張亦琳，延 永，田小龍

商洛學院生物醫(yī)藥與食品工程學院，商洛 726000

中醫(yī)是人類智慧的結(jié)晶，為中華民族的繁榮發(fā)展做出了卓越的貢獻，但中藥發(fā)展面臨的諸多問題阻礙了中醫(yī)現(xiàn)代化進程[1]。比如，水質(zhì)對中藥湯劑的藥效會產(chǎn)生顯著影響。李時珍在《本草綱目》中記載不同的水(雨水、泉水、井水等)因水質(zhì)硬度不同(Ca2+和Mg2+含量不同)對療效有巨大影響。莫國軒[2]指出金屬離子對藥物療效有重要影響，藥物的有效成分與離子發(fā)生作用，可提高療效或者增加毒性，使藥物原有的藥物療效發(fā)生改變，比如強心苷類藥物會與機體中的鉀離子作用，導致中毒癥狀，而Mg2+則可降低其毒性[3]；藥物分子與Fe3+結(jié)合使其含量降低會導致疲勞、免疫力下降等癥狀[4]。鑒于金屬離子對藥物有效成份的重要作用，對于植物有效成份的提取應充分考慮水質(zhì)(離子含量)對提取物活性的影響，令人遺憾的是，目前該領域的研究尚待開拓。

紅薯葉為旋花科植物紅薯Ipomoeabatatas(L.)Lam成熟后地上秧莖頂端的嫩葉，素有“蔬菜皇后”、“抗癌蔬菜”、“長壽蔬菜”等美譽[5]。紅薯葉作為紅、薯生產(chǎn)的副產(chǎn)品，它富含生物活性成份，具有極高的保健作用和藥用價值[6]，研究表明紅薯葉黃酮可提高機體免疫能力[7]，促進新陳代謝[8]，還可以降低血清含糖量[9]，暢通大小便、預防各類動脈硬化和細胞發(fā)生癌變[10]、緩解眼疲勞和補充維生素A等[11]，其提取物還可被開發(fā)為面膜[12]等護膚產(chǎn)品，紅薯葉總黃酮的提取和生物活性研究一直是關注的熱點[13]。

本研究考察了自然界水中含量最多的Ca2+和Mg2+對紅薯葉總黃酮提取和抑菌活性的影響。通過單因素和響應面優(yōu)化方法獲得紅薯葉的提取過程中引入Ca2+和Mg2+的最佳工藝，得到引入Ca2+和Mg2+的紅薯葉總黃酮提取物，探索Ca2+和Mg2+對紅薯葉總黃酮類化合物提取和抑菌活性的影響，為研究硬水中常見Ca2+和Mg2+對植物資源開發(fā)利用的影響提供新的思路和建立理論基礎。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

紅薯葉采摘于商洛學院試驗田。

無水乙醇(分析純，利安隆博華醫(yī)藥化學有限公司)，亞硝酸鈉、硝酸鋁、水合氯化鎂、氫氧化鈉、無水氯化鈣(分析純，天津科密歐化學試劑有限公司)，蘆丁標準品(中國藥品生物制品研究所，純度95%)，MH培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司)，紅四氮唑(天津志遠科技有限公司)，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(商洛學院微生物實驗室)。

1.2 實驗儀器

數(shù)顯恒溫水浴鍋HH- 4型(邦西儀器科技上海有限公司)、紫外分光光度計UV- 225型(大連市儀器制造公司)、電子天平S- 114型(丹佛儀器北京有限公司)、電熱恒溫鼓風干燥箱DHG- 9123A型(上海齊欣科學儀器有限公司)、高壓蒸汽滅菌鍋MLS- 3780型(上海鼎謙生物科技有限公司)、恒溫振蕩器ZD- 85型(常州智博瑞儀器制造有限公司)。

2 實驗方法

2.1 蘆丁標準曲線的繪制

稱取蘆丁標準品0.050 2 g于潔凈燒杯中，以20 mL 70%乙醇微熱至溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，加水定容后，得到質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL蘆丁標準品溶液。移取該溶液10 mL于100 mL容量瓶中，加水定容后取0、1、2、3、4、5、6 mL稀釋液分別置于25 mL容量瓶中，依次加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，待反應6 min后加10%硝酸鋁1 mL，6 min后加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，加水至刻度，15 min后于510 nm下測定吸光度值(A)。以蘆丁標品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為Y=9.941 8X+0.002 6 (R2=0.996 4)。

