(臨沂市中心醫(yī)院，山東 沂水 276400)

研究證實(shí)，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是多個(gè)信號通路和多基因共同參與的結(jié)果[1]。其中，細(xì)胞組蛋白乙酰化受到組蛋白去乙?；?HDACs)和組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶的共同調(diào)控，當(dāng)HDACs呈現(xiàn)為病理活性和異常表達(dá)后會引發(fā)機(jī)體免疫紊亂、肌營養(yǎng)不良以及癌癥的發(fā)生。有研究表明[2]，HDAC2的目標(biāo)蛋白為抑癌基因P53，其過度表達(dá)與惡性腫瘤發(fā)生相關(guān)，其表達(dá)的高低可作為臨床上獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，也可作為組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDACi)療效的標(biāo)志。本研究分析HDAC2、乙?；疨53k320在胃癌組織和癌旁組織細(xì)胞中的表達(dá)，探討其對療效的評價(jià)作用。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2018年1月—2019年1月本院收治的胃癌患者130例，其中男86例，女44例；年齡35～75歲，平均(55.5±2.6)歲；腫瘤直徑：>5 cm者29例，≤5 cm者101例；Lauren分型：彌漫型35例，腸型82例，混合型13例；分化程度：高分化67例，中分化34例，低分化29例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期68例，Ⅲ～Ⅳ期62例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有59例，無71例。所有患者或家屬均簽署了知情同意書。所有患者經(jīng)臨床治療后，完全緩解(CR)65例，部分緩解(PR)26例，穩(wěn)定(SD)19例，進(jìn)展(PD)20例。

1.2方法

1.2.1組織采集 取所有患者手術(shù)切除的癌組織和癌旁組織，其中50%組織在10%中性甲醛中固定，24 h后行常規(guī)石蠟包埋，制作組織切片，厚度為4 μm，用于后續(xù)免疫組化染色。另外50%組織作后續(xù)細(xì)胞分離。

1.2.2免疫組化 將所制備的癌組織和癌旁組織石蠟切片在二甲苯中重復(fù)脫蠟10 min，行梯度酒精水化，將蛋白酶修復(fù)液加入37℃的恒溫冰箱中行孵化處理30 min，去除抗原修復(fù)液，將所制備的切片轉(zhuǎn)移至內(nèi)含3% H2O2的濕盒中，密封(去過氧化物酶封閉液)，在37℃的恒溫冰箱中行孵化處理10 min，使用PBS清洗。清洗完成后將山羊血清加入，在室溫下封閉處理30 min，將封閉液吸除(濾紙)，加入一抗，放入至適合后加入二抗，在室溫下孵育處理1 h，運(yùn)用PBS清洗，行DAB顯色10 min，采用梯度乙醇進(jìn)行脫水，采用二甲苯?jīng)_洗片3次直到透明，采用中性樹脂封片處理，顯微鏡下觀察免疫組化染色情況。每份標(biāo)本在鏡頭下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，所有病理切片均由2位以上經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行診斷。根據(jù)染色程度和染色細(xì)胞百分比進(jìn)行評分：不著色0分，淡黃色1分，黃色2分，棕黃色3分；著色細(xì)胞數(shù)≤5% 0分，6%～25% 1分，26%～50% 2分，≥51% 3分。陰性(-)得分≤1分，弱陽性(+)得2～3分；中度陽性(++)得4～5分；強(qiáng)陽性(+++)得分≥6分。

1.2.3細(xì)胞分離 取備用的癌組織和癌旁組織，去除結(jié)締組織后洗凈剪碎，使用0.1%的胰酶、0.025%的Ⅰ型膠原酶在37℃環(huán)境下消化30 min，使用濾網(wǎng)濾渣，在4℃環(huán)境下500×g離心5 min，棄去上清液；在DMEM-E培養(yǎng)基(5 ml，內(nèi)含20%人血漿)中孵育5 min，細(xì)胞重懸后將20%的Percoll細(xì)胞分離液在4℃環(huán)境下500×g離心15 min，收集含有細(xì)胞的沉淀，經(jīng)DMEM-E反復(fù)洗滌2次，每次均在4℃環(huán)境下500×g離心5 min，將所獲得的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，使用10% FBS、牛腦抽提物(100 g/ml)、谷氨酰胺(2 mmol/L)、青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 mg/ml)的DMEM-E培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，棄去上清液，將未貼壁的細(xì)胞洗掉后繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)1周后挑選多個(gè)形成的集落，混合均勻，轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.2.4癌細(xì)胞中HDAC2 mRNA檢測 采用熒光定量RT-PCR檢測，取對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞、癌旁細(xì)胞按照制備試劑盒說明書提取胎盤組織中總RNA，之后對RNA純度、含量進(jìn)行檢測，使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得cDNA，之后使用Primer5.0軟件對引物序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，使用RT-PCR方法檢測胃癌細(xì)胞中HDAC2 mRNA表達(dá)量，采用2-△△Ct方法計(jì)算出需要檢測的表達(dá)量。HDAC2引物序列：上游：5’-TGACATTGTGCTTGCTGTCC-3’，下游：5’-CCCTCAAGTCTCCTGTTCCA-3’；內(nèi)參基因GAPDH引物序列：上游：5’-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3’，下游：5’-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3’。

