楊 輝，馬 亮，叢 笑，劉 倩，于 洋

（中日友好醫(yī)院 檢驗科，北京 100029）

以聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）為基礎(chǔ)的核酸檢測方法特異、敏感，在病原微生物診斷領(lǐng)域應(yīng)用極廣[1~3]。 丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）RNA定量檢測適用于HCV 現(xiàn)癥感染的確認、 抗病毒治療前基線病毒載量分析以及抗病毒治療過程中、治療結(jié)束后的應(yīng)答評估[4，5]。

丙型肝炎治療過程中的監(jiān)測與方案調(diào)整，在不同程度上依賴HCV RNA 定量結(jié)果的穩(wěn)定性。 我國臨床使用的HCV RNA 定量法， 針對同一批擴增曲線采用不同的分析方法對定量結(jié)果影響的研究很少。 在實際操作中，閾值法與二階求導(dǎo)法容易混淆使用。為了解閾值法與二階求導(dǎo)法對HCV-RNA 定量（外標法）精密度的影響，我們利用臨床樣本通過Light Cycler480Ⅱ檢測系統(tǒng)對2 種分析法進行了比較。

1 資料和方法

1.1 樣本來源

6 例HCV 陽性的RNA 樣本，來自中日友好醫(yī)院2018年11~12月醫(yī)囑為HCV-RNA 檢測的臨床樣本。

核對采血管，溶血、乳糜、黃疸者未納入分析。 留樣當日提取核酸，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器

HCV-RNA 提取與擴增試劑盒購自中山大學(xué)達安公司，Smart32 核酸提取儀購自中山大學(xué)達安公司，LightCycler480Ⅱ核酸擴增儀購自瑞士羅氏公司。

1.3 方法

HCV-RNA 提取和擴增檢測按廠家說明書進行（為減少影響因素，未添加內(nèi)參模板）。 PCR 反應(yīng)體系50μl，其中含酶擴增液30μl，核酸上樣量20μl。 PCR 循環(huán)參數(shù)：UNG酶50℃處理15min，95℃預(yù)變性15min，94℃變性10s，55℃延伸45s，共反應(yīng)45個循環(huán)，每個循環(huán)延伸時讀取熒光信號，定量標準品分析使用外標法。

為方便敘述，參考文獻[6]，全文用“Ct 法”對應(yīng)“閾值法”，分析采用“abs/Fit point”模式，用“Cp 法”對應(yīng)“二階求導(dǎo)法”，分析采用“abs/2nd Derivative Max”模式。

1.3.1 重復(fù)性檢測

取6 例陽性核酸制成中等濃度的混合樣本，同一實驗批次重復(fù)25 次檢測， 即一個樣本獲得25 條擴增曲線，擴增曲線先后采用Ct 法和Cp 法進行分析， 平行檢測標準品，利用標準曲線計算核酸濃度，并比較二者CV 值差異。

1.3.2 統(tǒng)計分析

采用SPSS 10.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的正態(tài)性分析和配對t 檢驗分析。

2 結(jié)果

混合樣本重復(fù)檢測25 次，擴增曲線先后采用Ct 法和Cp 法進行分析， 計算核酸濃度和組內(nèi)變異系數(shù)CV 值，閾值法CV 為23.12%，二階求導(dǎo)法CV 為7.75%；采用SPSS 10.0 統(tǒng)計，2組濃度值均呈正態(tài)性分布；應(yīng)用配對t 檢驗，2組值存在統(tǒng)計學(xué)顯著差異（P=0.008）；與Ct 法分析比較，Cp 法分析得到的定量濃度的重現(xiàn)性更好（見圖1）。

3 討論

閾值法和二階求導(dǎo)法廣泛應(yīng)用于real-time PCR 熒光定量（外標法）檢測。 閾值選擇與群體特征有關(guān)，要綜合考慮所有陽性曲線的形狀；擴增曲線連續(xù)二階求導(dǎo)，最大值對應(yīng)的循環(huán)數(shù)，近似指數(shù)擴增期的終點[7]，是唯一值，與其他擴增曲線無關(guān)。所以，從數(shù)據(jù)的獲得過程來說，二階求導(dǎo)法獲得的Cp 值要比閾值法獲得的Ct 值更為穩(wěn)定。

real-time PCR 熒光檢測的定量模型能放大檢測誤差。它的定量原理為lgC=K*Ct+B，是一個能變形為指數(shù)函數(shù)的對數(shù)模型。 模型的輸入數(shù)據(jù)為Ct 值，輸出數(shù)據(jù)為核酸濃度C。 通過這個定量模型，Ct 值的絕對誤差被轉(zhuǎn)換成核酸濃度C 的相對誤差。 Ct 值與真值相差1個單位，核酸濃度C與真值就可能相差1 倍，輸入數(shù)據(jù)的誤差被顯著放大。 因此， 控制好輸入數(shù)據(jù)Ct 值的穩(wěn)定性將獲得明顯的精密度收益。 減少模型輸入數(shù)據(jù)的變異系數(shù)，如使用二階求導(dǎo)法取代閾值法可以減少核酸濃度的定量誤差。 所以，我們認為， 使用real-time PCR 技術(shù)定量監(jiān)測丙肝患者的病毒載量變化時，優(yōu)先選用精密度較高的二階求導(dǎo)法，其數(shù)據(jù)更為客觀。