李婷 范云帆 付英梅

細(xì)胞外RNA(extracellular RNA，exRNA)指存在細(xì)胞外的所有RNA，包括轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(transfer RNA，tRNA)、核糖體RNA(ribosome RNA，rRNA)、信使RNA(messenger RNA，mRNA)以及各類非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)[1-2]。目前發(fā)現(xiàn)的exRNA主要位于胞外囊泡中，也有部分以核糖核蛋白和脂蛋白結(jié)合的形式存在。在真核生物與原核生物細(xì)胞中均能觀察到exRNA的包裝和釋放現(xiàn)象。人體中exRNA由多種細(xì)胞產(chǎn)生，在不同疾病中顯示出差異性表達(dá)，所以有作為生物標(biāo)志物的潛力[3-4]。此外，借助胞外囊泡的靶向作用，exRNA在靶向治療的研究和應(yīng)用上具有廣闊的前景[5-6]。

近幾年發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌也能產(chǎn)生exRNA，這一過程與細(xì)菌分泌系統(tǒng)和宿主靶細(xì)胞外泌體密切相關(guān)。結(jié)核分枝桿菌的exRNA可影響宿主細(xì)胞免疫功能，從而對結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。并且，在感染結(jié)核分枝桿菌后，細(xì)菌exRNA可以被轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主外周血和體液中，所以在篩選微創(chuàng)或無創(chuàng)生物標(biāo)志物方面蘊(yùn)藏著巨大的潛能。

一、 結(jié)核分枝桿菌exRNA的發(fā)現(xiàn)

20世紀(jì)70年代，人們就已在人淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞釋放的核蛋白復(fù)合物中存在RNA，并且認(rèn)為這一過程是活細(xì)胞主動(dòng)分泌而非細(xì)胞死亡裂解釋放的[7]。早期對exRNA研究主要關(guān)注人類外周血和其他體液中人體基因組來源的exRNA[8-9]。近幾年，研究人員開始探討人體內(nèi)共生或寄生的其他生物的基因組來源的exRNA，包括寄生蟲、真菌、細(xì)菌產(chǎn)生的exRNA。

2012年，Obregón-Henao等[10]收集了結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液，進(jìn)一步用化學(xué)方法提取其中的RNA成分，并使用基因克隆技術(shù)和BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析確認(rèn)了這些exRNA的長度和種類，這是研究者首次發(fā)現(xiàn)并證明了結(jié)核分枝桿菌exRNA的存在。作者發(fā)現(xiàn)這些exRNA在細(xì)菌培養(yǎng)的對數(shù)生長早期開始積累，長度在30～70堿基之間，以tRNA和rRNA為主。

隨著深度測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，所發(fā)現(xiàn)的結(jié)核分枝桿菌exRNA的分子類型也不斷增多。2015年，Singh等[11]結(jié)合深度測序技術(shù)，在結(jié)核分枝桿菌感染的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的外泌體中，發(fā)現(xiàn)了14種結(jié)核分枝桿菌的mRNA，例如Rv3809c、 Rv3533和Rv0243等。隨后，其他研究者又陸續(xù)在人外周血中發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌的exRNA。2017年，Lv等[12]利用深度測序技術(shù)在人血清的外泌體中檢測到結(jié)核分枝桿菌的rRNA和mRNA。通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法也可在人血漿游離RNA中檢測到結(jié)核分枝桿菌小RNA(small RNA，sRNA)產(chǎn)物[13]。2019年，結(jié)核分枝桿菌來源的微小RNA(microRNA，miRNA)也在血清游離RNA中檢測到[14]。

目前，已發(fā)現(xiàn)的結(jié)核分枝桿菌exRNA包括tRNA、rRNA、mRNA、sRNA和miRNA，這些RNA常以片段形式存在，長度在20～300堿基不等[10-15]。這表明多種類型的結(jié)核分枝桿菌RNA片段均可釋放到細(xì)胞外。

