付靖波， 張紅霞， 朱海英

海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部細(xì)胞生物學(xué)教研室，上海 200433

顆粒細(xì)胞(granulosa cells, GCs)是結(jié)構(gòu)以及功能與卵細(xì)胞聯(lián)系最為密切的細(xì)胞，與卵細(xì)胞共同構(gòu)成卵泡，并以卵泡為結(jié)構(gòu)與功能單位，與卵細(xì)胞一同發(fā)育。顆粒細(xì)胞的形態(tài)以及數(shù)目是卵泡分期的重要依據(jù)。

卵泡發(fā)育是一個復(fù)雜而漫長的過程，整個過程受到多種細(xì)胞因子與激素的精細(xì)調(diào)控。這些因素影響卵細(xì)胞及顆粒細(xì)胞分化、增殖以及凋亡。從原始卵泡召集到最終排卵的整個過程中，約有99%的卵泡被淘汰而發(fā)生閉鎖[1]。卵泡的成熟或閉鎖取決于這些信號分子間不同時期的動態(tài)平衡，而顆粒細(xì)胞是這些信號分子影響卵泡發(fā)育的重要“中介”。

1 卵泡發(fā)育過程中顆粒細(xì)胞的凋亡及其意義

顆粒細(xì)胞以旁分泌的形式產(chǎn)生激素并作用于卵細(xì)胞，從而調(diào)控卵細(xì)胞的發(fā)育狀態(tài)；同時也以自分泌的方式調(diào)控自身的分化、增殖及凋亡。另一方面，顆粒細(xì)胞受各種細(xì)胞因子、激素及生長因子的調(diào)控，并通過與卵細(xì)胞的間隙連接將相應(yīng)信號傳遞到卵細(xì)胞中調(diào)控其發(fā)育狀態(tài)。顆粒細(xì)胞在卵泡發(fā)育過程中，同時起產(chǎn)生信號、傳遞信號及接收信號的作用，即顆粒細(xì)胞的發(fā)育狀態(tài)決定了卵泡的命運(yùn)。

作為細(xì)胞自主發(fā)生的一種死亡模式，凋亡在組織發(fā)育、疾病發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。在卵泡發(fā)育過程中，顆粒細(xì)胞凋亡通常被認(rèn)為是卵泡閉鎖的“起因”[2]。有學(xué)者提出“卵泡波”(follicular wave)理論，認(rèn)為卵泡并不是隨機(jī)生長，而是協(xié)調(diào)地按批次進(jìn)行發(fā)育[3]。在排卵間隔期，共發(fā)生2～3次發(fā)育波，期間卵泡必須通過閉鎖有效地去除其他生長的卵泡，以適應(yīng)隨后的卵泡生長波，此時卵泡分化成為優(yōu)勢卵泡及從屬卵泡，只有優(yōu)勢卵泡能進(jìn)一步發(fā)育，為卵細(xì)胞的分裂及后續(xù)受精作準(zhǔn)備。卵泡分化為從屬卵泡過程中，竇腔邊緣顆粒細(xì)胞逐漸凋亡，并引發(fā)后續(xù)一系列的顆粒細(xì)胞功能減退，最終導(dǎo)致卵泡閉鎖。

2 顆粒細(xì)胞凋亡調(diào)控

目前，對于顆粒細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究，主要集中于凋亡相關(guān)的信號通路與凋亡相關(guān)的轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)錄后調(diào)控2個方面。

顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡過程中，涉及以叉形頭轉(zhuǎn)錄因子O(forkhead box O, FOXO)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, BCL-2)及凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)為代表的生存因子，以及以Fas/FasL、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase) 及p53等為代表的凋亡誘導(dǎo)因子，兩類因子相互作用。相關(guān)細(xì)胞內(nèi)信號通路受到卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)、雌二醇、轉(zhuǎn)化生長因子α(transforming growth factor-α, TGF-α)以及干細(xì)胞因子(stem cell factor, SCF)等多種激素、細(xì)胞因子的調(diào)控[4]。激素及各種細(xì)胞因子主要通過結(jié)合顆粒細(xì)胞表面受體，開啟或關(guān)閉各種凋亡通路，實(shí)現(xiàn)對顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控。

