高翔，崔亞寧

（陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，陜西西安 710065）

隨著社會各界對食品衛(wèi)生的高度關(guān)注，研究食品微生物檢驗技術(shù)已成為必然趨勢。通過微生物檢驗?zāi)軌驗槭称返陌踩蕴峁└鼮橛欣目茖W(xué)證據(jù)，同時還能對食品加工環(huán)境進行預(yù)測，并對食品是否被微生物污染及污染程度進行正確評價。一直以來，食品微生物檢測都秉承“預(yù)防為主，防治結(jié)合”的原則，在很大程度上避免了人畜共病、食物中毒等食品安全事故發(fā)生。同時，食品微生物檢驗還能對食品生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)生約束力、威懾力，促使企業(yè)能夠重視產(chǎn)品質(zhì)量，極大地保障了食品安全，具有重大意義。

1 食品微生物檢驗技術(shù)現(xiàn)狀

一直以來，食品微生物檢驗采用的是傳統(tǒng)的檢驗方法，如增菌培養(yǎng)、分離純化、血清鑒定等，這些方法準(zhǔn)確率較高，但是操作流程煩瑣、檢驗周期長，制約了檢測效率的提升。增菌培養(yǎng)、分離純化、生化鑒定等操作所需的培養(yǎng)時間一般在1 d以上；平板分離的挑菌落操作，則要求操作人員必須具備工作經(jīng)驗；完成一個對象菌的鑒定，通常需要進行多次生化實驗[1]。2003年以前，我國所發(fā)布的食品微生物檢驗標(biāo)準(zhǔn)幾乎涉及的都是上述傳統(tǒng)的檢驗技術(shù)。2008年發(fā)布的檢驗國家標(biāo)準(zhǔn)中引入了一些新的檢驗技術(shù)，而直至最近幾年，才引入PCR檢驗方法、基因芯片檢驗法等。

2 食品微生物檢驗技術(shù)的新進展

2.1 利用免疫技術(shù)檢測微生物含量

利用免疫技術(shù)對食品中微生物的含量進行檢測，具有高效、快捷等特點，當(dāng)免疫物質(zhì)與所針對的微生物或病毒接觸時，能夠迅速產(chǎn)生反應(yīng)，整個檢驗過程耗時較短，通常幾分鐘即可完成，最長也只需耗時幾小時，且免疫反應(yīng)具有較強的針對性，檢測結(jié)果的可信度也很高。當(dāng)前，在食品微生物檢驗中免疫技術(shù)檢測應(yīng)用較廣的是乳膠凝集反應(yīng)，即將乳膠中較大的空隙作為抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合的場所，以此來對食品中的微生物進行檢測[2]。乳膠凝集反應(yīng)多用于食品中金黃色葡萄球菌的檢驗；而酶聯(lián)免疫法則通過免疫反應(yīng)的不同順序來判斷食品中的微生物種類，多用于大腸桿菌0157、李斯特菌、沙門氏菌等危險微生物的檢測。

2.2 可視化基因芯片技術(shù)

基因芯片具有較高的靈敏度，近年來在致病微生物檢驗中應(yīng)用非常廣泛。以往常規(guī)的基因芯片雜交反應(yīng)結(jié)束后，無法直接進行結(jié)果分析，還需要借助熒光掃描顯微鏡，因此操作比較煩瑣。為有效解決檢驗結(jié)果分析的問題，可視化基因芯片技術(shù)隨之產(chǎn)生。Ostroff等[3]學(xué)者通過大量研究證實，在催化作用下，酶將在芯片表面沉淀下來，從而使得芯片的厚度發(fā)生改變，反射到芯片上光的波長隨之改變，實驗結(jié)果只需要根據(jù)基因芯片上的顏色變化進行分析即可?？梢暬蛐酒夹g(shù)耗時短、操作便捷、檢測效率較高，能夠一次性對多種潛在微生物進行檢出，但是該技術(shù)應(yīng)用成本較高，對操作要求較高，因此在食品微生物檢測領(lǐng)域還沒有大范圍推廣。

2.3 熒光標(biāo)記噬菌體技術(shù)

熒光標(biāo)記噬菌體技術(shù)的原理是選用相應(yīng)的染色劑對噬菌體核酸進行標(biāo)記，再用標(biāo)記后的噬菌體對相應(yīng)的宿主菌進行特異性侵染，當(dāng)噬菌體在宿主菌的表面吸附后，立刻在宿主細(xì)胞中注入標(biāo)記過的核酸，隨著所標(biāo)記核酸注入量的增加，宿主菌細(xì)胞中的熒光素隨之增多，通過熒光顯微鏡就能判定是否存在宿主菌，以此來完成病原菌的檢測[4]。Mosier-boss等[5]基于前人研究的基礎(chǔ)上，將熒光染料YOYO-1更換為SYBRgold核酸染料，憑借著SYBRgold的高靈敏度特點，在不破壞噬菌體結(jié)構(gòu)和性能的情況下，對沙門氏菌噬菌體P22進行標(biāo)記，成功檢出沙門氏菌LT2株，通過進行染料對比，結(jié)果顯示SYBRgold核酸染料的實驗室檢測效果最佳。PheaMH等[6]與FlajshansM等[7]分別在大腸桿菌、沙門氏菌和李斯特菌的檢測中，選用SYBRgreenⅠ和SYBRgreenⅡ染料，均成功檢測出微生物。該方法具有較強的特異性，且靈敏度高，可在食品微生物實際檢測中應(yīng)用。通常情況下，噬菌體與宿主呈現(xiàn)出一一對應(yīng)的關(guān)系，但是由于宿主范圍不廣，且兩者之間的作用機制并不明確，需要進一步深入研究，因此該技術(shù)還沒有被廣泛應(yīng)用。但是熒光標(biāo)記噬菌體技術(shù)的檢測周期較短，通常幾個小時即可完成，還能夠同時對多個細(xì)菌進行檢測，精準(zhǔn)區(qū)分出死活細(xì)菌，在檢測前不需要再進行細(xì)菌純化，預(yù)增菌后可以立刻進行檢測，因此在食品微生物檢測中具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.4 微滴數(shù)字PCR技術(shù)