二、 結(jié)核分枝桿菌exRNA的產(chǎn)生途徑及機(jī)制

目前已發(fā)現(xiàn)的結(jié)核分枝桿菌exRNA的產(chǎn)生途徑主要與胞外囊泡相關(guān)。細(xì)胞外囊泡是由細(xì)胞衍生的釋放到外環(huán)境中的多種膜性囊泡的統(tǒng)稱，在生物界中普遍存在。在原核生物中，革蘭陰性菌產(chǎn)生的胞外囊泡源自外膜，因此通常稱為外膜囊泡[16]。而革蘭陽性菌、真菌以及分枝桿菌因存在厚細(xì)胞壁，對囊泡的產(chǎn)生機(jī)制還不清楚，這類原核生物產(chǎn)生的膜性囊泡依舊統(tǒng)稱為胞外囊泡[17]。在真核生物中，依據(jù)產(chǎn)生的機(jī)制不同，胞外囊泡又可大致分為外泌體和微囊泡[18]。有關(guān)外泌體和微囊泡的生物學(xué)知識(shí)，van Niel等[18]已做出詳細(xì)的介紹，此處不再贅述。

細(xì)菌胞外囊泡在exRNA的包裝和分泌過程中起作用已在多種細(xì)菌中得到驗(yàn)證[19-21]。Dauros等[22]也在恥垢分枝桿菌的胞外囊泡中鑒定了RNA的存在。結(jié)核分枝桿菌能產(chǎn)生富含脂類、糖類和蛋白質(zhì)成分的胞外囊泡[23-24]，并且分泌至培養(yǎng)濾液中RNA的含量與濾液中的蛋白含量呈正相關(guān)[10]。所以，筆者推測，在結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)基濾液中所檢測到的exRNA很可能也是經(jīng)細(xì)菌的胞外囊泡所包裝和分泌。但目前為止，對結(jié)核分枝桿菌胞外囊泡中exRNA的鑒定，還沒有明確的報(bào)道。

在感染宿主靶細(xì)胞后，作為兼性胞內(nèi)寄生菌，結(jié)核分枝桿菌的exRNA主要通過宿主靶細(xì)胞的外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外[11,25]。雖然目前對于這一過程中exRNA的包裝、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和釋放等機(jī)制還知之甚少，但最近有報(bào)道顯示，結(jié)核分枝桿菌分泌系統(tǒng)中的替代型分泌系統(tǒng)(accessory Sec system，SecA2)可能參與感染細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌exRNA的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程。SecA2對結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生長必不可少，它能通過影響v-ATPase來抑制吞噬體的酸化過程，阻止吞噬溶酶體的成熟[26]。2018年，Cheng和Schorey[15]發(fā)現(xiàn)SecA2介導(dǎo)H37Rv結(jié)核分枝桿菌RNA從菌體內(nèi)釋放到外環(huán)境的過程。在培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌時(shí)， SecA2功能缺失導(dǎo)致細(xì)菌培養(yǎng)濾液中exRNA表達(dá)消失，而在SecA2功能補(bǔ)充菌株的培養(yǎng)濾液中，結(jié)核分枝桿菌的exRNA的表達(dá)量恢復(fù)至野生型H37Rv水平。并且，作者發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌進(jìn)入巨噬細(xì)胞后，SecA2對exRNA的釋放仍然起作用。結(jié)核分桿菌被巨噬細(xì)胞吞噬后，進(jìn)入吞噬體，細(xì)菌在SecA2的介導(dǎo)下將細(xì)菌RNA釋放到吞噬體中，接著在結(jié)核分枝桿菌 ESAT-6分泌系統(tǒng)1(ESAT-6 secretion system-1，ESX-1)的參與下，將細(xì)菌exRNA從吞噬體內(nèi)分泌至巨噬細(xì)胞胞質(zhì)中。

