高慶超，常應(yīng)九，馬蓉，鄒瀟瀟，曹效海，2，王樹林，2，*

（1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧810016；2.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧810016）

1985 年，由世界酵素之父、美國醫(yī)學(xué)博士愛德華·豪威爾教授最早提出“酵素營養(yǎng)學(xué)理論”，酵素的發(fā)現(xiàn)也被公認(rèn)為是人類生命科學(xué)領(lǐng)域的重大里程碑[1]。微生物酵素產(chǎn)品主要盛行于日本、美國、一些歐洲國家及東南亞地區(qū)，且形成了品牌產(chǎn)業(yè)規(guī)模，而近十多年來，在中國也開始盛行起來，越來越多的酵素理念被引入到農(nóng)業(yè)、食品、美容保健等領(lǐng)域[2-3]。

酵素是以乳酸菌、酵母菌等多菌種發(fā)酵果蔬、菌菇或中草藥等，形成富含礦物質(zhì)、氨基酸、多種酶及乳酸、醋酸和少量乙醇等代謝產(chǎn)物的液態(tài)和固態(tài)食品[4-5]。酵素的舊稱是“酶”，但其不只是酶，還包含了產(chǎn)酶微生物及其相互作用的代謝產(chǎn)物，屬于一個微生態(tài)整體[6]，其中包括微生物與微生物、微生物與底物及底物與底物之間的相互作用，不僅保留了發(fā)酵原料中原有的營養(yǎng)物質(zhì)，而且通過微生物發(fā)酵代謝產(chǎn)生了新的生物活性成分[7]。這些物質(zhì)能夠通過影響機(jī)體內(nèi)的酶來調(diào)節(jié)細(xì)胞層面的生命活動，將大分子物質(zhì)催化分解成小分子物質(zhì)，比如多糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖、蛋白質(zhì)分解成氨基酸、脂肪分解成脂肪酸，從而被機(jī)體細(xì)胞吸收利用來維持機(jī)體功能、組織修復(fù)、食物消化等生命活動[8]。正因?yàn)槿绱?，使得酵素富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，比如總酚、各種酶、低聚糖、有機(jī)酸、氨基酸、脂肪酸及礦物質(zhì)等，還具有多種生物活性功能。

近年來，酵素類產(chǎn)品因其在日本等地的風(fēng)靡，而受到我國消費(fèi)者的青睞，酵素食品的多種功能特性使得其在功能性食品開發(fā)領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用前景，受到諸多科研學(xué)者的關(guān)注。本文就微生物酵素的生產(chǎn)工藝、主要微生物、相關(guān)代謝物質(zhì)及生物活性等相關(guān)研究展開綜述，期望能對今后功能性微生物酵素食品的開發(fā)研究提供參考。

1 微生物酵素的工藝研究

由于酵素產(chǎn)品非常受歡迎，而且我國酵素產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)發(fā)展剛剛起步，針對不同原料酵素產(chǎn)品的發(fā)酵配方及工藝條件優(yōu)化的相關(guān)研究也相繼報道出來。對于酵素發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化研究相對較多，比如李世燕等[9]研究發(fā)現(xiàn)同時接種酵母菌和乳酸菌發(fā)酵的毛酸漿酵素的抗氧化性最好，還原力、DPPH 自由基清除能力和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）分別高達(dá) 1.051、30.97%、409.52 U/mL。張旭普[10]通過響應(yīng)面法對糙米酵素發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，以總抗氧化、還原糖消耗量、SOD 酶和還原型谷胱甘肽為指標(biāo)，篩選出4 種最佳發(fā)酵工藝條件。董潔[11]通過采用酵母菌和乳酸菌發(fā)酵金絲小棗制備金絲小棗酵素，得到最佳菌種添加量為酵母菌（0.1%）和乳酸菌（0.5%）。戰(zhàn)偉偉等[12]通過單因素試驗(yàn)與正交設(shè)計篩選出藍(lán)靛果椰子復(fù)合酵素的最佳發(fā)酵工藝為發(fā)酵溫度為33 ℃，發(fā)酵時間為70 d，酵母菌與雙歧桿菌質(zhì)量比為2 ∶1，藍(lán)靛果果漿與椰子果漿質(zhì)量比為5 ∶1。郭俊花等[13]對蘋果皮渣酵素發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵工藝條件：蘋果皮渣添加量400 g/L、加糖量90 g/L、初始pH 值5.5、發(fā)酵時間150 d，在此條件下，各項營養(yǎng)物質(zhì)含量指標(biāo)為最佳。李豆[14]利用11 種水果發(fā)酵制備水果酵素，通過單因素試驗(yàn)與正交設(shè)計確定最佳菌種比為1.0%雙歧桿菌、1.0%葡萄酒酵母菌和1.5%嗜熱鏈球菌。葛朋燁[15]對沙棘果汁酵素的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝條件：先加入0.15%酵母菌（溫度30 ℃、pH=3.5、發(fā)酵16 h），后加入0.5%干酪乳巧菌（溫度37 ℃、pH=3.5，發(fā)酵 24 h）。

