王和玉，劉延峰，張巧玲，堵國成，楊 帆，李江華,*

（1.貴州香臺(tái)酒股份有限公司，貴州 仁懷 564501；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

白酒發(fā)酵過程中復(fù)雜的微生物種群是決定白酒風(fēng)味特征的重要因素[1-3]。霉菌能夠分泌多種酶類分解原料為發(fā)酵過程微生物提供代謝底物，同時(shí)其自身可生成各種代謝產(chǎn)物，對(duì)白酒風(fēng)味形成有重要貢獻(xiàn)[4-6]。在白酒生產(chǎn)中主要的功能霉菌包括毛霉、曲霉等。在醬香型白酒的釀造過程制曲、堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵中，宛氏擬青霉（Paecilomyces variotii）是優(yōu)勢霉菌之一[7]，研究表明該菌具有高糖化酶活力，能夠降解原料中的淀粉[8]，并且在制曲工藝、堆積工藝以及兼性條件下分別進(jìn)行純種固態(tài)發(fā)酵，能代謝生成酸、醇、醛、酮、酯及芳香族化合物等多種物質(zhì)，發(fā)酵產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)和風(fēng)味前體物質(zhì)，包括苯乙醇、苯乙酸等，是醬香型白酒中眾多呈香呈味物質(zhì)中的組成部分[9]。同時(shí)P. variotii也能夠分泌降解糠醛的酶，可有效降低酒醅中的糠醛[10]。

目前，在白酒釀造行業(yè)，針對(duì)釀造微生物功能研究已從傳統(tǒng)的發(fā)酵分析手段轉(zhuǎn)方代謝組學(xué)結(jié)合宏基因組、轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行全方面的解析[11-14]，迄今為止，白酒釀造微生物全基因組測序報(bào)道有地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）GMCC3963[15]、華根霉（Rhizopus chinensis）CTCCM201021[16]、耐高溫放線菌（Thermoactinomyces daqus）H-18[17]以及窖泥中分離得到的丁酸梭菌（Clostridium butyricum）JKY6D110[18]等。P. variotii作為醬香型白酒釀造過程的優(yōu)勢微生物之一，在制曲及制酒階段活動(dòng)活躍，目前對(duì)其研究主要在于產(chǎn)酶特性及代謝產(chǎn)物分析[8]，P. variotii全基因組分析鮮見報(bào)道，對(duì)P. variotii發(fā)酵代謝機(jī)制及生理生化等微生物特性缺乏足夠的認(rèn)識(shí)和了解，限制了深入開發(fā)和利用該微生物。

本研究通過PacBio RS II測序平臺(tái)，對(duì)香臺(tái)酒釀造過程中分離得到的P. variotii MTDF-01進(jìn)行全基因組測序，根據(jù)測序獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行基因組分析、基因功能注釋和比較基因組學(xué)分析，為今后進(jìn)一步深入了解P. variotii在醬香型白酒生產(chǎn)過程中的代謝機(jī)理以及為調(diào)控菌株代謝能力提供重要的生物信息學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株MTDF-01分離自香臺(tái)酒釀造過程。

真菌基因組DNA提取試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ACB-401超凈工作臺(tái) 新加坡Esco科技有限公司；spx-250B-z生化培養(yǎng)箱 上海福馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MaxQ 6000軌道搖床 賽默飛世爾科技公司；5804R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌體培養(yǎng)與回集

菌體培養(yǎng)：擬青霉劃線PDA瓊脂斜面培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)72 h后通過無菌生理鹽水洗下孢子，制備成孢子懸浮液。

菌體搖瓶培養(yǎng)：吸取450 μL孢子懸浮液（孢子濃度數(shù)量級(jí)107）接種至20 mL/250 mL的PDA液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)30 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min。將培養(yǎng)好的菌體通過過濾回集。

1.3.2 菌株總DNA提取

采用真菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，操作步驟參照試劑盒說明書。提取得到的基因組通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 全基因測序組裝

