路晨玥, 林 焱, 蘇松坤

(福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

阿爾茲海默癥(Alzheimer′s disease, AD)是最常見的癡呆類型，年齡增長是引起該病癥的主要原因.據(jù)研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計，65周歲以上的人群中，AD發(fā)病率達(dá)10%～15%，隨著年齡增長，85周歲的老年人患病率達(dá)30%以上[1].至今全球有5 000萬人患有癡呆癥，預(yù)估耗費約1萬億美元[2].中國是世界上人均壽命最長(目前的平均壽命約為84歲)、老年人比例最高的國家[3].隨著人口老齡化日趨嚴(yán)重，AD患者將逐年增加，因此，該病引起了各界的關(guān)注和重視.

AD的發(fā)病機理復(fù)雜，至今仍未明確其根本病因.AD在醫(yī)學(xué)上的主要病理特征之一是細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)纖維纏結(jié)，而微管相關(guān)蛋白tau的超磷酸化是AD患者腦中雙螺旋纖維的主要組成物質(zhì)，大量聚集沉淀便形成神經(jīng)纖維纏結(jié)[4].SH-SY5Y是來自骨瘤轉(zhuǎn)移灶的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，具有神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)特點，且tau蛋白、調(diào)節(jié)tau蛋白磷酸化的蛋白激酶和蛋白磷酸酶的含量較高[5]，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機制和藥物作用機制方面的研究.OA是一種蛋白磷酸酶抑制劑，可抑制磷酸酶的活性，并提高微管相關(guān)蛋白tau蛋白的磷酸化程度，對細(xì)胞造成氧化損傷[6].體內(nèi)外試驗表明，OA能誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞中的tau蛋白發(fā)生磷酸化，使神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變[7-9]，因此OA損傷的SH-SY5Y細(xì)胞是常用的AD細(xì)胞模型，多用于研究AD的病理機制和藥物作用.實際上，AD病因復(fù)雜，除神經(jīng)纖維纏結(jié)外，還與炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)等密切相關(guān).蜂王漿(royal jelly, RJ)具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂等功效，長期服用RJ，可能會對AD的抗氧化作用有積極影響，因此研究RJ對AD的作用，對于RJ的功能開發(fā)和應(yīng)用具有重要意義.本研究通過3個指標(biāo)SOD、MDA和ROS評估RJ對OA誘導(dǎo)損傷的阿爾茲海默癥SH-SY5Y細(xì)胞模型的抗氧化作用，以探究RJ對該AD細(xì)胞模型是否有抗氧化功效.

1 材料與方法

1.1 蜂王漿與細(xì)胞

本試驗所用的蜂王漿為江蘇句容夏季采集的意大利蜜蜂王漿；SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞購自上海中橋新舟生物科技有限公司.

1.2 試劑

SH-SY5Y細(xì)胞專用完全培養(yǎng)基和不完全培養(yǎng)基(ZQ-1205)購自上海中橋新舟生物科技有限公司；OA(LK30S49)購自北京百威靈科技有限公司；分析純二甲基亞砜(DMSO, 20160601)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白酶(2046777)購自美國Gibco公司；CCK試劑盒(M10124)和BCA蛋白定量試劑盒(M20929)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(微量法)和丙二醛(MDA)試劑盒(微量法)購自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司；活性氧(ROS)檢測試劑盒(070918181105)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司.

1.3 儀器

CO2培養(yǎng)箱(C150)購自BINDER公司；臺式低速離心機(TDZ4-WS)購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；生物安全柜(HFsafe-1500 A2)購自上海力申科學(xué)儀器有限公司；恒溫水槽與水浴鍋(BWS-5)購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；酶聯(lián)免疫檢測儀(Infinite F50)購自Tecan(上海)貿(mào)易有限公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(SCIENTZ-IID)購自寧波新芝生物科技股份有限公司；流式細(xì)胞儀(C6 PLUS)購自美國BD公司；倒置顯微鏡(Nikon ECLIPSE TS100)購自日本Nikon公司.

