物活性測試

為了檢測雜合藥物乙酰水楊酸-吡嗪酰胺和氧氟沙星-磺胺醋酰的生物活性，選擇HR37V標(biāo)準株用于藥敏試驗，通過氧化還原指示劑顯色法檢測結(jié)核分支桿菌的耐藥性，結(jié)核分支桿菌在生長過程中會產(chǎn)生NAD（P）H，氧化還原指示劑刃天青，可通過指示劑顏色變化判斷藥物的敏感性［14］。紅色表示耐藥（R），藍色表示敏感（S）。

2.1 測試方法

取目標(biāo)雜合藥物乙酰水楊酸-吡嗪酰胺和氧氟沙星-磺胺醋酰，用適量的DMF溶解后，配成1 mg·mL-1的含藥溶液，進行滅菌處理，再將其用無菌膜密封，放置待用。

1）向無菌96孔板（1～12孔）中每孔加7H9培養(yǎng)基100 μL。第1孔加入一定濃度的含藥溶液，對倍連續(xù)稀釋至第12孔。各孔藥物最終質(zhì)量濃度：乙酰水楊酸、吡嗪酰胺和磺胺醋酰質(zhì)量濃度為0.48～500 μg·mL-1，乙酰水楊酸-吡嗪酰胺雜合藥物質(zhì)量濃度為 0.48～500 μg·mL-1，氧氟沙星-磺胺醋酰雜合藥物質(zhì)量濃度為 0.48～500 μg·mL-1。

2）加入2滴質(zhì)量分數(shù)為0.5%的Tween-80生理鹽水及臨床分離的2～3周菌齡的培養(yǎng)物到玻璃磨菌器底部，研磨至乳酪樣，用生理鹽水稀釋成1號麥氏比濁管的濁度（1 mg·mL-1），用7H9培養(yǎng)基稀釋后1～8孔每孔接種100 μL?？瞻卓鬃鳛榕囵B(yǎng)基對照。

3）將板用無菌膜密封，放置在濕盒內(nèi)，37℃培養(yǎng)5 d，第6 d加入過濾除菌的刃天青顯色液（0.1 g·L-1）30 μL至第12孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，如空白孔（不含藥物）變成粉紅色，則加同等量的刃天青顯色液至其他各孔，24 h后記錄顏色變化。顏色從藍色變?yōu)榉凵搭A(yù)示細菌生長。

2.2 測試結(jié)果

以不含抗結(jié)核藥物的培養(yǎng)基作為對照組，觀察培養(yǎng)基的顏色隨時間的變化，培養(yǎng)基的顏色反映了HR37V標(biāo)準菌株的生長情況，進一步說明了該藥物對結(jié)核桿菌的抑菌活性。R為對結(jié)核分枝桿菌的耐藥，即無活性；S則為對結(jié)核分枝桿菌的敏感性，即有活性（該質(zhì)量濃度單位為μg/mL），培養(yǎng)基能顯示藍色的最低濃度為藥物的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值［15］，結(jié)果見表1。

表1 目標(biāo)化合物的抑菌活性Tab.1 Antibacterial activities of target compounds

3 結(jié)果與討論

3.1 化合物的合成

乙酰水楊酸-吡嗪酰胺雜合藥物的合成，實質(zhì)就是酰化反應(yīng)。該合成過程中，先以乙酰水楊酸作為原料合成乙酰水楊酰氯，在制備酰氯時，加少量DMF作為催化劑，DMF先與SOCl2形成類Vilsmeier的中間體，該中間體被羧酸進攻而形成酰氯，同時放出DMF，循環(huán)催化反應(yīng)，縮短反應(yīng)時間［16］；在接下來合成酰胺時，先加入縛酸劑三乙胺，再緩慢滴加乙酰水楊酰氯生成酰胺。此路線的設(shè)計操作簡單，成本低，原料裝置易得，條件溫和，后處理簡單且污染小，可行性高。該雜合藥物可以彌補吡嗪酰胺只能在酸性條件下才有活性的弊端［17］，并起到協(xié)同的抗結(jié)核桿菌的作用。