本次測序委托武漢生物技術(shù)研究院完成。樣本質(zhì)檢合格后，用Covarisg-TUBE對(duì)基因組DNA隨機(jī)打斷，進(jìn)行文庫構(gòu)建。利用磁磁富集、純化大片段DNA，對(duì)片段化的DNA進(jìn)行損傷修復(fù)、末端修復(fù)；在DNA片段兩端連接莖環(huán)狀測序接頭，并利用外切酶去除連接失敗的片段，純化后，采用Agilent 2100 Bioanalyzer HighSensitivity Kit進(jìn)行文庫質(zhì)量檢測。采用第3代測序儀PacBioRS II對(duì)DNA進(jìn)行非擴(kuò)增長片段測序，測序完成后去除adapter序列及截掉reads部分區(qū)域的低質(zhì)量堿基，采用HGAP[19]流程進(jìn)行組裝，挑選長reads作為種子序列，其他的較短reads通過BLASR軟件[20]比對(duì)到種子序列，進(jìn)行校正。最終以校正后的高質(zhì)量種子reads采用Celera assembler組裝軟件[21]用OLC組裝算法進(jìn)行組裝。利用Quiver軟件[22]進(jìn)行組裝結(jié)果的優(yōu)化和校正。在Quiver校正結(jié)果的基礎(chǔ)上，去除低覆蓋度的重疊群及冗余的重疊群。

1.3.4 基因預(yù)測與注釋

通過EVM（EvidenceModeler）軟件[23]整合Augustus軟件[24]、SNAP軟件[25]、GeneWise軟件[26]基因預(yù)測結(jié)果獲得基因結(jié)構(gòu)預(yù)測，將獲得的基因提交COG（cluster of orthologous groups of proteins）[27]、GO（gene ontology）[28]、KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）[29-30]、NR（non-redundant protein database）、Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫[31]、TrEMBL數(shù)據(jù)庫[31]進(jìn)行比對(duì)，獲得功能注釋信息。

1.3.5 物種進(jìn)化樹構(gòu)建及分析

挑選菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，運(yùn)用MEGA 7.0軟件（https://www.megasoftware.net/）Neighbor-Joining法進(jìn)行分析，以18S rRNA基因進(jìn)行比較分析構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.6 CAZy糖酶分析

通過dbCAN HMMs 3.0在線工具[32]（http://csbl.bmb.uga.edu/dbCAN/index.php）將P. variotiiMTDF-01的CDS序列與碳水化合物活性酶（CAZy）數(shù)據(jù)庫（http://www.cazy.org/）進(jìn)行比對(duì)分析。比對(duì)時(shí)dbCAN的閾值參數(shù)設(shè)置如下：如果比對(duì)的序列長度大于80 aa，閾值＜1×10-5，否則閾值＞1×10-3。

1.3.7 次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇分析

利用antiSMASH 3.0[33]（https://fungismash.secondarymetabolites.org）對(duì)MTDF-01菌株中次生代謝物合成基因組簇進(jìn)行預(yù)測。

1.3.8 基因組共線性分析

利用Mummer程序（https://sourceforge.net/projects/mummer/postdownload，版本3.23）對(duì)MTDF-01及NCBI中已測序的菌株P(guān). variotiiNo.5進(jìn)行分析比較，并用MUMmerplot將結(jié)果可視化。菌株P(guān). variotiiNo.5序列從NCBI網(wǎng)站下載（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA/000/497/085/GCA_000497085.1_PVAR5_assembly01/）。

