張強(qiáng)，代文婷，李冀新，金新文*

1(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830046) 2(新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆 石河子，832000)

甜瓜(Cucumismelo)是重要的葫蘆科經(jīng)濟(jì)作物，新疆甜瓜品質(zhì)好、含糖量高、風(fēng)味優(yōu)良，深受消費(fèi)者喜愛。甜瓜采收多集中于高溫的夏季，此時(shí)，果實(shí)不易長(zhǎng)期貯藏與異地銷售，這嚴(yán)重影響了甜瓜產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，甜瓜采后貯藏保鮮的問題已成為制約甜瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要瓶頸。

大多數(shù)甜瓜屬于呼吸躍變型水果，具有明顯的呼吸和乙烯釋放高峰，果實(shí)發(fā)生后熟即軟化加速并容易腐爛[1]。果實(shí)后熟軟化過程中，與果實(shí)品質(zhì)相關(guān)的質(zhì)地、色澤、糖酸組分、香氣及風(fēng)味物質(zhì)等評(píng)價(jià)指標(biāo)也在發(fā)生變化[2-3]。糖類是果實(shí)的重要構(gòu)成物質(zhì)，并且糖代謝與果實(shí)的后熟軟化存在顯著的相關(guān)性[4-5]，在果實(shí)后熟軟化過程中，淀粉酶與蔗糖磷酸酶(sucrose phosphate synthase,SPS)對(duì)淀粉與可溶性糖之間的轉(zhuǎn)化起重要作用，使果實(shí)中淀粉與可溶性糖含量處于動(dòng)態(tài)變化的平衡中[6-7]。淀粉對(duì)果實(shí)細(xì)胞結(jié)構(gòu)起重要的支撐作用，是維持果實(shí)硬度的重要物質(zhì)[8]，果實(shí)后熟軟化過程中淀粉不斷被水解，對(duì)果實(shí)細(xì)胞的支撐作用不斷減弱，果實(shí)的硬度也隨之下降[9]。

低溫貯藏能夠有效延緩果實(shí)后熟軟化，在低溫下，大量參與果實(shí)后熟生理代謝的酶活性、代謝中間物以及相關(guān)基因的表達(dá)均受到抑制，從而降低了果實(shí)中糖類及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗。乙烯是影響果實(shí)后熟生理過程至關(guān)重要的物質(zhì)，乙烯對(duì)果實(shí)的糖代謝也存在顯著的相關(guān)性[10]。1-甲基環(huán)丙烯(1-methylcyclopropene,1-MCP)是常用的乙烯抑制劑，能夠競(jìng)爭(zhēng)性地抑制乙烯后熟作用[11-12]。目前，對(duì)甜瓜果實(shí)后熟軟化與糖代謝及相關(guān)酶基因表達(dá)關(guān)系的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究以甜瓜為研究對(duì)象，將甜瓜果實(shí)在常溫、1-MCP處理和低溫下貯藏，研究甜瓜果實(shí)后熟軟化過程中，淀粉、可溶性糖、關(guān)鍵酶活性及其基因表達(dá)的變化，探討糖代謝對(duì)甜瓜果實(shí)后熟軟化的影響，為改進(jìn)與優(yōu)化甜瓜貯藏保鮮技術(shù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜瓜品種‘西州蜜17號(hào)’采自新疆石河子下野地，選取達(dá)到商品成熟度、重量、大小、無外傷、果型均勻的果實(shí)。1-甲基環(huán)丙烯，青島綠諾生物科技有限公司；DP 441 RNA提取試劑盒、KR 113反轉(zhuǎn)錄酶、KR 202 cDNA合成試劑盒、FP 209熒光定量檢測(cè)試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AGY-1果實(shí)硬度測(cè)量計(jì)，溫州艾力儀器制造有限公司；3051H呼吸強(qiáng)度測(cè)定儀，杭州綠博儀器有限公司；Trace GC 1300氣相色譜儀、ABI 7500熒光定量PCR儀，賽默飛世爾科技公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 甜瓜果實(shí)處理