2.1 顆粒細(xì)胞的促凋亡調(diào)控 通常認(rèn)為，在顆粒細(xì)胞凋亡過程中，起到最主要作用的是Fas/FasL通路。顆粒細(xì)胞表面Fas表達(dá)水平在促性腺激素水平下降時明顯升高，同時伴隨細(xì)胞周期阻滯及p53表達(dá)升高[5]。Fas被激活后激活其相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(fas-associating protein with a novel death domain, FADD)，誘導(dǎo)caspase-8、細(xì)胞色素C等介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[6]。此外，TNF-α也可促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡。TNF-α相關(guān)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis induced ligand, TRAIL)可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞凋亡，且這一凋亡途徑可被caspase抑制劑阻斷，而TRAIL在人卵巢各時期卵泡的顆粒細(xì)胞中均有表達(dá)[7]，提示TRAIL可能參與TNF-α介導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡以及卵泡閉鎖。

2.2 顆粒細(xì)胞的抗凋亡調(diào)控 PI3K/AKT信號通路在顆粒細(xì)胞抗凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，其主要受到以FSH和胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factors -1, IGF-1) 為代表的多種激素及生長因子的調(diào)控。PI3K/AKT信號通路通過影響FOXO1蛋白質(zhì)的磷酸化，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D2(cyclin D2, CCND2) 及抑制素α(inhibin-α, INHA)等基因的表達(dá)，促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖、分化及生存[8]；而通過影響FOXO3磷酸化，阻止其對下游的Fas配體(FAS ligand, FASLG)及BCL-2樣蛋白11(BCL-2-like protein 11, BCL2L11)的轉(zhuǎn)錄激活作用[9]，進(jìn)而避免顆粒細(xì)胞的凋亡。

FSH作為一種重要的內(nèi)分泌激素，與顆粒細(xì)胞上相應(yīng)受體結(jié)合，促進(jìn)優(yōu)勢卵泡的存活和生長。FSH主要通過刺激顆粒細(xì)胞的增殖、雌二醇分泌和上調(diào)細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白[如X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)和FLICE樣抑制蛋白(FLICE-like inhibitory protein, FLIP)]的表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡。XIAP通過抑制caspase-3、caspase-7 及caspase-9而直接抑制顆粒細(xì)胞凋亡的發(fā)生[10]。FLIP主要通過抑制caspase-8的活性，直接從上游阻斷經(jīng)Fas及TNF-α介導(dǎo)的凋亡途徑[11]。促性腺激素也可以上調(diào)顆粒細(xì)胞中XIAP及人凋亡抑制蛋白-2(human inhibitor of apoptosis protein-2, HIAP-2)的水平，從而發(fā)揮與FSH類似的抗顆粒細(xì)胞凋亡、阻止卵泡閉鎖的作用[12]。

雌二醇作為性腺軸中的關(guān)鍵激素，由顆粒細(xì)胞分泌且可以作用于顆粒細(xì)胞自身。雌二醇在促性腺激素受體表達(dá)及卵泡生長的同時，也可以抑制顆粒細(xì)胞的凋亡。通常認(rèn)為，雌二醇與其受體結(jié)合形成胞內(nèi)復(fù)合物，作用于DNA上的雌激素反應(yīng)元件，通過募集參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的其他因子，抑制p53及BCL-2相關(guān)蛋白X(BCL2-associated X, BAX)表達(dá)，阻止顆粒細(xì)胞的凋亡[13]。同時，雌二醇可以刺激TGF-α表達(dá)，而TGF-α通過促進(jìn)XIAP的表達(dá)來促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖并抑制其凋亡[14]。