2 結(jié)果與分析

2.1 MTDF-01全基因組基本特征及初步分析

PacBio RS II是首個(gè)商業(yè)化應(yīng)用的第3代測序平臺(tái)，其采用特有的單分子實(shí)時(shí)技術(shù)使得測序讀長較第2代測序技術(shù)顯著增加（半數(shù)測序讀長大于20 kb），同時(shí)減弱GC性[19]。通過PacBio RS II測序平臺(tái)對(duì)菌株MTDF-01進(jìn)行全基因組測序，獲得菌株MTDF-01全基因組數(shù)據(jù)。測序數(shù)據(jù)過濾后總數(shù)據(jù)量為2.58 G，平均測序讀長為14.64 kb，最長的測序讀長達(dá)到 46.94 kb，測序深度為83.81×，DNA靶序列平均長度為7 823 bp。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝后得到參考序列由19 個(gè)重疊群組成，形成19 個(gè)基因組骨架，總長度為30 833 540 bp，其中最長重疊群為7 588 950 bp，GC平均含量為47.46%。MTDF-01基因組測序數(shù)據(jù)提交至NCBI，GenBank登錄號(hào)為SAMN09987769。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

為進(jìn)一步確認(rèn)MTDF-01的種屬關(guān)系，本研究以18S rRNA基因進(jìn)行比較分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。結(jié)果表明MTDF-01與P. variotiiCBS 102.74、P. variotiiCBS 101075聚為一支，可以確定為P. variotii，同時(shí)與P. variotiiNo.5也聚為一支，兩者物種親緣關(guān)系較近。

圖1 通過MEGA Neighbor-Joining法構(gòu)建的真菌分子系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Molecular phylogenetic tree of fungi constructed by Neighbor-Joining method with MEGA software

2.3 基因結(jié)構(gòu)預(yù)測

基于ab initio預(yù)測軟件（Augustus、SNAP、GeneMark-ES）及同源比對(duì)預(yù)測兩種方法對(duì)P. variotiiMTDF-01測序拼接片段進(jìn)行基因預(yù)測與編碼區(qū)分析，共預(yù)測出基因8 815 個(gè)，基因總長度為13 530 750 bp，平均基因長度為1 740 bp，平均編碼序列長度為478 bp。預(yù)測基因序列采用多個(gè)數(shù)據(jù)庫（KOGGOKEGGNRSwiss-ProtTrEMBL）進(jìn)行比對(duì)，獲得相應(yīng)功能注釋信息，最終注釋基因8 662 個(gè)，詳細(xì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見表1。在基因組序列上共找到5 044 個(gè)簡單重復(fù)序列，分別采用同源比對(duì)和de novo預(yù)測的方式對(duì)基因組的重復(fù)序列進(jìn)行注釋，結(jié)果顯示該基因組中含有3.80%的重復(fù)序列。在基因序列上共找到tRNA數(shù)量為221 個(gè)，rRNA為49 個(gè)。

表1 基因功能注釋統(tǒng)計(jì)Table 1 Gene function annotation statistics of MTDF-01

2.4 基因功能分類

2.4.1 COG聚類分析

NCBI創(chuàng)建并維護(hù)的蛋白數(shù)據(jù)庫COG是根據(jù)細(xì)菌、藻類和真核生物完整基因組的編碼蛋白系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分類構(gòu)建而成。真核生物的序列功能可通過真核基因組數(shù)據(jù)庫KOG進(jìn)行比對(duì)及預(yù)測。對(duì)P. variotiiMTDF-01基因功能進(jìn)行初步分析，選擇利用COG進(jìn)行基因注釋與功能分類，共注釋基因1 972 個(gè)，占總蛋白數(shù)的22.37%，可分為25 個(gè)功能組，3 大類分別為細(xì)胞過程及信號(hào)、信息儲(chǔ)存及加工、代謝過程，分別注釋基因數(shù)為556、336 個(gè)和822 個(gè)。從圖2可看出，分類為R（普通功能預(yù)測）的基因數(shù)量最多為377 個(gè)，其余基因序列主要集中在O（蛋白翻譯后修飾）、C（能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換）、I（脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝）及Q（次級(jí)代謝物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝）等分類單元。