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)于含44% MEM、44% F-12、10% FBS、1% PS、1% SP的SH-SY5Y完全培養(yǎng)基中，置于5% CO2、飽和濕度、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).

1.4.2 OA使用濃度和損傷時間的篩選 將50 μg OA溶解于6 mL DMSO中配制成10 μmol·L-1母液存放于-80 ℃保存?zhèn)溆?臨用前使用SH-SY5Y完全培養(yǎng)基對OA母液進(jìn)行稀釋.將SH-SY5Y細(xì)胞用胰蛋白酶消化后稀釋細(xì)胞至濃度1.5×105個·mL-1，接種于細(xì)胞96孔培養(yǎng)板中(每孔100 μL)，放入培養(yǎng)箱，待細(xì)胞貼壁后(約24 h)吸棄培養(yǎng)基，每孔加入100 μL不同濃度的OA溶液(30、40、50、60、70 nmol·L-1)，對照組加入等體積的SH-SY5Y完全培養(yǎng)基，每個濃度8個復(fù)孔，分別培養(yǎng)12、24 h后每孔加入10 μL CCK溶液于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀測定492 nm處的吸光值，試驗重復(fù)3次.

1.4.3 不同含量蜂王漿對OA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞活度的影響 將SH-SY5Y細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，稀釋細(xì)胞至濃度1×105個·mL-1，接種于細(xì)胞96孔培養(yǎng)板中(每孔100 μL)，放入培養(yǎng)箱，待細(xì)胞貼壁后(約24 h)，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 40 nmol·L-1OA溶液，損傷24 h后吸棄OA溶液，每孔加入100 μL不同含量的RJ溶液(0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 mg·mL-1)，RJ溶液由SH-SY5Y不完全培養(yǎng)基(44% MEM、44% F-12、1% PS、1% SP)配制，對照組加入等體積的SH-SY5Y不完全培養(yǎng)基，每個含量8個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入CCK溶液10 μL，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀測定492 nm處的吸光值，試驗重復(fù)3次.同時對比在RJ作用下，受OA損傷的SH-SY5Y細(xì)胞的形態(tài)差異.

1.4.4 細(xì)胞中SOD和MDA的含量檢測 將SH-SY5Y細(xì)胞用胰蛋白酶消化后稀釋細(xì)胞至濃度5×105個·mL-1，接種于細(xì)胞6孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL，放入37 ℃培養(yǎng)箱，24 h待細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入2 mL 40 nmol·L-1OA溶液，損傷24 h后吸棄OA溶液，每孔加入2 mL用SH-SY5Y不完全培養(yǎng)基配制的不同含量的RJ溶液(0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 mg·mL-1)，對照組加入等體積的SH-SY5Y不完全培養(yǎng)基，每個濃度3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，1000 r·min-1離心10 min后棄上清，分別加入600 μL SOD、MDA提取液重懸細(xì)胞，超聲波破碎細(xì)胞(冰浴，功率20%，超聲3 s，間隔10 s，重復(fù)30次)后，8 000 r·min-1離心10 min(4 ℃)，取上清置冰上待測.按照試劑盒說明書的步驟和用量將相關(guān)試劑與待測液混合后，將混合液室溫放置30 min， 595 nm波長處測定吸光值，計算SOD含量；將混合液95 ℃水浴30 min后，492、595 nm波長處測定吸光值，計算 MDA.試驗重復(fù)3次.

1.4.5 細(xì)胞中ROS含量的檢測 細(xì)胞鋪板、OA損傷和RJ處理同1.4.4.按照1∶1 000用不完全培養(yǎng)基稀釋熒光探針DCFH-DA，使終濃度為10 μmol·L-1，細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，再用不完全培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，最后用流式細(xì)胞儀檢測得到Mean值.