2.2 總黃酮含量測定及提取率計算

取1 mL提取液，按2.1方法處理后于510 nm處測定吸光度(A)，通過標準曲線計算出提取液質(zhì)量濃度，再通過公式(1)計算總黃酮提取率。

(1)

式中，Y為總黃酮的提取率(%)；c為濃度(mg/mL)；N為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積(mL)；W為藥材粉末的質(zhì)量(mg)。

2.3 單因素試驗

稱取干燥紅薯葉粉末1.0 g，置于100 mL圓底燒瓶中，加入Ca2+濃度分別為125、150、175、200、225 mg/L，Mg2+濃度為200 mg/L的60%乙醇溶液30 mL，在60 ℃下加熱攪拌2 h，測試Ca2+濃度對總黃酮提取率的影響；加入Mg2+濃度分別為125、150、175、200、225 mg/L，Ca2+濃度為200 mg/L的60%乙醇溶液30 mL，在60 ℃下加熱攪拌2 h，檢測Mg2+濃度對總黃酮提取率的影響；加入Ca2+和Mg2+濃度為200 mg/L的40%、50%、60%、70%、80%乙醇溶液各30 mL，在60 ℃水浴中下提取2 h，測試乙醇濃度對總黃酮提取率的影響；加入Ca2+和Mg2+濃度為200 mg/L的60%乙醇溶液30 mL，在60 ℃條件下，分別提取0.5、1、1.5、2、2.5 h，測試提取時間對總黃酮提取率的影響；加入Ca2+和Mg2+濃度為200 mg/L的60%乙醇溶液，料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，并在水浴溫度60 ℃下，提取2 h，測試料液比對總黃酮提取率的影響。待體系冷卻后過濾，將濾液轉(zhuǎn)移置50 mL容量瓶，加水至刻度，取1 mL置于25 mL容量瓶中，按2.1方法處理后測定吸光度值(A)，計算總黃酮提取率。

2.4 響應面試驗設計

根據(jù)單因素實驗結(jié)果篩選出四個影響最顯著的因素以及三組最佳水平，利用Design- Expert 8.0.6 Trial中Box- Behnken試驗設計，以提取物總黃酮含量為考察指標，優(yōu)化出包含有Ca2+和Mg2+的紅薯葉總黃酮提取最佳工藝。因素水平設計如表1。

2.5 驗證性實驗及浸膏制作

對模型模擬得出的最優(yōu)工藝進行三組平行實驗，以驗證響應面實驗的準確性與吻合度。浸膏制作采用醇溶性浸出物的熱浸法[14]。量取提取液25 mL置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，移至干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定重量，計算，即得總浸膏得率。

表1 因素水平表

2.6 抑菌活性研究

待測液配置：稱取所得浸膏1 154.72 mg置于50錐形瓶，去離子水(50 mL)溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，去離子水定容，得到總黃酮濃度為2 000 μg/mL的藥液。溶液中Ca2+和Mg2+濃度分別為542.4和510.8 μg/mL。以此濃度標準配置對照品1(總黃酮濃度為2 000 μg/mL)、對照品2(總黃酮濃度為2 000 μg/mL，后加入Ca2+和Mg2+且濃度分別為542.4、510.8 μg/mL)、對照品3(Ca2+濃度為542.4 μg/mL溶液)、對照品4(Mg2+濃度510.8 μg/mL溶液)、對照品5(Ca2+和Mg2+且濃度分別為542.4和510.8 μg/mL溶液)。

MH培養(yǎng)基的制備[15]，菌種活化[16]、菌懸液的配制[17]參考文獻方法。采用二倍稀釋法[18]，在96孔板第1孔中加入160 μL含有紅四氮唑的MH培養(yǎng)基，然后分別加入40 μL對應的6種待測液(藥液、對照品1、對照品2、對照品3、對照品4、對照品5)，第2～11孔中加入紅四氮唑培養(yǎng)基100 μL，第12孔加200 μL作為陰性對照，然后于第1孔吸取100 μL置第2孔，于第2孔中吸取100 μL于第三孔，以此類推至第11孔時，多余100 μL溶液棄去，使藥液稀釋成為二倍系列稀釋濃度，然后依次加入三種已經(jīng)稀釋好的菌液100 μL，無菌條件下放置12 h，觀察孔板每孔顏色變化，最后根據(jù)顏色變化及初始濃度得出最小抑菌濃度。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素實驗