圖2 MTDF-01預(yù)測蛋白COG功能分類Fig. 2 COG cluster analysis of MTDF-01 proteins

2.4.2 GO聚類分析

基于基因本體數(shù)據(jù)庫GO功能分類，該數(shù)據(jù)庫按照細(xì)胞學(xué)組件、分子功能、生物學(xué)過程對(duì)蛋白進(jìn)行分類注釋。本研究將MTDF-01菌株進(jìn)行蛋白質(zhì)功能分析，共預(yù)測得到5 490 個(gè)蛋白，注釋統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示?？煽闯鼍甑腉O功能聚類在細(xì)胞、細(xì)胞組分、連接、催化活性、細(xì)胞過程、代謝過程等條目的基因數(shù)占據(jù)優(yōu)勢，其中細(xì)胞和細(xì)胞組分各有1 187 個(gè)基因，分子功能中的連接和催化活性功能分別有2 929 個(gè)和2 922 個(gè)，生物學(xué)過程中的細(xì)胞過程和代謝過程分別注釋到2 077 個(gè)及2 914 個(gè)基因，表明在菌株的蛋白功能主要為細(xì)胞組成、代謝和酶催化。

表2 MTDF-01預(yù)測蛋白GO分類Table 2 Gene ontology classi fication of MTDF-01 proteins

續(xù)表2

2.4.3 KEGG代謝途徑預(yù)測分析

本研究通過將P. variotiiMTDF-01與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析，共注釋得到物質(zhì)代謝通路274 個(gè)。MTDF-01中預(yù)測代謝通路（圖3）在新陳代謝、遺傳信息加工、細(xì)胞過程3 個(gè)大類中涉及基因較多，遺傳信息加工（轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)的折疊和加工等）共有566 個(gè)基因，細(xì)胞過程（轉(zhuǎn)運(yùn)代謝、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞生長與死亡細(xì)胞通訊等）共有382 個(gè)基因，而涉及代謝的這類基因最多，行使的功能較多，既有細(xì)胞本身合成氨基酸的基因，也有氨基酸代謝、膜蛋白基因以及能量系統(tǒng)基因等，共有1 506 個(gè)。在代謝中涉及基因最多的通路主要有嘌呤代謝途徑（ko00230）、氧化磷酸化途徑（ko00190）、嘌呤代謝途徑（ko00240）、糖酵解途徑（ko00010）、淀粉與蔗糖代謝途徑（ko00500）、精氨酸與脯氨酸代謝途徑（ko00330）。

通過比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MTDF-01中涉及氨基酸代謝的代謝途徑有20 條共462 個(gè)基因，包含了苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸等芳香族氨基酸代謝途徑，芳香族氨基酸可為苯乙醇、苯乙酸等風(fēng)味物質(zhì)代謝提供前體物質(zhì)，但缺失精氨酸合成途徑的相關(guān)基因。進(jìn)一步對(duì)白酒特征風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)通路分析發(fā)現(xiàn)MTDF-01具有苯乙醇、苯乙酸、亞麻油酸、苯甲酸、肉桂酸乙酯、乙酸、乳酸等風(fēng)味物質(zhì)的代謝途徑。其中苯乙醇和苯乙酸可通過苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成途徑將苯丙氨酸在氧化氫-過氧化物酶作用下生成2-苯乙酰胺，進(jìn)一步在酰胺酶作用下生成苯乙酸，苯乙酸可在乙醛脫氫酶和和芳基乙醇脫氫酶作用下生成苯乙醇。苯丙氨酸也可通過芳香族L-氨基酸/L-色氨酸脫羧酶作用生成苯乙胺，苯乙胺在芳基乙醇脫氫酶作用下生成苯乙醇。在P. variotiiMTDF-01中有多條通路可合成乙酸，該菌株具有乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶相關(guān)基因能夠?qū)⒁掖佳趸梢宜?，還可丙酮酸代謝途徑、乙醛酸和二羧酸鹽代謝途徑代謝生成乙酸。注釋結(jié)果表明P. variotiiMTDF-01有亞麻油酸、油酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸等多種有機(jī)酸合成的關(guān)鍵酶。有文獻(xiàn)報(bào)道，P. variotii具有降解糠醛的功能[10]，但在注釋結(jié)果中并未發(fā)現(xiàn)糠醛降解途徑。根據(jù)預(yù)測信息可推測該菌株在白酒發(fā)酵過程中可能對(duì)白酒風(fēng)味代謝具有重要貢獻(xiàn)。