1.2.5癌細(xì)胞中HDAC2及乙?；疨53k320蛋白表達(dá)的檢測 取對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞、癌旁細(xì)胞，將培養(yǎng)液去除，反復(fù)使用PBS沖洗2遍，0.25%胰蛋白酶消化處理后離心，再次使用PBS反復(fù)沖洗2遍，將細(xì)胞收集至1.5 mL的離心管中，將200μL預(yù)冷的RIPA細(xì)胞裂解液在冰上采用超聲儀對細(xì)胞進(jìn)行超聲裂解，2 s/次，共5次，在4℃環(huán)境下500×g離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，蛋白定量分裝采用Bradford方法，采用Western blot法檢測胃癌細(xì)胞、癌旁細(xì)胞中HDAC2蛋白及乙酰化P53k320蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1HDAC2及乙酰化P53k320中陽性細(xì)胞的表達(dá)胃癌組織HDAC2陽性表達(dá)率高于癌旁組織，乙酰化P53k320陽性率低于癌旁組織。見表1、封二圖1。

2.2HDAC2 mRNA HDAC2蛋白及乙?；疨53k320蛋白的表達(dá) 胃癌細(xì)胞中HDAC2 mRNA、HDAC2蛋白表達(dá)量均高于癌旁細(xì)胞，乙?；疨53k320蛋白表達(dá)量低于癌旁細(xì)胞。如表2、封二圖2。

表1 兩種組織HDAC2及乙?；疨53k320中陽性表達(dá)情況比較[n(%)]

表2 兩種細(xì)胞中HDAC2 mRNA、HDAC2蛋白及乙?；疨53k320蛋白表達(dá)情況

2.3HDAC2及乙酰化P53k320對療效的評價(jià)作用 CR、PR、SD、PD組患者癌組織中HDAC2蛋白表達(dá)量呈增高趨勢，乙?；疨53k320蛋白表達(dá)量呈降低趨勢；兩兩比較顯示，各組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=5.75～54.76，P<0.05)。見表3、封二圖3。

表3 HDAC2及乙酰化P53k320蛋白表達(dá)與療效的關(guān)系

3 討論

目前發(fā)現(xiàn)抑癌基因P53與人類腫瘤發(fā)生關(guān)系最為密切。臨床推測，胃癌的發(fā)生和進(jìn)展可能與野生型P53功能受到抑制有關(guān)[3]，這種抑制可能與表觀遺傳學(xué)組蛋白去乙?；赶嚓P(guān)[4]。組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶具有催化乙?；淖饔茫蛊滢D(zhuǎn)移至組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶；而HDACs作用與其相反，可逆轉(zhuǎn)賴氨酸殘基乙?；??？赡娴囊阴；瘯{(diào)控非組蛋白，包括P53、NF-κB、STATs等。因此，乙?；囊蕾囃放c其他轉(zhuǎn)錄后修飾具有一定的相關(guān)性，可維持機(jī)體動態(tài)平衡。正常P53需部分乙?；琀DAC2是通過去乙?；{(diào)控P53。

k320是位于P53DNA連接域/四聚化結(jié)構(gòu)域，P53信號通路與k320乙?；嚓P(guān)。Brandl等[5]研究顯示，結(jié)腸癌細(xì)胞中HDAC2和P53之間的作用可抑制P53k320乙?；?，進(jìn)而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。目前，隨著對HDAC2的研究深入，發(fā)現(xiàn)其在多數(shù)惡性腫瘤中均呈現(xiàn)高表達(dá)，包括卵巢癌、胰腺癌、腎癌、腎癌、肝癌等。Masoud等[6]研究發(fā)現(xiàn)HDAC抑制因子或者RNA抑制劑均會抑制腎癌細(xì)胞中HDAC2的高表達(dá)。在乳腺癌的研究中表明，抑制HDAC2表達(dá)會增強(qiáng)P53靶基因Bax的表達(dá)，細(xì)胞增殖加速[7-8]。有學(xué)者通過分析HDAC2與P53k320乙?；g的相關(guān)性[9-10]，認(rèn)為當(dāng)P53k320乙?；档秃髸黾覲53靶基因的表達(dá)，且HDAC2會逆轉(zhuǎn)P53k320乙?；龠M(jìn)細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞中HDAC2高表達(dá)，乙酰化P53k320低表達(dá)，表明在胃癌發(fā)生過程中，HDAC2表達(dá)升高可能抑制P53k320乙?；?。此外，本研究結(jié)果還顯示，患者治療效果越好者其HDAC2蛋白表達(dá)量越低，乙酰化P53k320蛋白表達(dá)量越高，這可能與胃癌患者治療后，HDAC2的高表達(dá)受抑制，P53k320乙?；黾樱罱K促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡相關(guān)。提示，HDAC2、乙酰化P53k320可作為評估胃癌患者治療效果的指標(biāo)。