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新型冠狀病毒肺炎防疫期疾病組織樣本采集、存儲及應(yīng)用過程中的操作規(guī)范和建議

2020-01-10 04:18李鳴宇徐骎馮芝恩泥艷紅李江潘新華李志會嚴明王旭張建軍陳萬濤
中國醫(yī)藥生物技術(shù) 2020年2期
關(guān)鍵詞:消毒樣本肺炎

李鳴宇,徐骎,馮芝恩,泥艷紅,李江,潘新華,李志會,嚴明,王旭,張建軍,陳萬濤

·新型冠狀病毒專欄·

新型冠狀病毒肺炎防疫期疾病組織樣本采集、存儲及應(yīng)用過程中的操作規(guī)范和建議

李鳴宇,徐骎,馮芝恩,泥艷紅,李江,潘新華,李志會,嚴明,王旭,張建軍,陳萬濤

200011 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院/國家口腔疾病臨床研究中心/上海市口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室/上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所(李鳴宇、徐骎、李江、潘新華、李志會、嚴明、王旭、張建軍、陳萬濤);100050 北京,首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院口腔頜面頭頸腫瘤科(馮芝恩);210008 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院中心實驗室(泥艷紅)

2019 年 12 月以來,湖北省武漢市發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒肺炎并蔓延至國內(nèi)其他省市和地區(qū)[1]。我國研究人員第一時間分離確定了引起這次新型冠狀病毒肺炎病原體——新型冠狀病毒(2019-nCoV)[2]。2020 年 2 月 11 日,國際病毒分類委員會(international committee on taxonomy of viruses,ICTV)宣布,新型冠狀病毒(2019-nCoV)的正式分類名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒 2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2);而世界衛(wèi)生組織(WHO)同日宣布,由 SARS-CoV-2這一病毒導(dǎo)致的疾病正式名稱為冠狀病毒感染導(dǎo)致的疾病(coronavirus disease,COVID-19)[3-5]。

該病作為急性呼吸道傳染病已被納入《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的乙類傳染病,按甲類傳染病管理[6]。新型冠狀病毒屬于 β 屬的冠狀病毒,其基因特征與 SARSr-CoV 和 MERSr-CoV 有明顯區(qū)別。病毒的理化特性是對紫外線和熱(56 ℃,30 min)很敏感,乙醚、75% 乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活SARS-CoV-2 病毒;而氯己定不能滅活 SARS-CoV-2 病毒[7]。目前傳染源主要是COVID-19 患者,無癥狀感染者也可能成為該疾病的傳染源[7]。研究證實,SARS-CoV-2 病毒 S 蛋白能與宿主組織細胞的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 2(ACE2)受體結(jié)合,這是該病毒侵入人體組織器官的大門。研究還發(fā)現(xiàn),ACE2 在肺臟細胞有高表達,另外在心臟、食道、腎、膀胱和回腸等部位也有不同水平的表達,所以 SARS-CoV-2 病毒除感染肺部外,同樣也可能通過 ACE2 受體攻擊人體的心臟、食道、腎、膀胱和回腸等器官[8]。SARS-CoV-2 病毒主要的傳播途徑是經(jīng)呼吸道飛沫和接觸傳播,氣溶膠和消化道等傳播途徑尚待明確。該疾病臨床表現(xiàn)多樣性,潛伏期1 ~ 14 d,多為 3 ~ 7 d;有報道個別感染者潛伏期時間較長,達到 24 d 或更長;以發(fā)熱、乏力、干咳為主要表現(xiàn);少數(shù)患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹瀉等癥狀。重癥患者多在發(fā)病一周后出現(xiàn)呼吸困難和(或)低氧血癥,嚴重者快速進展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和出凝血功能障礙等[7]。臨床實踐發(fā)現(xiàn),有一小部分新型冠狀病毒感染者臨床癥狀表現(xiàn)輕微或無癥狀;還有部分感染者由于取樣或檢測技術(shù)等問題,前期病毒檢測一次或幾次出現(xiàn)假陰性,而最終被病毒檢測確診。最近COVID-19 尸體解剖系統(tǒng)病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),SARS-CoV-2 病毒感染主要引起深部氣道和肺泡損傷為特征的炎性反應(yīng),滲出性反應(yīng)較 SARS 明顯,而肺部纖維化及實變沒有 SARS 導(dǎo)致的病變嚴重[9]。對因新型冠狀病毒肺炎逝世患者進行微創(chuàng)穿刺獲取組織樣本,經(jīng)過組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),雙肺組織都出現(xiàn)了急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的病理表現(xiàn);外周血 CD4+和 CD8+T 淋巴細胞數(shù)量明顯減少,并發(fā)現(xiàn)上述 T 淋巴細胞處于過度激活狀態(tài)[10]。