由圖1可見，隨著Ca2+濃度的增加紅薯葉總黃酮提取率增加，當達到175 mg/L時，提取率達到最大值2.49%，繼續(xù)增加Ca2+濃度，提取率出現(xiàn)下降趨勢。根據(jù)測試紅薯葉總黃酮提取率的高低，選Ca2+濃度為150、175、200 mg/L三個水平進行響應面優(yōu)化；當加入Mg2+濃度在125- 175 mg/L范圍時，紅薯葉總黃酮提取率與Mg2+濃度呈現(xiàn)正相關，當Mg2+濃度達到175 mg/L時，提取率達到最大值2.44%，隨后出現(xiàn)下降趨勢。因此，選Mg2+濃度為150、175、200 mg/L三個水平進行響應面優(yōu)化；乙醇濃度的增加使紅薯葉總黃酮的提取率增加明顯，當增加至70%，提取率達到最大值2.55%?？赡苁窃摫壤軇O性與黃酮極性匹配，有利于黃酮的溶出。根據(jù)測試紅薯葉總黃酮提取率的高低，選乙醇濃度為60%、70%、80%三個水平進行響應面優(yōu)化；在提取時間0.5～1 h的測試范圍內(nèi)，紅薯葉總黃酮提取率與提取時間成正相關，1 h時提取率達到最大值2.50%，隨后出現(xiàn)小幅下降，可能是長時間的加熱不利于紅薯葉黃酮的穩(wěn)定存在，綜合來看，提取時間并不是紅薯葉總黃酮提取的工藝的關鍵，因此選用提取率最高的提取時間1 h作為提取工藝的時間；在料液比測試范圍內(nèi)，先上升后下降，1∶40時，提取率達到最大值2.56%，提取濃度過低過高不利于黃酮類化合物溶出，選乙醇濃度為1∶30、1∶40、1∶50三個水平進行響應面優(yōu)化。

圖1 單因素對紅薯葉總黃酮的提取的影響Fig.1 Effects of various experimental factors on the yield of total flavonoids in sweet potato leaves

3.2 響應面試驗設計結(jié)果

3.2.1 因素水平的確定

利用Design- Expert 8.0.6 Trial設計并進行實驗，結(jié)果表2所示：

得出響應面回歸方程為：

總黃酮提取率=2.67-0.055A+0.022B+0.016C+2.5×10- 3D-5.0×10- 3AB-1.0×10- 2AC-0.05AD+0.085BC-0.03BD-0.033CD-0.20A2-0.20B2-0.12C2-0.1D2

表2 響應面實驗設計及結(jié)果

方差分析見表3，在Ca2+和Mg2+存在下，對紅薯葉總黃酮提取率的回歸模型進行模擬，該模型F值為4.39，P值為0.0072，差異顯著。失擬項F=7.67，P=0.120 7(大于0.05)，表明模型失擬不顯著，真實提取率與模擬值基本一致，且與所選因素有較強的相關性，F(xiàn)值大小可判斷各因素對提取率影響的強弱，F(xiàn)值越大，影響越強[19]。由此可判斷影響程度順序為Ca2+濃度> Mg2+濃度>乙醇濃度>料液比。

3.2.2 響應面圖分析

根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，軟件模擬得到的3D響應面圖，響應面可以直觀反映出乙醇濃度、料液比、Ca2+濃度、Mg2+濃度對紅薯葉總黃酮提取率的影響。如圖2所示，在測試范圍內(nèi)，隨著四個因素的增加，紅薯葉總黃酮呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢，表明乙醇濃度、料液比、Ca2+濃度、Mg2+濃度在測試范圍內(nèi)具有相互影響和作用。響應面曲面斜率越大說明對應的因素對提取影響顯著，綜合觀察，Mg2+對紅薯葉總黃酮提取影響最大，Ca2+次之。