對于酵素配方研究相對較少，楊婧娟等[16]以枸杞、蘆薈、山藥、山楂和薏苡仁為主要原料制備酵素，得到最佳配方為45.29%枸杞、10.00%蘆薈、10.00%山藥、24.71%山楂、10.00%薏苡仁。

為了縮短發(fā)酵時間及提高細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)溶出，有研究學(xué)者采用其他技術(shù)進(jìn)行輔助發(fā)酵，如朱德艷等[17]利用超聲波輔助發(fā)酵米糠酵素，通過單因素試驗(yàn)與正交優(yōu)化設(shè)計得到最佳發(fā)酵工藝條件為超聲時間90 min，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵pH 值為6.0，發(fā)酵時間為25 d。洪厚勝等[18]通過響應(yīng)面設(shè)計對超聲輔助葡萄果渣酵素發(fā)酵進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)工藝條件為初始pH 值5.00，糖添加量8%，乳酸菌接種量12%，超聲時間60 min。

針對以上研究可以看出，近年來各研究學(xué)者利用不同的發(fā)酵原料發(fā)酵制備酵素，并對發(fā)酵工藝、配方及輔助發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，說明現(xiàn)今酵素產(chǎn)品的發(fā)展已非常之快，諸多科研工作者對于微生物酵素產(chǎn)品的開發(fā)產(chǎn)生了極大的興趣，這將為今后酵素企業(yè)和產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定良好的理論基礎(chǔ)，在一定程度上會推動產(chǎn)學(xué)研合作的發(fā)展。

2 酵素中微生物研究

由于酵素原料的不同，在發(fā)酵過程中微生物類型也不盡相同，但主要微生物為酵母菌、乳酸菌、醋酸菌和霉菌[19]，對于酵素類產(chǎn)品微生物分離鑒定的研究也成為近年來的研究熱點(diǎn)。而目前國內(nèi)對微生物酵素的研究處于起步階段，同時由于其發(fā)酵菌種多、周期長、組分復(fù)雜、條件難控等問題[20]，研究報道相對較少。

對于酵素中微生物的類型分析，Ai Leng Teoh 等[21]從紅茶菌酵素進(jìn)行分離得到接合酵母。盧夢瑤等[22]通過以10 種酵素樣品為菌源，經(jīng)分離純化、產(chǎn)酸定性和定量試驗(yàn)，獲得1 株高產(chǎn)酸量醋酸菌，對其形態(tài)學(xué)、生理生化指標(biāo)測定及16S rDNA 鑒定，確定其為芝庇儂醋酸桿菌（Acetobacter cibinongensis）。Okada 等[23]從植物酵素中分離鑒定出來的微生物主要是酵母菌（接合酵母屬 Zygosaccharomyces spp．、畢赤酵母 Pichia spp．）、曲霉（米曲霉Aspergillus oryzae）、乳酸菌（明串珠菌Leuconostoc spp．）。Safak S 等[24]從紅茶菌酵素進(jìn)行分離得到釀酒酵母。魏東東等[25]對紅樹莓酵素中的優(yōu)勢菌進(jìn)行了分離鑒定，篩選出4 種菌株：釀酒酵母、庫德畢赤酵母、盔形畢赤酵母、植物乳桿菌。由此可以看出，在酵素發(fā)酵過程中的起主要作用的微生物是酵母菌、醋酸菌、乳酸菌、霉菌，經(jīng)過相互作用，使得酵素形成一個微生態(tài)整體。

