張洪權(quán)，楊 英，佘嘉祎，劉雨琪，江婉秋，張 彬，鄧櫻花*，熊校勤*

1植物抗癌活性物質(zhì)提純與應(yīng)用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2湖北第二師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430205

香青(AnaphalissinicaHance)和黃腺香青車(chē)前葉變種(Anaphalisaureopunctatavar.plantaginifoliaChen)均為菊科(Compositae)香青屬(AnaphalisDC.)植物，生于海拔1 000米以上的山坡和濕地[1]。香青具有鎮(zhèn)咳、祛痰、抑菌等作用[2]，Hua等[3]對(duì)甘肅產(chǎn)香青揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行了分析，共鑒定出80種揮發(fā)性化學(xué)成分，關(guān)于香青揮發(fā)油的生物活性還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。黃腺香青具有清熱解毒、驅(qū)蟲(chóng)的功效，用于牙痛、痢疾、蛔蟲(chóng)病等癥[4]。關(guān)于黃腺香青車(chē)前葉變種揮發(fā)油的化學(xué)成分及藥理活性未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬采用GC- MS結(jié)合保留指數(shù)對(duì)大別山產(chǎn)香青及黃腺香青車(chē)前葉變種全株揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行分析，并采用MTT法對(duì)其進(jìn)行體外抗腫瘤活性測(cè)試，旨在為這兩種香青屬植物的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 材料與試劑

香青和黃腺香青車(chē)前葉變種采自于湖北省大別山，由湖北第二師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院戴月副教授鑒定為菊科香青屬植物香青(AnaphalissinicaHance)和黃腺香青車(chē)前葉變種(Anaphalisaureopunctatavar.plantaginifoliaChen)，原植物標(biāo)本(編號(hào)：20170723、20170724)現(xiàn)存于湖北第二師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院植物標(biāo)本室。正構(gòu)烷烴C7～C30(色譜純)、甲基噻唑藍(lán)(MTT)、順鉑(cisplatin)和D5796 DMEM培養(yǎng)基均為美國(guó)Sigma- Aldrich公司產(chǎn)品；胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；四季青?胎牛血清為浙江天航生物科技股份有限公司生產(chǎn)；實(shí)驗(yàn)室用水為Milli- Q Integral 5型純水儀生產(chǎn)的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890A- 5975C型氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司生產(chǎn)；Spectramax?plus384型多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司生產(chǎn)；3111型CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)；IX51型倒置熒光顯微鏡，日本Olympus公司生產(chǎn)；SW- CJ- 2FD型超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇訓(xùn)安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)；YXQ- LS- 75S11型滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)；Milli- Q Integral 5型純水儀，德國(guó)Merck Millipore公司生產(chǎn)；揮發(fā)油提取器，江蘇三愛(ài)思玻璃儀器有限公司生產(chǎn)。

1.3 供試細(xì)胞

肺癌細(xì)胞株A549、宮頸癌細(xì)胞株HeLa、肝癌細(xì)胞株HepG2和結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT- 116購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 揮發(fā)油的提取

參照2015版《中國(guó)藥典·四部》通則2204揮發(fā)油測(cè)定法。稱(chēng)取粉碎過(guò)的香青和黃腺香青車(chē)前葉變種全株各200 g，置于5 L的圓底燒瓶中，加入3 L的超純水，蓋上瓶塞，浸泡3 h，提取約8 h，至測(cè)定器中油量不再增加，停止加熱，靜置冷卻，收集揮發(fā)油。以油質(zhì)量/樣品質(zhì)量計(jì)算香青和黃腺香青車(chē)前葉變種全株揮發(fā)油的提取率分別為0.87%和0.79%。

2.2 GC- MS分析條件

2.2.1 香青GC條件

進(jìn)樣口溫度為250 ℃，進(jìn)樣量1 μL,分流比：30∶1，色譜柱：Agilent HP- 5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細(xì)管柱，載氣：He氣。初始溫度：40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升溫至135 ℃，再以0.5 ℃/min升溫至143 ℃，然后以1 ℃/min升溫至150 ℃，最后以20 ℃/min升溫至280 ℃，保持5 min。

2.2.2 黃腺香青車(chē)前葉變種GC條件

進(jìn)樣口溫度為250 ℃，進(jìn)樣量1 μL,分流比：30∶1，色譜柱：Agilent HP- 5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細(xì)管柱，載氣：He氣。初始溫度：60 ℃，保持3 min，以4 ℃/min升溫至250 ℃，保持3 min，再以20 ℃/min升溫至300 ℃，保持10 min。

