任秀玲，張江林，李偉，喬芳

（1.中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院 流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系，湖南 長(zhǎng)沙 410008；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 皮膚科，湖南 長(zhǎng)沙 410008；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 老年醫(yī)學(xué)科，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

近年來(lái)，隨著人類居住環(huán)境的日益惡劣，皮膚癌發(fā)病率逐年上升，已成為當(dāng)前一個(gè)全球性的公共健康問(wèn)題。皮膚癌分為惡性黑色素瘤和非黑色素瘤性皮膚癌兩大類，其中非黑色素瘤皮膚癌是當(dāng)前全球人類癌癥中最流行的惡性腫瘤之一，約占所有皮膚癌患者的95%，且其發(fā)病率呈正逐年增加趨勢(shì)［1］，嚴(yán)重危害人們的身體健康。探討非黑色素瘤的發(fā)病特點(diǎn)，尋找有效的診治方法具有重要的臨床意義。皮膚鱗狀細(xì)胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）是一種常見(jiàn)的非黑色素瘤，尤其在老年人群中更為普遍。cSCC 源于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，惡性程度高，其早期表現(xiàn)不典型，難以診斷，導(dǎo)致臨床上大部分患者確診時(shí)往往已形成侵襲性的cSCC，常常轉(zhuǎn)移至其他組織器官，患者的治療效果不佳，長(zhǎng)期預(yù)后較差。高度轉(zhuǎn)移的cSCC 患者1 年疾病特異性存活率為44%～56%，區(qū)域淋巴結(jié)受累的患者10 年生存率降至20%以下，而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者10 年生存率降至10%以下［1-2］，嚴(yán)重危害患者的生命。目前，對(duì)這類轉(zhuǎn)移性癌癥的治療方法主要包括化學(xué)療法、靶向療法和免疫療法［3-4］，不僅會(huì)給患者帶來(lái)嚴(yán)重的副作用，還會(huì)產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)壓力，美國(guó)每年因治療cSCC 的總費(fèi)用支出超過(guò)10 億美元［5］。因此，進(jìn)一步探討cSCC 發(fā)病的分子機(jī)制，尋找cSCC 的早期診斷生物標(biāo)志物，改善臨床治療結(jié)果具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究中，我們利用生物信息學(xué)的方法對(duì)cSCC 相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，篩選出cSCC 組織中的差異表達(dá)基因，并探討這些基因的生物學(xué)功能及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以期為解讀cSCC 的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)，為cSCC 的早期診斷和臨床治療提供潛在的生物靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)的獲取

從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中檢索并下載cSCC 相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)GSE42677和GSE53462，前者包含13 例cSCC 組織以及10 例正常的皮膚組，后者包含5 例cSCC 組織以及5 例正常皮膚組織。

1.2 差異表達(dá)基因的篩選

利用Affy 軟件包（http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/affy.html）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理和標(biāo)準(zhǔn)化。利用Limma 包（https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html） 以 |logFC|≥1.5且調(diào)整P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異基因。

1.3 功能富集分析

利用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）工具包對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）和功能富集分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用 STRING 數(shù)據(jù)庫(kù) （https://string-db.org/）分析這些基因的相互作用，結(jié)合Cytoscape 軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，利用MCODE 插件篩選關(guān)鍵模塊，利用CytoHubba 插件篩選核心基因。

1.5 數(shù)據(jù)驗(yàn)證

利用 Oncomine（https://www.oncomine.org/resource/login.html）數(shù)據(jù)庫(kù)中的皮膚鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)對(duì)篩選的差異基因結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并生成熱圖。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因的篩選

從GSE42677 芯片數(shù)據(jù)中共獲得2 539 個(gè)差異表達(dá)基因，包括在腫瘤組織中上調(diào)表達(dá)的基因1 245 個(gè)，下調(diào)表達(dá)的基因1 294 個(gè)（圖1A）；從GSE53462 芯片數(shù)據(jù)中共獲得375 個(gè)差異表達(dá)基因，其中腫瘤組織中上調(diào)表達(dá)的基因112 個(gè)，下調(diào)表達(dá)的基因263 個(gè)（圖1B）。在這些差異表達(dá)基因中，兩組芯片共同上調(diào)表達(dá)基因43 個(gè)，共同下調(diào)表達(dá)基因65 個(gè)。