軟件預測：紅薯葉總黃酮提取最佳工藝為：Ca2+濃度187 mg/L、Mg2+濃度176 mg/L、乙醇濃度71%、料液比1∶40，提取時間取1 h，預測提取率為2.60%。

表3 方差分析結(jié)果

3.2.3 驗證性實驗及浸膏制作

對預測最優(yōu)工藝進行三組平行實驗驗證，提取率分別為2.75%、2.78%、2.74%，平均值為2.76%(RSD=0.75)，響應面回歸方程預測值與實際值較為相符。提取過程中引入Ca2+和Mg2+有利于紅薯葉總黃酮的提取，較傳統(tǒng)工藝提取率小幅提升(考慮到紅薯葉產(chǎn)地、采摘時間、部位差異、種類、干燥方式等因素對紅薯葉中總黃酮含量的影響較大，我們僅參考文獻報道的傳統(tǒng)工藝方法[20]：60%乙醇水溶液90 ℃回流提取60 min,料液比1∶40，經(jīng)驗證，提取率為2.2%)，可能原因是Ca2+和Mg2+與總黃酮化合物結(jié)合，使溶液中游離的總黃酮濃度降低，有利于紅薯葉中黃酮類化合物的溶出。根據(jù)(《中國藥典》2015版通則2201)的熱浸法，制得浸膏，總浸膏得率為15.92%；經(jīng)檢測，浸膏中的黃酮含量為17.32%。

3.3 抑菌活性研究

表4 最小抑菌濃度(MIC)

注：1.“-”表示無抑菌作用。

Note:1."-" means no bacteriostatic effect.

圖2 各因素對紅薯葉總黃酮提取率影響的3D響應面圖Fig.2 3D response surface diagram of the effects of various factors on the extraction rate of total flavonoids from sweet potato leaves

結(jié)果表明，在紅薯葉總黃酮的提取過程中引入Ca2+和Mg2+有助于提升其抑菌活性，提取過程中引入Ca2+和Mg2+的提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度分別為62.5、31.25、31.25 μg/mL；未引入Ca2+和Mg2+提取液的最小抑菌濃度分別為125、125、62.5 μg/mL。而在傳統(tǒng)紅薯葉總黃酮提取物溶液中后補加入Ca2+和Mg2+則對抑菌活性影響不大，單純的Ca2+溶液和Mg2+溶液或者Ca2+和Mg2+溶液則無抑菌活性。由此可知，提取過程中溶液中的Ca2+和Mg2+與紅薯葉總黃酮化合物可能形成某種具有較強抑菌活性的配合物，而這種配合物形成可能需要一定的反應條件，可能與紅薯葉總黃酮的提取過程條件相似，具體的機理還需進一步驗證。

4 結(jié)論

本研究考察了硬水中含量最多的Ca2+和Mg2+在對紅薯葉的提取和抑菌的影響。通過單因素試驗，篩選出對紅薯葉總黃酮影響最顯著的因素水平，通過Box- Behnken實驗設計得出紅薯葉總黃酮提取最優(yōu)工藝為Ca2+濃度187 mg/L、Mg2+濃度176 mg/L、乙醇濃度71%、料液比1∶40、提取時間為1 h。經(jīng)驗證，實際提取率為2.76%，相較傳統(tǒng)的提取工藝相提取率有小幅度的提升。含有Ca2+和Mg2+提取工藝的研發(fā)為紅薯葉的開發(fā)利用(深加工提取)提供了更多的選擇，使得紅薯葉總黃酮的提取成本得到降低，提取溶劑由“蒸餾水+乙醇”延伸為“自來水+乙醇”。

測試了在提取中引入Ca2+和Mg2+提取物抑菌效果。結(jié)果表明：在紅薯葉總黃酮提取中引入Ca2+和Mg2+提取物抑菌活性顯著提升，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度分別為62.5、31.25、31.25 μg/mL，低于未引入Ca2+和Mg2+提取液。該結(jié)論為紅薯葉開發(fā)和利用提供了更多的思路，為研究硬水中常見Ca2+和Mg2+對植物資源開發(fā)利用的影響提供新的思路和建立理論基礎。