1.5 統(tǒng)計分析

流式細(xì)胞儀檢測ROS的結(jié)果，使用BD Accuri C6 Plus軟件進(jìn)行處理與分析.采用Graph Pad Prism 5.0軟件處理試驗數(shù)據(jù).單因素多組數(shù)據(jù)采用one-way ANOVA方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 OA使用濃度和損傷時間對細(xì)胞活度的影響

圖1為CCK法測定得到的不同濃度OA誘導(dǎo)損傷SH-SY5Y細(xì)胞12、24 h的細(xì)胞活度.不同濃度的OA損傷SH-SY5Y細(xì)胞12 h時，細(xì)胞活度與對照組相比均有所升高，不同濃度的OA損傷SH-SY5Y細(xì)胞24 h時，細(xì)胞活度與對照組相比均有明顯下降(圖1).結(jié)果表明，OA損傷SH-SY5Y細(xì)胞24 h效果更好；同時，有研究通過蛋白免疫印跡確定40 nmol·L-1濃度的OA損傷SH-SY5Y細(xì)胞24 h， tau蛋白Ser-396位點磷酸化水平達(dá)到峰值[4]，所以最終選定40 nmol·L-1的OA損傷24h構(gòu)建SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型.以下試驗都采用此損傷時間和損傷濃度.

2.2 OA損傷前后SH-SY5Y細(xì)胞的形態(tài)變化

正常SH-SY5Y細(xì)胞具有神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)特點，為貼壁細(xì)胞，錐形，細(xì)胞突觸較長，具有明顯軸突，飽滿有光澤(圖2A).經(jīng)過OA損傷的SH-SY5Y細(xì)胞變?yōu)閼腋〖?xì)胞，突觸消失變圓，細(xì)胞皺縮(圖2B).

2.3 不同含量RJ對OA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞活度的影響

RJ在24、48和72 h對OA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞活度都有促進(jìn)效果，且在2或4 mg·mL-1處效果最佳，在16 mg·mL-1處細(xì)胞活度較低或細(xì)胞死亡(圖3).一定含量的RJ可提高OA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞活度，含量由低到高呈現(xiàn)出細(xì)胞活度先升高再降低的趨勢，24、72 h最適含量為2 mg·mL-1，48 h為4 mg·mL-1，且2和4 mg·mL-1RJ處理OA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞48和72 h后，細(xì)胞活度均高于正常組細(xì)胞，說明特定含量RJ可顯著促進(jìn)OA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞生長.

2.4 RJ處理OA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)特征變化

圖4為2 mg·mL-1RJ處理OA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，與圖2B相比SH-SY5Y細(xì)胞受OA損傷消失的突觸重新出現(xiàn)，并部分細(xì)胞貼壁.

2.5 細(xì)胞中SOD含量檢測

由圖5可知，在試驗濃度范圍內(nèi)，一定濃度的RJ處理OA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞24、48、72 h后，細(xì)胞內(nèi)的SOD含量均有提高，且在RJ為2 mg·mL-1時，細(xì)胞處理48 h與對照組相比差異顯著，RJ處理72 h后，所有細(xì)胞中SOD含量均高于對照組.結(jié)果表明，一定含量的RJ處理OA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞一定時間，能提高細(xì)胞內(nèi)SOD活性，增加細(xì)胞抗氧化能力.

2.6 細(xì)胞中MDA含量檢測

由圖6可知，在試驗濃度范圍內(nèi)，一定濃度的RJ處理OA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞24、48、72 h后細(xì)胞內(nèi)的MDA含量均有降低，與RJ含量呈負(fù)相關(guān).處理24和72 h試驗組和對照組相比，MDA含量均有顯著或極顯著差異；處理48 h，RJ含量為0.5、2和8 mg·mL-1時，試驗組與對照組相比有顯著差異.該結(jié)果表明，一定含量的RJ處理OA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞一定時間，能降低細(xì)胞中MDA含量，防止脂質(zhì)過氧化造成的細(xì)胞損傷.