目前，高通量測序技術(shù)由于具備靈敏度高、讀數(shù)長和效率高的特點(diǎn)，能更加真實(shí)的反映發(fā)酵食品中微生物群落定性及相對定量的遺傳信息[26-27]，已廣泛應(yīng)用傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物體系的研究。凌空等[28]通過16S rRNA、pheS 基因和26S rRNA 測序方法分析了發(fā)酵6 月、12 月和18 月的果蔬酵素中的主要微生物類型。齊天翊[29]利用高通量測序技術(shù)對自制酵素不同發(fā)酵階段的微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)動態(tài)變化進(jìn)行了分析與比較。杜麗平等[30]利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)對木瓜酵素在自然發(fā)酵過程中微生物的多樣性及變化規(guī)律進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌為優(yōu)勢細(xì)菌，釀酒酵母和畢赤酵母為優(yōu)勢酵母菌。Lee等[31]采用16S 和26S rRNA 序列分析法研究了一種植物酵素中的微生物多樣性，結(jié)果表明，L.homohiochii是優(yōu)勢菌種；其它菌種的含量因含糖量不同而不同。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，逐漸彌補(bǔ)了傳統(tǒng)微生物分離鑒定方法的不足，但對于各類酵素中微生物的多樣性、物種豐度及群落結(jié)構(gòu)動態(tài)變化規(guī)律的研究鮮有報道，因此，利用高通量測序技術(shù)觀測酵素發(fā)酵過程中的微生物動態(tài)變化將是今后研究的一個思路，以便為今后酵素發(fā)酵過程中菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)控提供參考。

3 微生物酵素的相關(guān)代謝物質(zhì)研究

由于微生物作用，酵素在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生一些新的營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分。近年來對于酵素中的相關(guān)代謝產(chǎn)物的變化研究也成為熱點(diǎn)對象，比如各類酶、總酚、總酸、總糖、還原糖、有機(jī)酸、pH 值、總蛋白、總黃酮、氨基酸等物質(zhì)，引起了科研學(xué)者極大的興趣，關(guān)于酵素中代謝物質(zhì)的變化研究也是非常之多。

酵素的俗稱為“酶”，人體機(jī)能的維持與酶密切相關(guān)，SOD 酶、脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶是酵素中主要的功效酶，所以酵素中酶活性的測定必然是重中之重。陳爽等[32]對液狀水果酵素中酶活力進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)SOD 酶活性最高，蛋白酶次之，淀粉酶和脂肪酶活性較低。邵穎等[33]研究植物酵素發(fā)酵過程中SOD 酶、蛋白酶、纖維素酶的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)纖維素酶有明顯的提高。張靜雯[34]通過比較添加菌種和未添加菌種的蘋果酵素中酶的活力，發(fā)現(xiàn)SOD 酶和脂肪酶活性分別降低了22.39%和69.49%，淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶活性分別提高了50%、85.71%和54.19%。

在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物，包括糖、有機(jī)酸、氨基酸及香氣成分等，有機(jī)酸是酵素主要的呈味物質(zhì)，近年來研究也相對較多，如Okada 等[35-36]從一種植物酵素中分離出多種新型寡糖。Arun 等[37]測定了環(huán)保酵素不同發(fā)酵階段的有機(jī)酸含量，且酵素食品中有機(jī)酸來源于果蔬原料及有益菌的代謝產(chǎn)物。蔣增良[38]對發(fā)酵一年的樹莓酵素、藍(lán)莓酵素和葡萄酵素的有機(jī)酸種類和含量及樹莓酵素相關(guān)代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律進(jìn)行了研究。楊小幸等[39]對蘋果酵素天然發(fā)酵過程中pH 值、總酸、有機(jī)酸（乳酸、醋酸、蘋果酸）、糖類（蔗糖、葡萄糖、果糖）、乙醇、總酚含量和DPPH 自由基清除率的變化規(guī)律進(jìn)行了研究。Shi 等[40]在天然葡萄酵素中檢測到102 種香氣成分，包括酯、醇、酮、烷烴、酸等芳香物質(zhì)。張夢梅等[41]對23 份酵素樣品中有機(jī)酸的種類及含量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)酵素主要有機(jī)酸為草酸、蘋果酸、乳酸和乙酸。Braga 等[42]發(fā)現(xiàn)，蘋果汁中主要芳香化合物是乙醛，而蘋果酵素中主要是3-甲基-1-丁醇。郭紅蓮等[43]研究發(fā)現(xiàn)枸杞酵素在天然發(fā)酵過程中pH 值、可溶性固形物和總糖含量不斷下降，可滴定酸逐漸上升，還原糖先升后降，并鑒定出64 種風(fēng)味物質(zhì)，包括酯類、醛類、種酮類、醇類、酸類、芳香雜環(huán)類。Marisa 等[44]從諾麗酵素中分離出來了歐文氏菌和葡萄糖桿菌，并檢測到有機(jī)酸種類有乙酸，抗壞血酸，脫氫抗壞血酸，半乳糖醛酸，丙二酸，琥珀酸和酒石酸。Ghosh 等[45]研究表明乳酸菌產(chǎn)生的酶類及有機(jī)酸使大米中酚類物質(zhì)溶出并呈游離態(tài)，導(dǎo)致發(fā)酵過程中總酚含量上升。程勇杰等[46]研究發(fā)現(xiàn)柘果酵素在天然發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)含量逐漸上升，在發(fā)酵過程中共含有16 種氨基酸，且含量差異較大。陳小偉等[47]對草莓酵素發(fā)酵過程中氨基酸變化進(jìn)行了分析，總氨基酸含量有明顯上升，其中含量最高的是天冬氨酸和谷氨酸。