圖3 P. variotiiMTDF-01 KEGG功能分類Fig. 3 KEGG cluster analysis of P. variotii MTDF-01 proteins

2.4.4 CAZy糖酶分析

在白酒釀造過程中，淀粉酶能夠?qū)⒃现械牡矸劢到馍善咸烟堑壤谖⑸锢玫倪€原糖，為發(fā)酵進(jìn)程提供營養(yǎng)底物，促進(jìn)酵母等微生物生長代謝。原料中的纖維成分較多，纖維素酶能夠?qū)w維素進(jìn)行降解，釋放淀粉，有利于糖化酶的作用，同時(shí)纖維素酶能夠?qū)⒃系矸壑?%左右的纖維素和半纖維素轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵性糖，有利于酵母的利用[34]，此外，纖維素酶也會(huì)影響白酒的風(fēng)味[35]。

將基因組序列與CAZy數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，在P. variotiiMTDF-01的基因組中共有907 個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域?qū)貱AZy家族，包括425 個(gè)糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GHs）、307 個(gè)糖苷轉(zhuǎn)移酶、75 個(gè)碳水化合物酯酶、5 個(gè)多糖裂解酶、213 個(gè)碳水化合物結(jié)合組件（carbohydrate-binding modules，CBMs），其中194 個(gè)基因含有多種組分結(jié)構(gòu)域，表明MTDF-01含有豐富的碳水化合物代謝酶。CBMs作為一些GHs所含有的非催化活性結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域，使得GHs能靠近底物，以增加GHs錨定底物的能力，從而影響GHs的酶催化活性。通過預(yù)測MTDF-01的基因組中共有108 個(gè)GHs基因含有CBMs結(jié)構(gòu)域。

淀粉降解的酶主要為α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶（糖化酶）等，纖維素酶主要為α/β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶，木聚糖是半纖維素中最主要的碳水化合物，因此木聚糖酶也成為了半纖維素降解中的主要酶類。為進(jìn)一步探索P. variotiiMTDF-01對(duì)淀粉及纖維素的降解能力，本研究對(duì)在P. variotiiMTDF-01基因組中淀粉/糖原、纖維素等降解酶相關(guān)酶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，見表3。結(jié)果表明在P. variotiiMTDF-01基因組中含有多個(gè)淀粉及纖維素水解酶基因，分別為60 個(gè)及165 個(gè)，可推測P. variotiiMTDF-01具有降解淀粉和纖維素的潛力。在白酒生產(chǎn)過程中，纖維素酶來源廣泛，大曲中的細(xì)菌、真菌和放線菌都有產(chǎn)纖維素酶的能力。在曲霉[36]、Paenibacillussp.、Acinetobactersp.[37]等微生物中均有較強(qiáng)的纖維素降解力，但對(duì)P. variotii纖維素降解方面研究較少，P. variotii纖維素降解能力仍需進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

表3 P. variotii MTDF-01淀粉及纖維素降解酶CAZy預(yù)測結(jié)果Table 3 Predicted starch and cellulose degrading-enzymes of P. variotiiM TDF-01 from CAZy database

2.4.5 次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇分析

表4 MTDF-01次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇Table 4 Secondary metabolic gene clusters of MTDF-01