此外，SCF在原始卵泡發(fā)育中起到至關(guān)重要的作用。SCF與膜受體c-kit結(jié)合，通過PI3K/AKT等信號途徑，激活BCL-2家族成員，從而抑制顆粒細(xì)胞自噬及凋亡[15]。AKT的激活及FOXO的磷酸化有助于恢復(fù)環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的顆粒細(xì)胞損傷，從而起到對環(huán)磷酰胺生殖毒性的緩解作用[16]。

總之，顆粒細(xì)胞凋亡的發(fā)生主要與促性腺激素以及FSH等激素水平的降低有關(guān)。這些激素缺乏會導(dǎo)致Fas激活及TNF-α等細(xì)胞因子介導(dǎo)的TRAIL表達(dá)增加，從而引起細(xì)胞內(nèi)以caspase為主要途徑的細(xì)胞凋亡。而雌激素、FSH及抑制素等可以發(fā)揮抑制顆粒細(xì)胞凋亡及促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖的作用。雌激素、FSH等一方面通過激活PI3K/AKT信號通路，影響下游FOXO蛋白的磷酸化，間接抑制凋亡，另一方面通過抑制p53及BAX等基因的表達(dá)而直接抑制顆粒細(xì)胞凋亡。

3 顆粒細(xì)胞凋亡的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

近幾十年來對于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的研究，尤其是miRNA研究的快速發(fā)展，為生殖系統(tǒng)疾病研究帶來了新的切入點(diǎn)。miRNAs 是一類內(nèi)源性的短非編碼單鏈RNA，一般長度為18～24個核苷酸[17]。大多數(shù)mRNA轉(zhuǎn)錄物的成熟序列包含miRNA反應(yīng)元件(miRNA response elements, MRE)，這提示miRNA在機(jī)體發(fā)育及生理病理過程中都起著關(guān)鍵作用[17]。目前證明，在哺乳動物卵泡形成和閉鎖過程中，內(nèi)源以及外源miRNA通過廣泛參與轉(zhuǎn)錄后mRNA水平調(diào)控，在卵泡和黃體發(fā)育、卵巢功能[18]及卵巢疾病發(fā)生中[19]發(fā)揮關(guān)鍵作用。

其中，miR-1275最早被發(fā)現(xiàn)在癌癥中能調(diào)控胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白(insulin-like growth factor-2 mRNA-binding proteins, IGF2BP)的表達(dá)，最近研究證明miR-1275可通過靶向肝受體同源物1(liver receptor homologue-1, LRH1)影響雌二醇合成并導(dǎo)致GCs凋亡[20]。

Let-7(lethal-7)家族是最早發(fā)現(xiàn)的miRNAs之一，其功能包括促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化，組織發(fā)育和腫瘤抑制。最近發(fā)現(xiàn)，let-7家族成員在豬卵泡閉鎖過程中差異表達(dá)。let-7a、let-7b、let-7c和let-7i的表達(dá)水平在早期卵泡和進(jìn)行性閉鎖卵泡中表達(dá)明顯低于正常發(fā)育的卵泡，而let7-g在卵泡閉鎖過程中高水平表達(dá)[21]。這表明let-7 miRNA家族組成了顆粒細(xì)胞凋亡的雙向調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。與健康女性相比，早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)患者的let-7c下調(diào)[22]。

此外，miR-23a和miR-27a通過靶向SMAD5(drosophila mothers against decapentaplegic protein-5)促進(jìn)人類顆粒細(xì)胞凋亡，而miR-92a、miR-181b和miR-182通過直接與SMAD7結(jié)合拮抗TGF-β而抑制細(xì)胞凋亡[17]。在POI患者中，miR-23a和miR-27a上調(diào)[22]。也有研究[23]表明，miR-23a和miR-27a直接靶向SMAD5后，通過Fas/FasL途徑促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡。