以上研究表明，在酵素中含有的營養(yǎng)物質(zhì)、活性成分及各種酶類物質(zhì)確實(shí)極為豐富，酵素原料的不同會導(dǎo)致在各類酵素發(fā)酵過程中相關(guān)代謝產(chǎn)物的變化也不盡相同，發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物的變化與微生物的多樣性和豐富度變化及酵素的保健功能性評價息息相關(guān)，它們之間肯定存在著某種聯(lián)系，如何探索出代謝物質(zhì)的變化與微生物及保健功能之間的關(guān)系或者機(jī)理將是今后科學(xué)研究中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題。

4 微生物酵素的生物活性研究

酵素中富含的營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分使得其具有多種功能特性，但是由于酵素的多種功能作用的屬實(shí)情況一直受到人們的疑惑，因此國內(nèi)外諸多學(xué)者都對其功能效果有很大的研究興趣。

4.1 抗氧化功能研究

由于酵素中總酚、總黃酮及SOD 酶等物質(zhì)的存在，能夠清除機(jī)體內(nèi)自由基，對于酵素的抗氧化性能的研究相對較多，Liao 等[48]利用乳酸菌發(fā)酵芒果汁，發(fā)現(xiàn)芒果汁酵素中的有機(jī)酸種類、酚類化合物等都比芒果原汁有所增加，并且清除DPPH 自由基能力也顯著提高。胡肖利[49]采用電化學(xué)方法研究了中草藥功能酵素復(fù)配前后的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)功能酵素復(fù)配品對羥基自由基、超氧自由基、脂質(zhì)過氧自由基、DPPH 自由基的清除能力顯著提高。馮彥君[50]通過體外模擬試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)麥苗酵素粉及其代餐粉在體外胃消化4 h 后，消化液總酚釋放量分別是初始時的2.74 倍和2.75 倍，SOD 活力分別下降了45.54%和38.99%，但總酚釋放量的增加彌補(bǔ)了SOD 的失活，使得消化液抗氧化性明顯提高。周偏等[51]研究發(fā)現(xiàn)諾麗酵素的總還原能力、DPPH 自由基、ABTS+自由基和羥基自由基清除能力分別高達(dá)0.593、71.22%、76.21%和58.64%。

4.2 降血脂及減肥功效研究

自從酵素產(chǎn)品問世，酵素的降血脂及減肥功效一直被廣泛關(guān)注，為證實(shí)效果到底如何，國內(nèi)外科研學(xué)者也一直致力于驗(yàn)證其降血脂及減肥功效。Wang 等[52]研究表明糙米酵素液能夠降低小鼠血脂水平、肝臟脂肪水平和動脈粥樣硬化指數(shù)，抑制輔酶A 還原酶活性，并有效促進(jìn)總脂質(zhì)與總膽固醇的排泄。郭爽[53]對敖東酵素的減肥功能進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)敖東酵素可以有效抑制大鼠體重增長和脂肪積累。Revilla 等[54]研究表明糙米酵素具有一定的降膽固醇活性。有研究學(xué)者[55-56]發(fā)現(xiàn)糙米酵素能夠改善與Zucker 大鼠肥胖相關(guān)的一些炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到減肥效果。

對于酵素降血脂及減肥功效的機(jī)理研究相對復(fù)雜，相關(guān)研究還未見報道，可能是酵素中脂肪酶將攝入脂肪分解成脂肪酸，增強(qiáng)了機(jī)體吸收效果，再加上微生物作用，達(dá)到降血脂及減肥效果。