分泌到細(xì)胞質(zhì)的結(jié)核分枝桿菌exRNA如何包裝至外泌體的機(jī)制還不了解。不過，在SecA2缺失時(shí)，被結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞的外泌體中細(xì)菌exRNA顯著下降[25]。這可能與巨噬細(xì)胞外泌體的生成有關(guān)。細(xì)胞內(nèi)多囊泡體與質(zhì)膜融合，將其腔內(nèi)囊泡釋放到細(xì)胞外而形成外泌體[27]。在外泌體的形成過程中，細(xì)胞質(zhì)中的一些成分被隔離在囊泡中，包括蛋白、脂質(zhì)以及核酸類物質(zhì)[28-30]。所以可推測，當(dāng)SecA2缺失時(shí)，因結(jié)核分枝桿菌的RNA不能釋放到細(xì)菌細(xì)胞外，使巨噬細(xì)胞的胞質(zhì)中結(jié)核分枝桿菌的exRNA表達(dá)降低，最終導(dǎo)致被包裝到巨噬細(xì)胞外泌體的細(xì)菌exRNA表達(dá)減少。

除了在體外感染實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了感染細(xì)胞外泌體中含有結(jié)核分枝桿菌 exRNA，在對結(jié)核病患者血漿外泌體的深度測序研究中也發(fā)現(xiàn)了結(jié)核分枝桿菌來源的exRNA[12]，提示在感染后，結(jié)核分枝桿菌的RNA可能通過宿主細(xì)胞外泌體的途徑，被轉(zhuǎn)運(yùn)到外周血中。

三、 結(jié)核分枝桿菌exRNA對宿主細(xì)胞的影響

在感染的靶細(xì)胞中，結(jié)核分枝桿菌可直接將其RNA分泌到宿主細(xì)胞的胞質(zhì)中，也可通過被感染細(xì)胞的外泌體，將細(xì)菌exRNA轉(zhuǎn)運(yùn)到臨近或遠(yuǎn)離的未感染細(xì)胞中，從而發(fā)揮生物效應(yīng)。這些病原體RNA可以作為“病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns， PAMP)”被宿主細(xì)胞中的胞質(zhì)RNA傳感器識(shí)別，最終調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)[31-32]。

干擾素(IFN)-β是Ⅰ型干擾素中的一員，結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)IFN-β是激活先天免疫的重要步驟。之前研究報(bào)道結(jié)核分枝桿菌的DNA觸發(fā)IFN-β的產(chǎn)生[33-34]。最近發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌exRNA可以作為PAMP被胞質(zhì)RNA傳感器視維甲酸誘導(dǎo)基因蛋白I(retinoic acid-inducible gene I， RIG-I)識(shí)別，在RNA傳感通路線粒體抗病毒信號(hào)蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein， MAVS)和TANK結(jié)合激酶1的作用下，使干擾素調(diào)節(jié)因子7(interferon regulatory factor 7，IRF7)磷酸化，被磷酸化的IRF7形成同二聚體進(jìn)入細(xì)胞核中促進(jìn)IFN-β mRNA表達(dá)，最終使巨噬細(xì)胞中IFN-β蛋白的表達(dá)增多，從而驅(qū)動(dòng)宿主的免疫反應(yīng)[15， 25]。另一方面，巨噬細(xì)胞外泌體中的結(jié)核分枝桿菌exRNA可以通過RIG-I/MAVS途徑促進(jìn)骨髓來源巨噬細(xì)胞中吞噬體成熟，從而抑制結(jié)核分枝桿菌的生長[25]。這表明與靶細(xì)胞外泌體相關(guān)的結(jié)核分枝桿菌RNA有利于靶細(xì)胞的抗菌反應(yīng)。

結(jié)核分枝桿菌exRNA也可以引起宿主細(xì)胞凋亡。研究者發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液中的exRNA可以通過不依賴于TNF-α的caspase8信號(hào)機(jī)制損傷細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10]。結(jié)核分枝桿菌的外泌體exRNA轉(zhuǎn)染至幼稚巨噬細(xì)胞后，可使細(xì)胞內(nèi)的磷脂酰絲氨酸水平升高[11]。磷脂酰絲氨酸暴露增加與細(xì)胞凋亡的早期事件有關(guān)，提示外泌體exRNA可以誘導(dǎo)受體細(xì)胞凋亡的可能性[11]。巨噬細(xì)胞的凋亡不利于結(jié)核分枝桿菌生長和繁殖環(huán)境的形成，可引起細(xì)菌的清除，從而發(fā)揮內(nèi)在保護(hù)作用[35]。這可能為結(jié)核病的治療提供新的見解。