在新型冠狀病毒肺炎防疫的特殊時期,也就是該疾病按甲類傳染病管理的特殊時期,原則上不建議采集非臨床研究和基礎(chǔ)研究所必需的疾病相關(guān)組織樣本。對于組織樣本捐獻者,必須先期進行流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)、實驗室檢查等甄別工作,盡可能排除新型冠狀病毒肺炎以及 SARS-CoV-2 病毒感染者。需要特別注意的是,對于已采集的、后期任何時間確診的新型冠狀病毒肺炎或疑似患者的組織樣本,及時參照《國家衛(wèi)生健康委辦公廳關(guān)于印發(fā)新型冠狀病毒實驗室生物安全指南》要求,對相關(guān)樣本進行特別處理,廢棄物銷毀時參照上述指南要求做好場地和個人防護工作。

本文所述內(nèi)容的主要適用范圍是:在 SARS-CoV-2 導(dǎo)致的疫情期間,本區(qū)域已無暴發(fā)流行,但還時有個案發(fā)生,或者國際有暴發(fā)流行,有輸入患者存在;在上述情況下,不直接接觸新型冠狀病毒肺炎確診或疑似患者人群及其來源的組織樣本,從事非傳染疾病的組織樣本臨床采集、處理、存儲和應(yīng)用工作過程中,如何規(guī)避潛在感染,做到防疫和工作兩不誤。

1 人體組織樣本采集

1.1 樣本捐獻者甄別

根據(jù)國家和地方新型冠狀病毒感染肺炎診斷指南,完成詳細的流行病學(xué)調(diào)查和相應(yīng)的臨床、實驗室檢查,明確排除新型冠狀病毒肺炎確診或疑似患者。病人需完成“排除新冠肺炎檢查”的相關(guān)項目。新型冠狀病毒肺炎診斷標準:根據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第六版)》,新冠肺炎診斷需結(jié)合流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)(①發(fā)熱和(或)呼吸道癥狀;②具有新冠肺炎影像學(xué)特征;③發(fā)病早期白細胞總數(shù)正?;蚪档突蛄馨图毎嫈?shù)減少)綜合分析。有任何流行病學(xué)中的任何 1 條,且符合臨床表現(xiàn)中任意 2 條,或無明確流行病學(xué)史的,符合臨床表現(xiàn)中的 3 條,可診斷為疑似病例。疑似病例具備病原學(xué)證據(jù)之一者(①實時熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測新型冠狀病毒核酸陽性;②病毒基因測序,與已知的新型冠狀病毒高度同源),為確診病例[7]。

1.2 生物組織樣本捐獻知情同意書

生物組織樣本捐獻知情同意書應(yīng)添加“組織樣本捐獻者提供的流行病學(xué)史、臨床檢查、CT 輔助診斷和新型冠狀病毒檢測等指標,已排除罹患新型冠狀病毒肺炎或SARS-CoV-2 病毒隱性感染”內(nèi)容。因新型冠狀病毒肺炎疫情原因,標準操作程序(SOP)、知情同意書等需要及時進行修訂,并報請所在單位的倫理委員會審核、備案。