對(duì)照組為直接貯藏于(20±1) ℃常溫下的果實(shí)；1-MCP處理：將甜瓜果實(shí)用1 μL/L的1-MCP在20 ℃下熏蒸24 h后通風(fēng)[13]，并于(20±1)℃下貯藏。冷藏處理：將果實(shí)置于(6±1)℃下預(yù)冷去除田間熱后在(2±0.5)℃下貯藏。每2 d對(duì)果實(shí)進(jìn)行硬度、呼吸速率、乙烯釋放量、淀粉與可溶性糖代謝酶和基因表達(dá)等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 果實(shí)硬度和呼吸速率的測(cè)定

參照CAMPS等[14]與李明霞等[15]的方法，在果實(shí)縱切面，均勻選取4個(gè)點(diǎn)，測(cè)定果肉硬度，單位kg/cm2。

1.3.3 呼吸速率與乙烯釋放量的測(cè)定

呼吸速率：用氣流法測(cè)定，設(shè)定呼吸強(qiáng)度測(cè)定儀氣流速度為0.4 L/min，單位CO2mg/(kg·h)。

乙烯釋放量的測(cè)定：參照李江闊等[13]的方法，用氣相色譜儀測(cè)定，結(jié)果用μL/(kg·h)表示。

以上檢測(cè)每次取9個(gè)果實(shí)，分3組，每組3個(gè)果實(shí)，每組重復(fù)測(cè)3次。

1.3.4 果實(shí)可溶性糖和淀粉含量測(cè)定

參照謝季云等[16]的方法，略加修改，稱取2.0 g鮮樣果肉，研磨，加80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇80 ℃水浴20 min，離心，集中上清液，重復(fù)3次，蒸去乙醇，加2 mL水溶解殘留物，微孔濾膜(0.25 μm)過濾，用液相色譜儀測(cè)定可溶性糖(蔗糖、葡萄糖和果糖)含量。將上述提取可溶性糖的殘余物用高氯酸提取，用蒽酮比色法測(cè)定生成的葡萄糖含量，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算淀粉含量，重復(fù)3次。

1.3.5 蔗糖代謝酶和淀粉酶活性測(cè)定

酶液提取和活性測(cè)定參照MERLO等[17]和ITAI等[18]的方法略加修改，稱取1.5 g鮮樣果肉，用液氮冷凍后研磨，加入6 mL提取液(50 mmol/L HEPES-NaOH，pH 7.5，10 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EDTA，2.5 mmol/L DTT，0.05% Tritonx-100和0.1% BSA)，勻漿后過濾，于4 ℃，12 000 r/min離心10 min，上清液于4 ℃下稀釋10倍后透析12 h，透析酶液用于酶活性測(cè)定。酶活性以O(shè)D520值表示。以失活酶液做空白對(duì)照，重復(fù)3次。

1.3.6 糖代謝關(guān)鍵酶基因的Real-time熒光定量PCR分析

總RNA提?。豪肦NA提取試劑盒提取果實(shí)總RNA，以總RNA為模板合成cDNA，Actin為內(nèi)參基因，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Excel軟件進(jìn)行繪圖，用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05作為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實(shí)硬度的變化

如圖1所示，在20 ℃下，對(duì)照組甜瓜果實(shí)貯藏8 d后硬度迅速下降；1-MCP處理組果實(shí)在12～14 d硬度下降速度略快，與對(duì)照組相比，1-MCP處理組果實(shí)的后熟軟化進(jìn)程較對(duì)照組有所推遲(P<0.05)；2 ℃下冷藏的甜瓜果實(shí)硬度下降最為緩慢，貯藏至第18天，果實(shí)硬度僅下降了2.7 kg/cm2。

2.2 甜瓜果實(shí)呼吸強(qiáng)度與乙烯釋放量的變化

呼吸強(qiáng)度是植物體新陳代謝的重要指標(biāo)，與果實(shí)的成熟衰老密切相關(guān)。由圖2-a可知，20 ℃下果實(shí)呼吸速率迅速升高，第6天出現(xiàn)呼吸躍變峰；1-MCP處理呼吸躍發(fā)生在第12天，躍變峰值也顯著降低；2 ℃冷藏的果實(shí)則未出現(xiàn)呼吸躍變現(xiàn)象。乙烯具有促進(jìn)果實(shí)成熟的作用，能夠加劇果實(shí)的后熟和衰老。如圖2-b所示，對(duì)照組與1-MCP處理組的乙烯釋放量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，對(duì)照組在第6天釋放量出現(xiàn)高峰，1-MCP處理組則推遲至第12天，且峰值較小。在2 ℃下冷藏的果實(shí)乙烯釋放量未出現(xiàn)顯著變化。結(jié)合圖2-a、b，可以看出，果實(shí)的呼吸強(qiáng)度與乙烯釋放量的變化存在密切的相關(guān)性與同步性。