聚酮合酶基因合成酶途徑、非核糖體多肽合成酶途徑與聚酮合酶基因合成酶-非核糖體多肽合成酶混合代謝是大多數(shù)真菌毒素合成中的關(guān)鍵代謝途徑。同時(shí)在真菌的萜類化合物代謝過程中，也能產(chǎn)生多種真菌毒素[16]。用anti-SMASH對(duì)基因組進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物合成分析預(yù)測，基因組中共預(yù)測得到23 個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇，主要為聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）基因簇、非核糖體多肽合成酶（non-ribosomal peptide synthase，NRPS）基因簇和萜烯類，具體預(yù)測結(jié)果如表4所示。在預(yù)測到的基因簇中，pks和Nrps基因簇共15 個(gè)，占預(yù)測總基因簇的65.21%，T1pks有7 個(gè)，Nrps有6 個(gè)，T1pks-Nrps有2 個(gè)，萜烯類合成途徑基因簇有5 個(gè)。但所有基因簇與已知次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，P. variotiiMTDF-01的基因組中PKS途徑、NRPS途徑與PKS-NRPS混合代謝途徑、萜烯類途徑中的基因簇并未匹配及注釋到相似性高的基因信息，相似度最高的僅為33%。因此可認(rèn)為P. variotiiMTDF-01中不存在PKS、NRPS、PKSNRPS混合代謝途徑、萜烯類等途徑合成代謝能力，P. variotiiMTDF-01不具備合成該類物質(zhì)的能力。

通過KEGG對(duì)萜類化合物合成途徑分析時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在P. variotiiMTDF-01中注釋到參與萜類化合物代謝途徑的基因僅有26 個(gè)，其中萜類化合物合成途徑注釋到18 個(gè)基因，主要為萜類物質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)的真菌甲羥戊酸合成途徑中注釋到相對(duì)完整的代謝途徑，共16 個(gè)基因，但并未注釋到特異性后修飾相關(guān)蛋白序列，因此，根據(jù)基因組預(yù)測信息可表明P. variotiiMTDF-01不具備真菌毒素合成能力，是白酒釀造過程的發(fā)全菌株。

2.5 與P. variotii No.5比較基因組學(xué)分析

2.5.1P. variotiiNo.5全基因組概況

目前已報(bào)道的關(guān)于P. variotii的全基因組測序的菌株為P. variotiiNo.5（NBRC109023）。P. variotiiNo.5是1 株分離于土壤中的耐甲醛的真菌，能夠在20 min內(nèi)降解2%的甲醛[38]。將P. variotiiMTDF-01與P. variotiiNo.5菌株進(jìn)行比較基因組學(xué)研究，以研究不同環(huán)境P. variotii基因組信息的差異，為研究不同來源P. variotii基因組框架、組成及蛋白差異提供理論基礎(chǔ)及研究方方。兩個(gè)菌株基本信息統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表5所示。

表5 P. variotiiMTDF-01與P. variotii No.5基本特征比較分析Table 5 Comparative analysis of general features of P. variotii MTDF-01 and P. variotii No.5

2.5.2 共線性分析

圖4 P. variotii MTDF-01與P. variotii No.5基因組序列線性結(jié)構(gòu)比較Fig. 4 Global alignment between P. variotii MTDF-01 and No.5

通過比較P. variotiiMTDF-01與P. variotiiNo.5兩個(gè)基因組的同源性，繪制共線性關(guān)系點(diǎn)陣圖（圖4）以觀測結(jié)構(gòu)性的差異。結(jié)果表明P. variotiiMTDF-01與P. variotiiNo.5在基因組水平上存在較大差異。從圖4可看出，兩者基因組中有多條大片段能夠比對(duì)上，兩株菌基因組存在一定相似性，但是存在大量倒位、重排等現(xiàn)象。對(duì)單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)P. variotiiMTDF-01與P. variotiiNo.5兩個(gè)基因組共存在16 414 處單核苷酸堿基突變，其中有525 個(gè)堿基缺失，335 個(gè)堿基插入，15 554 個(gè)單堿基替換。