4.3 提高免疫力研究

細(xì)胞免疫活性與人類各種疾病密切相關(guān)，查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)酵素產(chǎn)品具有一定的提高免疫力和抗腫瘤活性，為人類健康提供了保障。袁周率[57]的研究發(fā)現(xiàn)，糙米酵素能夠抑制缺氧/復(fù)氧處理誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞調(diào)亡，對其有保護(hù)作用。LU Ming 等[58]的研究表明，一種日本植物酵素能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和延長H22 荷瘤小鼠壽命，具有抗腫瘤特性。Revilla 等[59]研究發(fā)現(xiàn)糙米酵素能夠誘導(dǎo)MOLT-4 細(xì)胞凋亡，并能誘導(dǎo)腫瘤壞死因子（TNF）-α 的表達(dá)對N13 膠質(zhì)細(xì)胞施加免疫活化效果。

4.4 解酒與護(hù)肝功能研究

微生物酵素中的乙醇脫氫酶可以分解乙醇，降低谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和丙二醛等水平，從而達(dá)到解酒護(hù)肝的效果。劉加友[60]針對葛根酵素的解酒功能進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)葛根酵素可以顯著延長小鼠醉酒潛伏時間，縮短醒酒時間，通過減緩胃腸吸收乙醇速度和加速乙醇降解代謝以降低機(jī)體血醇濃度，從而起到解酒防醉的功效。曲佳樂等[61]研究發(fā)現(xiàn)植物酵素可以延遲醉酒和縮短醒酒時間，降低血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平，具有一定解酒護(hù)肝作用。

4.5 抑菌活性研究

微生物酵素產(chǎn)品本身具有抗菌活性，還可以促進(jìn)白血球殺死致病菌，促進(jìn)新細(xì)胞生成，具有一定的抑菌活性。王輝等[62]研究發(fā)現(xiàn)青梅酵素液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抑制作用。董銀卯等[63]研究顯示，膏狀及粉狀酵素對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌有抑制作用，對痤瘡病原菌有明顯的抑制作用。

4.6 美容美白研究

微生物酵素含有的各種酶和一些物質(zhì)能消解老化細(xì)胞，促進(jìn)表皮細(xì)胞新陳代謝，清潔皮膚及去除油脂，使得皮膚細(xì)膩有光澤。Santamaría 等[64]研究發(fā)現(xiàn)糙米酵素能夠阻止角質(zhì)細(xì)胞和表皮細(xì)胞脂質(zhì)氧化，稀釋后有很好的皮膚相容性，表現(xiàn)出4.8±0.3 的防曬系數(shù)。田中清隆等[65]通過細(xì)胞試驗(yàn)和人體試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，李子酵素分解物Clairju 有效抑制了角化細(xì)胞的吞噬作用，顯著降低了皮膚黑素指數(shù)和色斑。

除此之外，還有許多微生物酵素的功能作用，比如改善腸胃功能[66]、治療腹瀉[67]、抗壓與抗疲勞[68]等。綜上所述，對于酵素的功能作用研究非常多，也證實(shí)了酵素的功效，可作為功能性食品供人們食用，從而調(diào)節(jié)人體的相關(guān)代謝，預(yù)防各類相關(guān)疾病的發(fā)生，對人類健康起到積極的作用，且酵素的保健功能研究將一直是我們研究的重點(diǎn)。

5 結(jié)語

國家藥監(jiān)部門審核確認(rèn)酵素完全遵照了“應(yīng)用平安、效果確切、質(zhì)量穩(wěn)定、運(yùn)用便當(dāng)”這四大準(zhǔn)繩，而且微生物酵素富含產(chǎn)酶微生物、多種營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分，也因此具有多種生物活性，酵素食品產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展起來。

目前，微生物酵素在我國已開始盛行，各地科研院所根據(jù)當(dāng)?shù)靥厣称焚Y源逐步研發(fā)酵素產(chǎn)品，以期能將當(dāng)?shù)厥称焚Y源更好地利用起來，開發(fā)出多種功能性食品，推動當(dāng)?shù)厥称樊a(chǎn)業(yè)的發(fā)展。以青藏高原特色植物資源為原料，研發(fā)微生物酵素食品，將豐富青藏高原特色食品資源系列產(chǎn)品，進(jìn)一步推動青海省食品行業(yè)市場經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。