1.3 樣本采集操作過程

在新型冠狀病毒肺炎疫情特殊時期,為避免潛在的感染和傳播風險,在整個操作中,樣本采集人員采取二級生物安全防護。如,進入實驗室前需穿戴醫(yī)用外科防護口罩或 N95 口罩、乳膠手套、工作服外隔離衣、醫(yī)用防護帽、護目鏡,加手衛(wèi)生。樣本收集分為兩類:①手術(shù)后或活檢的疾病組織樣本;②漱口水、唾液、血液、糞便、尿液等體液樣本。樣本收集后,立即用 75% 酒精消毒收集管表面并放入密封袋中。具體請參照中華醫(yī)學(xué)會《2019 新型冠狀病毒肺炎臨床實驗室檢測的生物安全防護指南(試行第一版)》[11]。

1.4 樣本采集人員的個人防護

建議按照傳染性疾病樣本庫的 SOP 進行個人防護,重點需要加強“呼吸道”傳染風險和防護措施。主要防護有:每 4 小時更換口罩,正確洗手或手衛(wèi)生消毒。離開樣本操作室需脫下防護面罩/眼鏡、防護服;下班時進行個人衛(wèi)生處置,注意呼吸道和黏膜的防護。注意事項:外科口罩佩戴時,雙手沿鼻翼壓緊貼合;所有口罩戴上后確認密封;摘下時不要觸碰正面[11]。出操作間后流動水下再次洗手。為預(yù)防長時間佩戴護目鏡、口罩等出現(xiàn)壓力性損傷,必要時使用薄型水膠體貼在鼻梁、顴弓、耳后乳突等受力點,保護皮膚。工作人員之間應(yīng)做預(yù)防性隔離,保持 1 m 以上距離,避免直接接觸。間接接觸的物品做好消毒處理。定時、定點監(jiān)控所有工作人員,若出現(xiàn)有發(fā)熱、咳嗽、乏力等新型冠狀病毒肺炎相關(guān)癥狀,需要第一時間到醫(yī)院發(fā)熱門診或指定門診就診,必要時配合相關(guān)部門做好醫(yī)學(xué)觀察和隔離,最大限度地避免交叉感染。

1.5 樣本標識

在新型冠狀病毒肺炎流行和防疫時期采集的組織樣本,建議在疫情特殊時期給予額外的特殊標識和編號,特別注意樣本庫在信息化系統(tǒng)中,對疫情特別階段收集的樣本加上備注。有條件的樣本庫,對疫情期間收集的所有樣本單獨入庫儲存,樣本袋或凍存管要密封,要求透明、設(shè)有特殊生物安全標識,便于對后期個別可能確診的 SARS-CoV-2 病毒感染患者的樣本進行及時追蹤和處理。

2 組織樣本運送

2.1 醫(yī)院內(nèi)運送

疫情期間,樣本從病房或門診到組織庫,或從組織庫到實驗室等部門間的院內(nèi)運送,要嚴格按照組織樣本庫生物樣本運輸 SOP 進行。運送前做好各項安全保障工作,樣本液氮罐或運送箱要求質(zhì)量合格、密封良好、有生物安全標識、堅固、耐用、專用。包裝材料應(yīng)滿足防水、防破損、防外泄、耐高溫、易于消毒處理等要求。需冷藏運送的唾液、血液等樣本由采集人員放入可密封的采血管或離心管,裝入樣本袋中。一般無特殊要求,血液、尿液等樣本運輸過程中保持在 2 ~ 10 ℃,包裝好的組織樣本應(yīng)放置在專用樣本運輸箱中,并加入適量的袋裝干冰冷藏運輸;運送時間如果超過 2 h 以上,應(yīng)記錄組織樣本運輸箱內(nèi)的實際溫度。運送過程中應(yīng)防顛簸,防止試管內(nèi)溶血,防止破損,以免樣本被污染,或污染其他樣品、物品。需冷凍運送的組織樣本,要保證液氮充足,避免運送過程中液氮溢出或揮發(fā)后降低低溫保存效果。運輸箱基座應(yīng)具有一定的防震能力,能耐受常規(guī)的運輸顛簸且不會傾倒。放置液氮內(nèi)的樣本容器,應(yīng)在液氮條件下保持良好的機械強度和密閉性,避免取出時炸裂污染或傷人。嚴禁使用紗布、紙張直接包裹組織樣本。