近期，Chakrabarty等[14]在人外周血中檢測到結(jié)核分枝桿菌exRNA，通過生物分析預(yù)測了這些exRNA的靶基因及其功能，發(fā)現(xiàn)這些exRNA與宿主細(xì)胞的周期、凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、mRNA加工、脂質(zhì)代謝、細(xì)胞間通訊有關(guān)。提示結(jié)核分枝桿菌exRNA可能在影響宿主細(xì)胞功能上發(fā)揮多種作用。但是，目前exRNA功能性的研究僅在體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證，對于存在于人體內(nèi)exRNA的功能還有待考究。

四、 結(jié)核分枝桿菌exRNA在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

近幾年，外周血或其他體液中來源于細(xì)菌的exRNA能否作為感染性疾病的診斷標(biāo)志物引起了研究者的極大興趣。2017年，Lv等[12]在對健康個(gè)體、潛伏性結(jié)核感染者和活動(dòng)性結(jié)核病患者的血清外泌體測序中發(fā)現(xiàn)，在潛伏性結(jié)核感染者血清外泌體中檢測到種類遠(yuǎn)超其余兩組的結(jié)核分枝桿菌RNA。證明在結(jié)核分枝桿菌不同感染狀態(tài)的人群中，血漿樣本中來源于病原體的exRNA具有明顯差異。對血清樣本直接提取總RNA并測序后也發(fā)現(xiàn)，在結(jié)核病患者血清中檢測到6個(gè)結(jié)核分枝桿菌來源的miRNA(MTBmiR1～6)，其中MTBmiR5在診斷肺結(jié)核患者時(shí)，敏感度為100.00%，特異度為90.91%[14]。另一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)，使用RT-PCR的方法檢測活動(dòng)性結(jié)核患者和健康人血漿中的結(jié)核分枝桿菌特異性sRNA，發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌的sRNA ASdes在兩組間的檢出率分別為55.56%和25.00%[13]。這證明了外周血中來源于病原體的exRNA在診斷感染性疾病中的巨大潛力，對利用這些差異表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌RNA診斷結(jié)核病患者提供了理論依據(jù)。

mRNA作為疫苗，不僅肌內(nèi)注射后可在局部肌細(xì)胞內(nèi)翻譯相應(yīng)的蛋白質(zhì)[36]，也可皮內(nèi)注射后，在接種部位刺激產(chǎn)生趨化因子和細(xì)胞因子，從而促進(jìn)機(jī)體免疫系統(tǒng)的激活[37]。細(xì)菌來源的mRNA也可作為疫苗，誘導(dǎo)宿主對細(xì)菌的免疫應(yīng)答，為小鼠提供部分保護(hù)作用[38]。攜帶有結(jié)核分枝桿菌exRNA的巨噬細(xì)胞外泌體可以限制結(jié)核分枝桿菌在宿主細(xì)胞中的復(fù)制，與莫西沙星合用后，可協(xié)同降低巨噬細(xì)胞內(nèi)和小鼠體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的存活率[25]。這為結(jié)核分枝桿菌exRNA的疫苗研發(fā)及在治療方面的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，并等待進(jìn)一步的發(fā)掘。

五、 展望

近幾年，exRNA的生成機(jī)制、生物學(xué)功能及作為疾病生物標(biāo)志物的研究日益得到人們的關(guān)注，并取得一定的進(jìn)展。美國國立衛(wèi)生研究院也發(fā)起了細(xì)胞外RNA通訊聯(lián)盟(Extracellular RNA Communication Consortium，ERCC)，致力于了解exRNA生物學(xué)功能及特性，并加快發(fā)展exRNA的研究和應(yīng)用，將其作為潛在的治療方法和診斷方法。目前結(jié)核分枝桿菌的exRNA研究尚處于起步階段，關(guān)于其產(chǎn)生機(jī)制、生物學(xué)功能及其在臨床醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用還需做進(jìn)一步探索。隨著對結(jié)核分枝桿exRNA的研究進(jìn)一步加深，或許可以為結(jié)核分枝桿菌感染的診斷、治療及預(yù)后評價(jià)提供新的思路。