2.3 果實(shí)淀粉和可溶性糖含量的變化

由圖3-a可知，在對(duì)照組中，甜瓜果實(shí)中的淀粉快速降解，淀粉含量下降較快；1-MCP處理能夠延緩淀粉降解，但長(zhǎng)期貯藏后，淀粉含量下降幅度仍然較大；在2 ℃下，果實(shí)內(nèi)淀粉降解被顯著抑制，淀粉下降緩慢，結(jié)合圖1分析可知，果實(shí)淀粉含量的下降與果實(shí)硬度的下降存在相同的變化趨勢(shì)。由圖3-b、c、d所示，對(duì)照組果實(shí)中可溶性糖(蔗糖、果糖和葡萄糖)含量在貯藏初期有小幅增加，并在第6天達(dá)到最大值后開始下降，在1-MCP處理組果實(shí)的可溶性糖含量的變化幅度較對(duì)照組小，在貯藏后期呈下降趨勢(shì)，其中，葡萄糖含量下降的幅度較蔗糖與果糖大。而在2 ℃下，果實(shí)中可溶性糖的含量變化最小(P<0.05)，并能夠長(zhǎng)期保持平穩(wěn)。

2.4 蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶(sucrosesynthase,SS)活性變化及其基因表達(dá)

從圖4-a、b可知，對(duì)照組與1-MCP處理組，甜瓜果實(shí)SPS活性及其基因表達(dá)均先升后降，1-MCP處理較對(duì)照組變化有所延遲，且變化量較小(P<0.05)；與對(duì)照組和1-MCP處理相比較，果實(shí)在2 ℃低溫下，SPS活性和SPS表達(dá)受到強(qiáng)烈抑制，酶活性與酶基因表達(dá)均處于較低水平(P<0.05)，這與蔗糖和果糖含量變化規(guī)律相一致(圖3-b、c、d)。

圖5-a、b表明，對(duì)照組中，甜瓜果實(shí)中SS活性不斷增強(qiáng)，SS基因表達(dá)則呈現(xiàn)先升高后緩慢下降的趨勢(shì)，說明基因表達(dá)小幅下降仍能維持酶的高活性。與對(duì)照組相比，1-MCP處理組中果實(shí)SS酶活性與SS的表達(dá)量均有所降低(P<0.05)，并且SS酶活性與SS基因表達(dá)的變化趨勢(shì)一致；與對(duì)照組和1-MCP處理組相比，在2 ℃下的果實(shí)中SS酶活性有所下降，并維持在低水平，SS的表達(dá)也受到顯著抑制(P<0.05)。

2.5 淀粉酶活性變化及其基因表達(dá)

由圖6-a、b結(jié)合圖1分析可知，對(duì)照組中，隨著甜瓜果實(shí)的后熟軟化，淀粉酶活性顯著升高，AM的表達(dá)量亦迅速增加。與對(duì)照組相比，1-MCP處理組果實(shí)的AM活性與AM基因表達(dá)受到一定程度的抑制，并有所降低(P<0.05)，但后期AM活性又有增加趨勢(shì)；3個(gè)組中，2 ℃下，果實(shí)AM活性與AM的表達(dá)所受抑制最為強(qiáng)烈，且始終穩(wěn)定在低水平。

2.6 酸性轉(zhuǎn)化酶(acid invertase,AI)活性變化及其基因表達(dá)

由圖7-a、b結(jié)果分析可知，與AM變化相似，對(duì)照組中果實(shí)酸性轉(zhuǎn)化酶活性隨著果實(shí)軟化迅速上升，并且發(fā)生呼吸躍變后呈加速上升趨勢(shì)，其基因表達(dá)也出現(xiàn)相似的規(guī)律；1-MCP處理使酶活性與基因表達(dá)的增加速度較常溫處理有所降低(P<0.05)，但同樣呈不斷上升的趨勢(shì)；同樣，與對(duì)照組和1-MCP處理相比，在2 ℃下，果實(shí)AI活性與AI基因表達(dá)受到強(qiáng)烈抑制，并顯著降低(P<0.05)。