微滴式數(shù)字PCR技術(shù)簡稱ddPCR技術(shù)，在擴增菌前，通過微滴化技術(shù)對一個相對比較大的反應(yīng)體系進行處理，同時借助油包水技術(shù)，將反應(yīng)體系分割成成千上萬個納升級微滴，每個微滴中不含或至少含有一個待檢測的核酸靶分子，且每個微滴都形成獨立的PCR反應(yīng)體系。通過泊松分布原理，根據(jù)陽性微滴的個數(shù)和比例，可以獲得靶分子的起始拷貝數(shù)，從而能夠?qū)ψ畛醴磻?yīng)體系中的核酸靶分子數(shù)量進行定量處理[8]。ddPCR技術(shù)在分割含有核酸分子的反應(yīng)體系時，需要在PCR擴增前進行，通過PCR擴增和熒光信號的積累，對陽性反應(yīng)的單元數(shù)進行讀取，從而將樣本中DNA分子數(shù)目計算出來[9]。該技術(shù)對反應(yīng)擴增效率的要求并不高，在很多稀有變異檢測中也能夠有效應(yīng)用。與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，ddPCR是一種全新的定量核酸分子的方式，其結(jié)果精確度更高、準(zhǔn)確性更強、靈敏度更佳，能夠?qū)崿F(xiàn)絕對定量。該項技術(shù)在多個領(lǐng)域已經(jīng)表現(xiàn)出明顯的技術(shù)優(yōu)勢，如微生物檢測、動物疫病檢測、地溝油檢測等。而隨著微滴數(shù)字PCR儀的廣泛普及，在今后生命科學(xué)的各個領(lǐng)域中，ddPCR技術(shù)應(yīng)用將更加廣泛。

2.5 代謝學(xué)檢測技術(shù)

代謝學(xué)檢測技術(shù)是微生物檢測領(lǐng)域所產(chǎn)生的新興檢測技術(shù)，主要是對微生物的繁殖過程進行檢測，通過培養(yǎng)基可以明確獲取食品中微生物的含量，并開展量化分析。當(dāng)前，常見的代謝學(xué)檢測技術(shù)主要有電阻抗法、放射測量法以及微量生化法等，均能檢測出食品中霉菌和細(xì)菌的總量。此外，通過微量生化檢驗技術(shù)，借助試劑的顏色就可以對食品中具體含有細(xì)菌的種類進行精準(zhǔn)判斷，不僅提高了微生物檢測的精確度，也推動了我國食品安全管理工作的系統(tǒng)化、規(guī)范化發(fā)展。

3 結(jié)論與展望

立足分子學(xué)角度，食品微生物檢測技術(shù)的發(fā)展實現(xiàn)了質(zhì)的飛躍，從以往傳統(tǒng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)法，逐漸向PCR技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)發(fā)展，使得食品微生物檢測從定性分析轉(zhuǎn)變?yōu)槎糠治觥６陙?，微滴式?shù)字PCR技術(shù)的產(chǎn)生，是一種絕對的定量分析檢測技術(shù)，在PCR擴增前，就有效分割了含有核酸分子的反應(yīng)體系，提高了檢測的靈敏度和精準(zhǔn)性。ddPCR技術(shù)與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，定量檢測限更低，且具有較強的特異性和重復(fù)性。此外，通過微滴式數(shù)字PCR技術(shù)能最大限度地對反應(yīng)體系進行分散，從而起到消除抑制因子的作用，使得檢測過程中的擴增效得到充分保障，對于核酸含量比較低的目標(biāo)樣品，也能夠進行有效檢測[10]。因此，在今后的食品微生物檢測技術(shù)的研究過程中，可以將ddPCR技術(shù)與EMA-PCR結(jié)合起來進行微生物檢測，充分發(fā)揮出絕對定量檢測的優(yōu)勢，使其在日常微生物檢測中廣泛應(yīng)用。與常規(guī)PCR檢測技術(shù)相比，在進行相同數(shù)量的樣品檢測時，采用ddPCR技術(shù)聯(lián)合EMA-PCR技術(shù)，能夠在較短時間內(nèi)完成檢測，且檢測結(jié)果精確度高，能夠真正實現(xiàn)絕對定量。