在設(shè)計合成氧氟沙星-磺胺醋酰雜合藥物的過程中，我們以磺胺醋酰和氧氟沙星為原料，反應(yīng)得到席夫堿，讓雙鍵電子分散的取代基團更穩(wěn)定。更重要的是乙酰水楊酸-吡嗪酰胺可以通過一步反應(yīng)得到，反應(yīng)條件溫和，操作簡單易實施，且利用廉價易得的試劑獲得目標(biāo)產(chǎn)物。

3.2 譜圖分析

目標(biāo)化合物乙酰水楊酸-吡嗪酰胺的紅外光譜（infrared spectroscopy，IR）圖譜顯示（圖 3）：3331.55cm-1為N-H伸縮振動吸收峰；而1649.15 cm-1為C=O的伸縮振動吸收峰；1 604.19 cm-1為N-H振動吸收峰；1 400.55 cm-1為C-N的伸縮振動吸收峰，以上都是酰胺鍵基團的特征吸收峰，據(jù)此可初步判斷形成了酰胺式結(jié)構(gòu)；化合物乙酰水楊酸-吡嗪酰胺的1H NMR（CDCl3作溶劑）圖譜化學(xué)位移δ=11.21處為酰胺鍵中NH氫吸收峰。

圖3 乙酰水楊酸-吡嗪酰胺：（a）紅外圖譜，（b）核磁共振氫譜Fig.3 Acetylsalicylic acid-pyrazinamide：（a）IR spectrum ，（b）1H NMR spectrum

目標(biāo)化合物氧氟沙星-磺胺醋酰的IR圖譜（圖4）：1649.80 cm-1為席夫堿中C=N鍵的伸縮振動吸收峰；1715 cm-1為C=O伸縮振動吸收峰，1545.35 cm-1為C=C的伸縮吸收峰；843.79 cm-1處的吸收歸屬于苯環(huán)對二取代的特征吸收；化合物氧氟沙星-磺胺醋酰的1H NMR（CDCl3作溶劑）圖譜化學(xué)位移δ=7.24為氧氟沙星-磺胺醋酰上與N相連的亞甲基上的氫吸收峰。

圖4 氧氟沙星-磺胺醋酰：（a）紅外光譜，（b）核磁共振氫譜Fig.4 Ofloxacin-sulfacetamide：（a）IR spectrum，（b）1H NMR spectrum

3.3 目標(biāo)化合物生物活性測試結(jié)果

采用氧化還原指示劑顯色法來檢測結(jié)核分枝桿菌的耐藥性，通過指示劑從氧化態(tài)到還原態(tài)的顏色來判斷藥物的敏感性。試驗結(jié)果表明：目標(biāo)雜合藥物乙酰水楊酸-吡嗪酰胺雜合藥物和氧氟沙沙星-磺胺醋酰雜合藥物均顯示出較好的的殺菌活性，其中雜合藥物乙酰水楊酸-吡嗪酰胺具有較乙酰水楊酸、吡嗪酰胺更強的殺菌效果，雜合藥物氧氟沙星-磺胺醋酰具有較磺胺醋酰更強的殺菌效果。

4 結(jié) 語

本研究結(jié)合抗結(jié)合藥物的研究現(xiàn)狀，設(shè)計、合成了兩個雜合抗結(jié)合藥物。根據(jù)“雞尾酒療法”將兩個不同靶點的藥物通過化學(xué)合成的方法連接起來得到2個未見文獻報道的新化合物。該反應(yīng)原料易得，反應(yīng)收率高，目標(biāo)化合物經(jīng)1H NMR、13C NMR、IR及MS等表征確認。藥敏試驗采用稀釋法，結(jié)果表明這2個目標(biāo)雜合物對結(jié)核分枝桿菌的抑菌效果很好。利用雜合技術(shù)合成新的抗結(jié)核藥物進行抗菌活性篩選，旨在進一步深入開展以耐藥機制為基礎(chǔ)的雜合抗結(jié)核藥物的活性研究提供重要的參考信息。