2.2.3 MS條件

電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；接口溫度260 ℃；離子源溫度230 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z：30～500；采集方式：全掃描模式。

2.3 保留指數(shù)(RI)的計(jì)算

將C7～C30正構(gòu)烷烴對(duì)照品按照2.2項(xiàng)下分析條件測(cè)定其保留時(shí)間，根據(jù)線(xiàn)性程序升溫的保留指數(shù)計(jì)算公式，求得保留指數(shù)(RI)值：

(1)

式中，tR保留時(shí)間，min；x待分析的化合物；Z，Z+1正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)，且tR(Z)

2.4 抗腫瘤活性測(cè)試

采用MTT法測(cè)定香青和黃腺香青車(chē)前葉變種揮發(fā)油對(duì)四種腫瘤細(xì)胞系生長(zhǎng)的抑制能力，并以順鉑(1.25 mg/mL PBS儲(chǔ)備液)作為陽(yáng)性對(duì)照。主要步驟如下：將腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胰蛋白酶消化并離心收集細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后將細(xì)胞稀釋至105cells /mL，接種至96孔板，每孔100 μL，過(guò)夜培養(yǎng)后，每孔加入經(jīng)培養(yǎng)基稀釋至2倍終濃度的待測(cè)樣品，使藥物的終濃度分別為6.25、12.5、25、50、100 μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL的MTT(5 mg/mL PBS溶液)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結(jié)束后，吸去上清，每孔加入150 μL DMSO，充分振蕩至結(jié)晶完全溶解使用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)吸光值。通過(guò)以下公式計(jì)算各組細(xì)胞的存活率：

細(xì)胞抑制率(%)=(對(duì)照組吸光度值-加藥組吸光度值)/對(duì)照組吸光度值×100%

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 揮發(fā)油成分分析

采用水蒸氣蒸餾法提取制備大別山產(chǎn)香青和黃腺香青車(chē)前葉變種全株的揮發(fā)油，并用GC- MS進(jìn)行檢測(cè)，其總離子流見(jiàn)圖1，其結(jié)果通過(guò)NIST2011質(zhì)譜庫(kù)進(jìn)行檢索，利用計(jì)算的保留指數(shù)與文獻(xiàn)值比對(duì)進(jìn)行定性，再用峰面積歸一化法計(jì)算各化合物的相對(duì)含量，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，從香青和黃腺香青車(chē)前葉變種全株揮發(fā)油中共鑒定出73種化學(xué)成分，主要為萜類(lèi)化合物。在香青揮發(fā)油中共鑒定出44種揮發(fā)性成分，占總揮發(fā)性成分的60.94%，其中倍半萜占46.33%、單萜占11.67%、二萜占0.14%。倍半萜類(lèi)化合物中主要有α- 葎草烯(14.80%)、δ- 杜松烯(5.84%)、(E)- 石竹烯(5.24%)和γ- 雪松烯(2.57%)等；單萜類(lèi)化合物中主要有α- 蒎烯(0.75%)；二萜類(lèi)化合物有西柏烯(0.14%)。在黃腺香青車(chē)前葉變種揮發(fā)油中共鑒定出46種揮發(fā)性成分，占總揮發(fā)性成分的83.29%，其中倍半萜占67.74%、單萜占5.65%、二萜占4.05%。倍半萜類(lèi)化合物中主要有(E)- 石竹烯(20.71%)、α- 葎草烯(8.56%)、順式-β- 愈創(chuàng)木烯(7.27%)和γ- 姜黃烯(6.01%)等；單萜類(lèi)化合物中主要有α- 蒎烯(2.14%)；二萜類(lèi)化合物主要有香葉基-α- 松油烯(3.91%)。

圖1 香青(A)和黃腺香青車(chē)前葉變種(B)揮發(fā)油總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile oils of A.sinica(A) and A.aureopunctata var. plantaginifolia (B)

表1 大別山產(chǎn)香青和黃腺香青車(chē)前葉變種全株揮發(fā)油化學(xué)成分及相對(duì)含量

續(xù)表2(Continued Tab.2)