2.7 細(xì)胞中ROS含量的檢測

由圖7可知， RJ處理OA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞24、48、72 h后細(xì)胞內(nèi)的ROS含量均有變化.8 mg·mL-1RJ處理24 h，與對照組相比ROS含量有所升高，有顯著差異；低含量RJ處理48 h時，試驗組與對照組相比ROS有所下降且差異顯著，而高含量時ROS則有所上升且差異顯著；低、高含量RJ處理72 h，試驗組與對照組相比ROS有所下降且差異顯著，而RJ含量為中間值時，ROS有所上升且差異顯著.該結(jié)果表明，低含量RJ處理OA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞48 h，低、高含量RJ處理OA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞72 h可降低代謝過程中產(chǎn)生的一系列活性氧簇，降低細(xì)胞的氧化損傷.

3 討論

導(dǎo)致AD的因素很多，年紀(jì)增長導(dǎo)致的身體機能衰退，患者腦內(nèi)的局灶性炎癥反應(yīng)造成的損傷，氧化應(yīng)激作用導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞受損和凋亡，高血壓高血脂對腦部血管的損害等都會引起相關(guān)的癥狀和病情.RJ作為一種適合中老年人食用的保健品，能提高中老年人的抵抗力和身體素質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂和血壓、降血糖的功效.因此，進(jìn)一步研究RJ對AD的作用，對于RJ的功能開發(fā)和應(yīng)用具有重要意義.

RJ對AD的作用時有報道.Zamani et al[10]用RJ飼喂側(cè)腦注射了鏈脲佐菌素的AD模型小鼠，用迷宮試驗測試大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，結(jié)果表明，與未飼喂RJ的模型小鼠相比，試驗組的小鼠發(fā)病潛伏期增長，空間學(xué)習(xí)記憶能力有所提升，因此RJ在AD的神經(jīng)保護(hù)作用中起著很重要的作用.Pan et al[11]研究表明，在飼喂2%膽固醇和銅飲用水構(gòu)建的Aβ AD兔模型中，RJ干預(yù)后AD兔大腦SOD水平顯著升高，MDA含量和ROS/RNS含量降低，表明RJ具有通過增強抗氧化能力來保護(hù)神經(jīng)元的潛力.孫平[12]利用蜂王幼蟲腸道酶酶解RJ水溶性蛋白制備出的蜂王漿多肽(RJP)，對β-淀粉樣蛋白25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡模型的保護(hù)作用進(jìn)行了研究，試驗結(jié)果表明，分子質(zhì)量為1～3 ku和3～5 ku的RJP可減少細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生.現(xiàn)有研究中，關(guān)于RJ對tau蛋白磷酸化相關(guān)的神經(jīng)保護(hù)作用鮮有報道.因此本研究選用SH-SY5Y細(xì)胞，利用OA對該細(xì)胞tau蛋白磷酸化的作用建立阿爾茲海默癥神經(jīng)纖維纏結(jié)的病理細(xì)胞模型，研究RJ對阿爾茲海默癥抗氧化的作用.與動物試驗相比，細(xì)胞試驗更靈敏高效.由于體內(nèi)環(huán)境非常復(fù)雜，活性物質(zhì)很可能在發(fā)揮作用前就因為化合物自身穩(wěn)定性差或被其他部位降解等原因失效，而細(xì)胞試驗可以有效避免此類問題，更便于研究RJ的直接作用和對RJ中有效成分的探索.