4 顆粒細(xì)胞凋亡與女性生殖功能下降的關(guān)系

目前普遍認(rèn)為，大量顆粒細(xì)胞凋亡是卵細(xì)胞數(shù)目、受精能力下降的重要原因，凋亡顆粒細(xì)胞的比例也與體外受精的成功率負(fù)相關(guān)[24]。而大多數(shù)引起女性生殖功能異常的疾病，如脆性X染色體綜合征(fragile-X premutation，F(xiàn)XPM)、POI、子宮內(nèi)膜異位癥及多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome, PCOS)等，均與顆粒細(xì)胞損傷有密切關(guān)系。在FXPM小鼠模型中，顆粒細(xì)胞因線粒體數(shù)目減少而功能異常，是造成雌性小鼠排卵數(shù)目減少及胚胎發(fā)育異常的重要原因[25]。

POI是指40歲之前卵巢功能停止，其發(fā)生受到自身免疫、遺傳及化療藥物等多種因素的影響[26]。而POI與顆粒細(xì)胞的功能下降有關(guān)，主要表現(xiàn)為患者血清中抗米勒管激素(anti-Müllerian hormone, AMH)的水平下降[27]。而暴露于已知會引起氧化應(yīng)激(OS)的環(huán)境，或應(yīng)用γ輻射、化療藥物或多環(huán)芳烴(如環(huán)磷酰胺、二甲基苯)等藥物，能激活顆粒細(xì)胞促凋亡信號，導(dǎo)致原始卵泡快速喪失，導(dǎo)致POI[28]。PCOS患者顆粒細(xì)胞的凋亡比例也明顯升高，且凋亡的顆粒細(xì)胞中8-羥基-2-脫氧鳥苷明顯升高，提示OS是誘導(dǎo)PCOS患者顆粒細(xì)胞凋亡的重要原因[29]。此外，OS可能是子宮內(nèi)膜異位患者生殖能力下降的因素之一。

顆粒細(xì)胞凋亡是OS影響卵細(xì)胞功能及胚胎發(fā)育的關(guān)鍵因素，在多種生殖功能障礙中扮演重要角色。其中，谷胱甘肽的消耗是導(dǎo)致體內(nèi)竇卵泡閉鎖和體外培養(yǎng)的竇卵泡中顆粒細(xì)胞凋亡的重要原因[28]。

5 小結(jié)與展望

隨著對激素作用、細(xì)胞內(nèi)信號通路、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的研究，目前人們對顆粒細(xì)胞在卵泡發(fā)育中的重要作用、顆粒細(xì)胞狀態(tài)對卵細(xì)胞功能及胚胎發(fā)育影響的認(rèn)識正在不斷深入，逐漸由宏觀的病理組胚層面向更加精細(xì)的基因表達(dá)調(diào)控層面發(fā)展。對于相關(guān)激素在顆粒細(xì)胞凋亡中的作用，可以結(jié)合信號通路及miRNA等轉(zhuǎn)錄后調(diào)控進(jìn)行分析，這有助于全新的生殖細(xì)胞發(fā)育調(diào)控圖譜的發(fā)現(xiàn)。然而，如何通過干預(yù)信號通路來治療疾病，仍需深入研究。例如，目前發(fā)現(xiàn)的POI相關(guān)的大量miRNA為該疾病的早期診斷提供了更多元的選擇，但這些標(biāo)志物的靈敏度以及特異度仍需要大量臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

隨著卵泡波理論的提出，對卵泡發(fā)育過程的整體化和連續(xù)化的認(rèn)識也日益深入。然而，目前對優(yōu)勢卵泡選擇所涉及的信號通路及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識仍不足。同時，顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡閉鎖的因果關(guān)系仍有爭議。此外，顆粒細(xì)胞及卵細(xì)胞之間的跨區(qū)投影(transzonal projections, TZPs)起結(jié)構(gòu)連接、物質(zhì)傳遞及信號交流的作用，是形成卵泡最基本和最重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及功能單位，而TZPs是否在顆粒細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用也無定論。雖然目前依靠相應(yīng)動物模型，對顆粒細(xì)胞凋亡機(jī)制認(rèn)識不斷加深，但仍需結(jié)合臨床，探究人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡與疾病發(fā)生的關(guān)系，從而為臨床上卵細(xì)胞功能評價、胚胎發(fā)育預(yù)測及生殖障礙相關(guān)疾病的治療提供全新的方法與思路。