序號(hào)No.化合物名稱(chēng)Compound分子式Formula質(zhì)量分?jǐn)?shù)Content(%)保留指數(shù)Retention index香青A.sinica黃腺香青車(chē)前葉變種A.aureopunctata var.plantaginifolia計(jì)算值RIexp引用值RIlit文獻(xiàn)Ref.10苯乙醛 BenzeneacetaldehydeC8H8O-0.221 0481 046611順式-氧化呋喃芳樟醇 Linalool oxide,(furanoid),cis-C10H18O2-0.111 0721 075612芳樟醇 LinaloolC10H18O-0.481 1021 099613 1-Octen-3-yl acetateC10H18O2-0.531 1131 110614α-CampholenC10H16O0.13-1 1281 124615α-松油醇 α-TerpineolC10H18O-0.131 1921 190616桃金娘烯醇 MyrtenolC10H16O0.47-1 2001 194617順式-香芹醇 Carveol,cis-C10H16O0.02-1 2341 227618丁子香酚 EugenolC10H12O2-0.461 3631 358619α-衣蘭烯 α-YlangeneC15H240.20-1 3681 370620異喇叭烯 IsoledeneC15H24-0.331 3701 373721α-古巴烯 α-CopaeneC15H240.85-1 3721 376622α-柏木萜烯 α-FunebreneC15H24-0.811 3741 3678236S-2,3,8,8-Tetramethyltricyclo[5.2.2.0(1,6)]undec-2-eneC15H240.46-1 3751 3669241,2-二甲基-3,4-二乙基苯 Benzene,1,2-diethyl-3,4-dimethyl-C12H181.90-1 382 --25α-柏木烯 α-CedreneC15H242.111.641 4021 412626α-古蕓烯 α-GurjuneneC15H240.332.051 4081 409627(E)-石竹烯 (E)-CaryophylleneC15H245.2420.711 4161 420628γ-馬欖烯 γ-MaalieneC15H240.20-1 4231 4241029β-古蕓烯 β-GurjuneneC15H242.310.531 4311 431630香樹(shù)烯 AromadendreneC15H24-0.831 4381 441631α-雪松烯 α-HimachaleneC15H240.21-1 4431 445632α-葎草烯 α-HumuleneC15H2414.808.561 4511 453633別香樹(shù)烯 AlloaromadendreneC15H240.710.371 4591 460634反式-α-香檸檬烯 α-Bergamotene,trans-C15H240.66-1 4571 435635γ-古蕓烯 γ-GurjuneneC15H240.181.021 4711 472636γ-芹子烯 γ-SelineneC15H24-0.381 4741 4701137γ-依蘭油烯 γ-MuuroleneC15H241.780.931 4771 476638γ-雪松烯 γ-HimachaleneC15H242.57-1 4781 476639γ-姜黃烯 γ-CurcumeneC15H24-6.011 4821 480640Ar-姜黃烯 Ar-CurcumeneC15H24-4.271 4861 482641雅檻藍(lán)烯 Eremophilene C15H24-0.751 4901 48612

續(xù)表2(Continued Tab.2)

序號(hào)No.化合物名稱(chēng)Compound分子式Formula質(zhì)量分?jǐn)?shù)Content(%)保留指數(shù)Retention index香青A.sinica黃腺香青車(chē)前葉變種A.aureopunctata var.plantaginifolia計(jì)算值RIexp引用值RIlit文獻(xiàn)Ref.42朱欒倍半萜 ValenceneC15H241.16-1 4921 492643α-姜烯 α-ZingibereneC15H240.95-1 4951 495644順式-β-愈創(chuàng)木烯 β-Guaiene,cis-C15H24-7.271 4971 489645α-衣蘭油烯 α-Muurolene C15H240.970.341 4991 498646β-紅沒(méi)藥烯 β-BisaboleneC15H240.180.191 5081 508647α-紫穗槐烯 α-AmorpheneC15H241.67-1 5101 482648γ-杜松烯 γ-CadineneC15H24-0.901 5141 513649δ-杜松烯 δ-CadineneC15H245.841.581 5241 523650Cadina-1(2),4-diene,cisC15H240.14-1 5271 531651α-杜松烯 α-CadineneC15H24-0.241 5371 533652α-二去氫菖蒲烯 α-CalacoreneC15H200.55-1 5371 540653喇叭茶薁醇 PalustrolC15H26O0.39-1 5601 567654GleenolC15H26O0.23-1 5821 583655氧化石竹烯 Caryophyllene oxideC15H24O0.243.311 5831 581656綠花白千層醇 ViridiflorolC15H26O0.81-1 6001 591657環(huán)氧化葎草烯II Humulene epoxide IIC15H24O-1.441 6091 605658表-α-杜松醇 α-Cadinol,epi-C15H26O0.59-1 6341 63865910,10-Dimethyl-2,6-dimethylenebicyclo[7.2.0]undecan-5β-olC15H24O-0.561 6381 6211360β-桉葉油醇 β-EudesmolC15H26O-0.811 6511 6506614-(2,2-Dimethyl-6-methylenecyclohexyl)butanalC13H22O0.04-1 6851 7031462α-紅沒(méi)藥醇 α-BisabololC15H26O-1.731 6861 683663十五醛 PentadecanalC15H30O-0.181 7151 714664十四酸 Tetradecanoic acidC14H28O-0.241 7791 767665六氫法呢基丙酮 Hexahydrofarnesyl acetoneC18H36O0.420.811 8461 844666香葉基-α-松油烯 geranyl-α-terpineneC20H32-3.911 9101 9021567西柏烯 CembreneC20H320.14-1 9161 9191668棕櫚酸 Palmitic acidC16H32O2-3.571 9861 968669植醇 PhytolC20H40O0.210.142 1162 116670亞油酸 Linoleic acidC18H32O2-0.152 1472 129671二十三烷 TricosaneC23H480.05-2 298 --722,2′-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚) Phenol,2,2′-methylenebis[6-(1,1-dimethylethyl)-4-methyl-]C23H32O20.03-2 4432 3981773二十五烷 OctadecaneC25H520.12-2 498--總計(jì)Total60.9483.29