2.2 GO富集分析和KEGG通路分析

低表達(dá)的差異基因主要富集在細(xì)胞增殖和皮膚發(fā)展等生物學(xué)過(guò)程、軸突和聚合物細(xì)胞骨架纖維等細(xì)胞組份、跨膜受體蛋白激酶活性和陽(yáng)離子結(jié)合等分子功能。高表達(dá)差異基因主要富集在防御反應(yīng)和先天免疫反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞外區(qū)域和細(xì)胞外泌體等細(xì)胞組份、趨化因子受體結(jié)合和細(xì)胞因子活性等分子功能。高表達(dá)的差異基因主要富集在Toll 樣受體信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路和癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)等信號(hào)通路；低表達(dá)的差異基因主要富集在色氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝和p53 信號(hào)通路。

2.3 蛋白質(zhì)相互作用分析

將差異表達(dá)基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，分析相互作用，利用Cytoscape 3.5.1 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，其中總共包含節(jié)點(diǎn)72 個(gè)，邊146 條（圖2）。

圖1 差異表達(dá)基因分布火山圖

圖2 差異表達(dá)基因的PPI 相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.4 差異表達(dá)關(guān)鍵基因模塊分析

利用Cytoscape 軟件的MODE 插件進(jìn)行模塊分析，篩選代表性的模塊，根據(jù)打分高低，獲得前三個(gè)核心模塊。其中核心模塊一得分5.185，包含節(jié)點(diǎn)28 個(gè)，邊70 條，節(jié)點(diǎn)蛋白分別為KRT6B、S100A7、SERPINB3、CCL27、SPRR2B、KRT23、KRT2、 KRT31、 LYZ、 RRM2、 PI3、 KIT、DEFB4A、 SCEL、 S100A2、 S100A12、 S100A11、CTSL、SPP1、CCL3L3、PLLP、ALOXE3、PLAU、PLAUR、CCND1、CXCL1、CXCL8 和 KRT16，主要富集在外胚層發(fā)育、趨性、趨化作用、表皮發(fā)育、損傷反應(yīng)和細(xì)胞因子信號(hào)通路。核心模塊二得分3.75，包含節(jié)點(diǎn)9 個(gè)，邊15 條，節(jié)點(diǎn)蛋白分別為 AIM2、OAS1、SG15、IFI6、OASL、CCND1、CXCL8、ISG20 和CYP1B1，主要富集在免疫反應(yīng)、對(duì)病毒的反應(yīng)和RNA 結(jié)合。核心模塊三得分3.6，包含節(jié)點(diǎn) 26 個(gè)，邊45 條，節(jié)點(diǎn)蛋白分別為CCL27、 LCE2B、 SPRR2B、 ALDH3A2、 CAT、GATA3、 DSC2、 KYNU、 PI3、 TFAP2B、 KIT、LONRF1、 ZBTB16、 AKR1B10、 CD24、 SPRY1、RORA、 NTRK2、 BTC、 GZMB、 PLLP、 DCT、SERPINB1、CLDN7、CCND1 和 CXCL8。

2.5 核心基因的篩選

利用CytoHubba 插件篩選核心基因，算法采用MCC 法，按得分高低獲得排名前20 的核心蛋白 分 別 為 CXCL8、 CCND1、 KIT、 PI3、 SPP1、PLAU、 GATA3、 PLAUR、 CDKN2A、 S100A7、KRT16、 CXCL1、 DEFB4A、 ISG15、 KRT2、S100A12、KRT6B、ISG20、OASL 和 IFI6，它們彼此間的相互作用網(wǎng)絡(luò)如圖3 所示，其中包含20 個(gè)節(jié)點(diǎn)，53 條邊。這20 個(gè)核心蛋白中，CCND1、KIT、GATA3 和KRT2 四個(gè)蛋白在皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中低表達(dá)，其他16 個(gè)蛋白均在皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，提示異常高表達(dá)基因在皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)中前20 個(gè)Hub 基因相互作用圖

2.6 數(shù)據(jù)驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證差異表達(dá)基因的表達(dá)情況，在Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索皮膚鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)，對(duì)在GEO 中篩選到的差異表達(dá)基因結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)基因表達(dá)情況，分別對(duì)在腫瘤組織中高表達(dá)和低表達(dá)的前42 個(gè)基因做熱圖（圖4），Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)所得cSCC 相關(guān)的差異基因的表達(dá)情況與對(duì)GEO 數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選所得結(jié)果基本一致，表明本研究的結(jié)果具有較好的準(zhǔn)確性。

圖4 Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)中差異表達(dá)基因的驗(yàn)證

3 討論

在本研究中，筆者通過(guò)對(duì)GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE42677 和GSE53462 進(jìn)行深度分析，獲得cSCC 腫瘤組織與正常皮膚之間的上調(diào)差異表達(dá)基因43 個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)基因65 個(gè)。同時(shí)構(gòu)建了這些差異表達(dá)基因之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，并篩選獲得了前20 個(gè)關(guān)鍵基因，這些差異表達(dá)基因在cSCC 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中很可能起著重要作用。