3 討論

果實(shí)的后熟與軟化是一系列復(fù)雜生理生化反應(yīng)作用的結(jié)果，糖類物質(zhì)是果實(shí)的重要內(nèi)含物質(zhì)，糖代謝在這一過程中起重要作用[19-20]。

淀粉酶具有啟動(dòng)果實(shí)軟化的作用，是果實(shí)軟化的關(guān)鍵酶[21]。研究表明，磨盤柿果實(shí)軟化主要由淀粉含量下降所致，柿果實(shí)在軟化前發(fā)生呼吸躍變，淀粉在淀粉酶的作用下產(chǎn)生的糖能夠?yàn)楹粑S變提供所需的能源物質(zhì)[22]。此外，在蘋果[23]、桃[24]、獼猴桃[25]、香蕉[26]和菠蘿蜜[27]等果實(shí)軟化過程中，均存在淀粉酶活性升高，淀粉大量降解，淀粉含量迅速下降的現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)，甜瓜果實(shí)軟化過程中，淀粉酶活性與AM表達(dá)量增加最為顯著，在此過程中，淀粉含量迅速降低，果實(shí)硬度也快速下降，這表明淀粉降解是造成甜瓜果實(shí)軟化的重要原因。

在果實(shí)的軟化過程中，蔗糖含量也會(huì)發(fā)生顯著的變化，在香蕉、荔枝和獼猴桃果實(shí)的軟化階段，SPS活性顯著增加，蔗糖含量也快速上升，在果實(shí)軟化的后期，SPS活性開始降低，蔗糖含量也隨之下降[28-29]。

SPS和SS活性與甜瓜果實(shí)硬度的變化存在不同步性，SPS和SS酶活性與酶基因表達(dá)量變化趨勢(shì)一致，但酶活性與酶基因表達(dá)的增加要先于果實(shí)硬度的下降，這說明果實(shí)軟化是糖代謝積累到一定程度所產(chǎn)生的結(jié)果。此外，SPS和SS活性與酶基因表達(dá)均受1-MCP和低溫抑制，其變化分別與蔗糖和果糖含量變化趨勢(shì)一致。糖類物質(zhì)多處于果實(shí)許多代謝的上游，為果實(shí)這些生理代謝提供底物和能量等[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組甜瓜果實(shí)中葡萄糖含量在貯藏初期存在短暫的上升，這可能是葡萄糖積累為啟動(dòng)呼吸躍變提供能源物質(zhì)的階段，在呼吸速率與乙烯釋放量發(fā)生躍變后葡萄糖含量又快速下降，這可能是由于果實(shí)發(fā)生躍變后，后熟軟化等一系列生理代謝迅速增加，需要大量的能源物質(zhì)，消耗了大量葡萄糖，這也解釋了甜瓜果實(shí)軟化過程中，淀粉和其他糖不斷降解產(chǎn)生葡萄糖，而葡萄糖含量卻沒有顯著增加。在呼吸躍變后期，AI活性及其酶基因表達(dá)量亦顯著增加，由此可推斷，AI在甜瓜果實(shí)軟化的后期起作用。1-MCP處理組果實(shí)中各種糖含量的變化較對(duì)照組有所推遲，并且變化幅度較小，說明乙烯對(duì)糖代謝也具有促進(jìn)作用，因此，抑制乙烯的生產(chǎn)，對(duì)延緩甜瓜果實(shí)糖代謝與后熟軟化有積極的作用。此外，低溫貯藏能夠更為有效地抑制甜瓜果實(shí)的呼吸代謝與乙烯的產(chǎn)生，并降低糖代謝酶活性及相關(guān)酶基因的表達(dá)量，大幅延緩甜瓜果實(shí)的后熟生理代謝進(jìn)程。所以，在不發(fā)生冷害的情況下，適當(dāng)?shù)蜏啬軌蛞种铺鸸瞎麑?shí)的糖代謝，有效推遲果實(shí)的后熟軟化，從而延長(zhǎng)甜瓜的貯藏保鮮期。