3.2 抗腫瘤活性分析

抗腫瘤活性測(cè)試結(jié)果(表2)顯示：大別山產(chǎn)香青和黃腺香青車(chē)前葉變種全株揮發(fā)油對(duì)腫瘤細(xì)胞A549、Hela、HepG2 、HTC- 116具有不同程度的抑制作用，具有劑量依賴(lài)關(guān)系，其中香青揮發(fā)油對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HTC- 116的抑制作用最強(qiáng)，對(duì)宮頸癌細(xì)胞Hela有中等強(qiáng)度抑制作用；黃腺香青車(chē)前葉變種揮發(fā)油對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HTC- 116和肝癌細(xì)胞HepG2的抑制作用均較強(qiáng)，對(duì)肺癌細(xì)胞A549具有中等強(qiáng)度抑制作用；對(duì)比兩種揮發(fā)油的抗腫瘤活性可知，黃腺香青車(chē)前葉變種揮發(fā)油對(duì)腫瘤細(xì)胞系體外增值的抑制作用較香青揮發(fā)油強(qiáng)。

表2 抗腫瘤半抑制濃度值

注：順鉑為陽(yáng)性對(duì)照。

Note:Cisplatin served as positive control.

4 討論

本研究從兩種香青屬植物揮發(fā)油中共鑒定出73種化學(xué)成分，其中從香青揮發(fā)油中鑒定出44種揮發(fā)性成分，從黃腺香青車(chē)前葉變種揮發(fā)油中鑒定出46種。兩種揮發(fā)油中相同成分有17種，包括(E)- 石竹烯、α- 葎草烯、α- 蒎烯、δ- 杜松烯和氧化石竹烯等，均為萜類(lèi)物質(zhì)，其相對(duì)含量分別占各自揮發(fā)油總量的46.24%和44.61%，主要相同成分在兩種香青屬植物揮發(fā)油中的含量差別較大，如α- 葎草烯、α- 蒎烯、δ- 杜松烯在香青揮發(fā)油中的含量高于黃腺香青車(chē)前葉變種，分別達(dá)到14.80%、10.56%、5.84%；而(E)- 石竹烯和氧化石竹烯在黃腺香青車(chē)前葉變種揮發(fā)油中的含量較高，含量分別為20.71%和3.31%。

α- 葎草烯對(duì)人前列腺癌PC- 3細(xì)胞系、人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)- 549和人脂肪黑色素瘤M4BEU細(xì)胞系具有較強(qiáng)的抑制作用，IC50值分別為14.89、13.87和11.22 μg/mL[18]。δ- 杜松烯對(duì)人乳腺癌BT- 20細(xì)胞系和宮頸癌HeLa細(xì)胞系具有很強(qiáng)的抑制作用，IC50值分別為3.86和3.66 μg/mL[19]。(E)- 石竹烯對(duì)人乳腺癌BT- 20細(xì)胞系、宮頸癌HeLa細(xì)胞系和黑色素皮膚癌TB- 140細(xì)胞系具有很強(qiáng)的抑制作用，IC50值分別為3.92、3.86和4.86 μg/mL[20]。大別山產(chǎn)兩種香青屬植物揮發(fā)油對(duì)腫瘤細(xì)胞A549、Hela、HepG2 、HTC- 116的抑制作用可能與上述揮發(fā)油中含有的主要成分α- 葎草烯、(E)- 石竹烯和δ- 杜松烯等化合物的抗腫瘤活性有關(guān)。綜上所述，本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用香青和黃腺香青車(chē)前葉變種的藥用價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。