適應(yīng)是細(xì)胞對于內(nèi)、外環(huán)境中有害因子的刺激作用產(chǎn)生的非損傷性應(yīng)答反應(yīng)，是介于正常與損傷之間的一種狀態(tài)，若刺激超過了細(xì)胞的耐受與適應(yīng)能力，便會造成損傷.適應(yīng)在形態(tài)學(xué)上的一般表現(xiàn)為肥大、增生和化生，涉及細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞體積或細(xì)胞分化的改變[13].相關(guān)試驗證明，化學(xué)毒物能夠誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)[14-16].由此推測，OA誘導(dǎo)損傷SH-SY5Y細(xì)胞建立阿爾茲海默癥細(xì)胞模型，需要一定的劑量和處理時間，OA用量較低或處理時間不足，細(xì)胞會產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)造成增生，形成短時間細(xì)胞活度的增加以抵御環(huán)境變化造成的損傷，增加在不利條件下的生存能力，因此，需要增大劑量或者延長處理時間，使細(xì)胞達(dá)到應(yīng)有的損傷效果.本試驗中，如圖1，CCK法檢測不同濃度的OA誘導(dǎo)損傷SH-SY5Y細(xì)胞12 h后的細(xì)胞活度比對照組高，因此考慮提高OA損傷時間以達(dá)到損傷效果.延長損傷時間至24 h時即產(chǎn)生了較好的損傷效果.

研究表明，氧化應(yīng)激在多種神經(jīng)退行性疾病的病變過程中起著重要影響[17].作為酶抗氧化系統(tǒng)中重要成員的SOD，其分布廣泛，是生物抗氧化系統(tǒng)中的重要成分，能清除生物體內(nèi)有害物質(zhì)，尤其是減少氧自由基對生物體造成的損害[18].SOD酶含量檢測中，只有2 mg·mL-1RJ對細(xì)胞處理48 h時與對照組相比差異顯著，雖然其他含量的RJ處理OA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞24、48 h后，細(xì)胞內(nèi)的SOD含量也有提高，72 h后所有處理均高于對照組，但未達(dá)到差異顯著，這可能是細(xì)胞經(jīng)過損傷后狀態(tài)較差以及培養(yǎng)時間過長造成細(xì)胞凋亡等原因使其新陳代謝下降，造成了酶誘導(dǎo)生成下降.

MDA是脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物，是氧化應(yīng)激反應(yīng)的敏感指標(biāo)，其可反應(yīng)自由基的活動狀態(tài)以及機體受影響程度[19].本研究中，MDA含量與RJ含量呈負(fù)相關(guān)，隨著RJ含量的升高而降低，說明RJ對脂質(zhì)的抗氧化能力尤其膜脂的保護(hù)作用很強.MDA還會造成蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合而導(dǎo)致細(xì)胞毒性[20]，因此RJ可能通過降低MDA，減少蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合而發(fā)揮其細(xì)胞保護(hù)作用.

ROSs包括超氧陰離子、羥基自由基、脂質(zhì)過氧化氫及其副產(chǎn)物，在神經(jīng)退行性疾病中具有雙重作用，低濃度的ROS可促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，中、高濃度的ROS會通過氧化應(yīng)激反應(yīng)造成細(xì)胞損傷甚至誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死[21].根據(jù)試驗結(jié)果推測，RJ對ROS的影響可能是一個長效調(diào)控的過程，發(fā)揮作用需要一定時間.研究中，只有8 mg·mL-1RJ處理24 h與對照組相比ROS有所升高且差異顯著，其他含量與對照組相比無顯著差異.在48 h之后，低含量的RJ會使ROS含量下降，更有益于細(xì)胞的生長.72 h時，低含量和高含量的RJ作用細(xì)胞與對照組相比都有所降低并差異顯著，但高含量的RJ可能由于滲透壓較高會對細(xì)胞造成損傷而使細(xì)胞狀態(tài)較差，造成生成的ROS較低，所以推測低濃度的RJ在活性氧方面對細(xì)胞的抗氧化作用更好.

綜上，RJ對阿爾茲海默癥SH-SY5Y細(xì)胞模型具有很好的抗氧化作用，RJ的影響效果與前人試驗結(jié)果一致，因此推測其對受損神經(jīng)細(xì)胞有一定保護(hù)作用，可能對AD有一定積極的效果.