GO 和全基因組及代謝途徑數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）途徑分析發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞增殖、皮膚發(fā)育、免疫反應(yīng)、Toll 樣受體信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、精氨酸和脯氨酸代謝和p53 信號(hào)通路等功能途徑。許多研究表明，機(jī)體異常的免疫反應(yīng)在cSCC 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，免疫治療也是當(dāng)前cSCC 治療的研究熱點(diǎn)［4］。Toll樣受體信號(hào)通路在天然免疫中扮演重要角色，許多腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)多類Toll 樣受體，參與腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移［6］。TLR4 是Toll 樣受體的重要組成部分，作為一種先天免疫受體，其在皮膚、角質(zhì)形成細(xì)胞以及cSCC 中表達(dá)，而過(guò)表達(dá)TLR4 的cSCC細(xì)胞的增殖能力減弱，遷移能力增強(qiáng)，體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)速度減緩［7］。趨化因子受體是一類跨膜蛋白，其介導(dǎo)的通路與多種疾病的發(fā)生關(guān)系密切，在cSCC 的組織和細(xì)胞中，許多趨化因子受體高表達(dá)，并參與介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［8］。精氨酸和脯氨酸代謝對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖起著至關(guān)重要的作用，在腫瘤細(xì)胞中代謝重編程導(dǎo)致能量下調(diào)，需要精氨酸生物合成途徑提供能量［9］。p53 是經(jīng)典的抑癌基因，其基因突變和功能喪失在cSCC 中較為常見(jiàn)，且p53 信號(hào)通路與Notch 信號(hào)通路之間在cSCC 中存在密切的相互作用，很可能是導(dǎo)致cSCC形成和進(jìn)展的關(guān)鍵因素［10］。

筆者也通過(guò)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選出了20 個(gè)在網(wǎng)絡(luò)中處于核心地位的基因，分別為CXCL8、CCND1、 KIT、 PI3、 SPP1、 PLAU、 GATA3、PLAUR、 CDKN2A、 S100A7、 KRT16、 CXCL1、DEFB4A、 ISG15、 KRT2、 S100A12、 KRT6B、ISG20、OASL和IFI6，這些基因絕大多數(shù)都在cSCC 等腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色，如：CXCL8 是一種重要的細(xì)胞因子，肥大細(xì)胞能誘導(dǎo)cSCC 細(xì)胞中CXCL8 的表達(dá)，參與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和新血管形成［11］；CCND1 作為 G1/S-特異性周期蛋白，研究表明約6%的cSCC 患者發(fā)生CCND1基因改變，參與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展［12］，而CCND1基因的過(guò)表達(dá)與cSCC 細(xì)胞對(duì)mTOR 抑制劑抗性密切相關(guān)，提示CCND1參與cSCC 的臨床耐藥［13］；SPP1 是一種基質(zhì)細(xì)胞糖蛋白，研究發(fā)現(xiàn)其在cSCC 和光化性角化病中顯著表達(dá)，能保護(hù)紫外線暴露下角質(zhì)細(xì)胞的存活，促進(jìn)cSCC 的發(fā)展［14］。當(dāng)然也有PI3、PLAU等部分基因與cSCC發(fā)病的關(guān)系目前并不明確，值得筆者進(jìn)一步深入挖掘和探討。為了評(píng)價(jià)筆者篩選結(jié)果的準(zhǔn)確程度，筆者利用Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)中的cSCC 相關(guān)表達(dá)譜數(shù)據(jù)對(duì)GEO 中的篩選結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)兩者的一致性很好，提示本研究篩選的結(jié)果可靠性較高。

總之，本研究中筆者對(duì)cSCC 組織與正常皮膚組織芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得了cSCC 相關(guān)的關(guān)鍵差異表達(dá)基因及生物途徑，主要涉及細(xì)胞增殖、皮膚發(fā)育、氨基酸代謝、免疫反應(yīng)、Toll 樣受體信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路和p53 信號(hào)通路等生物學(xué)過(guò)程。筆者的結(jié)果可為解讀cSCC 的發(fā)病機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為cSCC 的診斷及預(yù)后評(píng)估提供潛在的新生物標(biāo)記。但是，筆者的結(jié)果僅停留于初步的數(shù)據(jù)分析階段，鑒于方法學(xué)的限制，存在一定的假陽(yáng)性和假陰性，需要進(jìn)一步的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。