進(jìn)一步對(duì)蛋白編碼序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：P. variotii MTDF-01共預(yù)測CDS序列8 815 個(gè)，P. variotii No.5共預(yù)測CDS序列8 877 個(gè)，總匹配蛋白數(shù)（相似度大于50%）為7 743 個(gè)，其中僅有26 個(gè)基因完全匹配上，其余7 717 個(gè)基因存在氨基酸層面的突變、插入或缺失，相似度在90%以上的基因有5 803 個(gè)，占總匹配蛋白數(shù)的74.94%。兩者在氨基酸水平上既有相似性又有各自的獨(dú)特性。通過KEGG注釋結(jié)果表明No.5存在大量環(huán)境信息處理相關(guān)基因，主要涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。由于P. variotii MTDF-01和P. variotii No.5兩株菌株來源環(huán)境差異較大，P. variotii No.5來源于土壤環(huán)境，而P. variotii MTDF-01在白酒釀造環(huán)境中經(jīng)過高溫高酸等環(huán)境脅迫條件長期馴化，因此這也可能導(dǎo)致兩株菌在基因組及功能的差異。白酒釀造環(huán)境的長期馴化使P. variotii MTDF-01顯示出獨(dú)特性。

3 討論與結(jié)論

Oka等[38]將從土壤中分離得到的P. variotii No.5進(jìn)行全基因組測序，并根據(jù)其具有降解甲醛的功能，對(duì)參與甲醛代謝的相關(guān)途徑進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了7 個(gè)相關(guān)蛋白。Radwan等[39]從噴氣燃料中分離得到Paecilomyces sp. BYSS01，預(yù)測發(fā)現(xiàn)共有334 種真菌酶參與碳水化合物代謝，并且能夠參與芳香烴和正烷烴的降解。但在白酒釀造過程中關(guān)于P. variotii的基因組研究鮮見報(bào)道。本研究通過對(duì)白酒釀造過程中分離得到P. variotii MTDF-01進(jìn)行全基因組測序，拼接得到基因組總長度為30 833 540 bp，GC平均含量為47.46%。通過COG、GO、KEGG等數(shù)據(jù)庫比較分析發(fā)現(xiàn)MTDF-01菌株基因主要涉及遺傳信息加工、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝過程，在代謝過程中主要參與碳水化合物、氨基酸、核苷酸、能量代謝等代謝通路，這為進(jìn)一步了解P. variotii代謝機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)?；贙EGG和全基因組測序數(shù)據(jù)代謝網(wǎng)絡(luò)注釋發(fā)現(xiàn)，P. variotii MTDF-01具有苯乙醇、苯乙酸、苯甲酸、肉桂酸乙酯、乙酸、乳酸等代謝途徑并具有合成多種有機(jī)酸的關(guān)鍵酶，此外，通過碳水化合物預(yù)測和次級(jí)代謝產(chǎn)物分析表明P. variotii MTDF-01含有多個(gè)淀粉和纖維素水解酶，具有降解淀粉和纖維素的潛力，不具備真菌毒素合成能力，是白酒釀造過程的發(fā)全菌株。對(duì)P. variotii MTDF-01與P. variotii No.5基因組進(jìn)行比較基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，兩者存在顯著差異，存在翻轉(zhuǎn)及異位等基因組重排現(xiàn)象，P. variotii MTDF-01具有獨(dú)特性。

本研究利用全基因組測序?qū)Π拙漆勗爝^程中分離得到的P. variotii MTDF-01進(jìn)行分析，在P. variotii MTDF-01中發(fā)現(xiàn)了參與釀酒原料代謝及風(fēng)味物質(zhì)合成代謝的基因及代謝通路，為解析P. variotii的釀造功能提供了新思路，從基因組水平對(duì)P. variotii代謝途徑的挖掘，為深入了解P. variotii在白酒生產(chǎn)過程中的代謝機(jī)理提供了參考信息及研究方方，對(duì)以后P. variotii的相關(guān)研究具有重要意義。