2.2 醫(yī)院外運輸

在 SARS-CoV-2 病毒疫情期間,新收集的組織樣本建議盡量暫緩?fù)獠哭D(zhuǎn)運。特殊原因,必須外部(市內(nèi)或國內(nèi))轉(zhuǎn)運,要按照國家和地方生物組織樣本轉(zhuǎn)運要求向所在單位提交申請報告,申請批復(fù)后啟動樣本轉(zhuǎn)運程序。首先要確認接收方資質(zhì),簽訂特殊時期樣本轉(zhuǎn)運合同。所有樣本均作為潛在感染性材料運輸,按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運輸管理規(guī)定》(衛(wèi)生部令第 45 號)辦理《準運證書》。

使用 A 類生物安全運輸箱密閉轉(zhuǎn)運,固定行走路線,嚴格樣本交接登記,并有防污染泄漏的應(yīng)急措施。A 類生物安全運輸箱,使用兩層包裝,即主容器和運輸容器。運輸容器為金屬或塑料容器,可耐壓力滅菌或化學(xué)消毒劑作用,容器蓋應(yīng)有墊圈、密閉、防水、防漏,并定期清除污染。主容器為裝有樣本的管或瓶,運輸時主容器必須用吸收或緩沖材料固定,并保持直立。實行專車運輸。外包裝內(nèi)附有詳細樣本信息單,在外包裝醒目位置貼有生物危險標識[12-13]。轉(zhuǎn)運人員采取一級以上生物安全防護。

實驗室接收人員著工作服、醫(yī)用帽、外科口罩或 N95 口罩、塑膠手套。接收樣本時需確認轉(zhuǎn)運者標識,轉(zhuǎn)運箱特殊標識及裝箱前消毒環(huán)節(jié)。如果不確定是否消毒、懷疑消毒不到位時,可于開箱瞬間75% 乙醇噴霧消毒,并做好過程記錄工作。

3 組織樣本處理和衍生物制備

3.1 樣本處理實驗室要求

實驗區(qū)建議盡可能符合二級生物安全實驗室規(guī)范[11]。應(yīng)有硬性隔斷,并有良好的通風、通氣條件。操作前紫外線照射消毒,用含有效氯 2000 mg/L 消毒液噴灑消毒。物表、地面用含有效氯 2000 mg/L 消毒液擦拭消毒,每天至少2次;有污染時隨時消毒,尤其關(guān)注高頻接觸物件的表面(如各類把手、按鍵、儀器面板、樓梯走道等)。除儀器維修、質(zhì)檢、保潔相關(guān)人員外,嚴格禁止其他人員進入。

3.2 樣本接收入庫

從密封袋取出裝有組織樣本的凍存管或離心管等容器后,須進行 75% 乙醇噴霧消毒,或紫外線消毒。在疫情防控期間為避免組織樣本交叉感染,所接收的組織樣本進行預(yù)入庫操作,統(tǒng)一放置規(guī)定的臨時存儲區(qū),在接收組織樣本15 d后,再次確認組織樣本捐獻者無感染情況下,再行標準入庫操作。

3.3 樣本處理、制備和銷毀

分揀、剪切、離心組織樣本時,操作者須二級生物安全防護。剪切、剖解、分塊組織樣本需帶雙層手套,在生物安全柜中操作;血液等液體樣本離心前,仔細檢查離心管,保證無破損,管蓋嚴密。停止離心后,小心開蓋;仔細檢查,如發(fā)現(xiàn)有液體濺出,75% 乙醇噴霧消毒轉(zhuǎn)子和離心管后,再對標本進行處理。有條件盡可能在生物安全柜中進行轉(zhuǎn)子中離心管的放入和取出。離心完畢,立即用含 0.55% 氯的消毒液對離心機進行消毒、清潔處理[11]。

盡可能避免或少打開裝有樣本的離心管蓋;需要打開時,操作盡量在生物安全柜內(nèi)進行,要輕柔緩慢,和操作者面部保持足夠遠距離。盡可能縮短打開蓋的持續(xù)時間,主要是避免產(chǎn)生氣溶膠。如果可以,酒精噴霧消毒。如果需要打開的是試管塞,或有可能產(chǎn)生氣溶膠的操作,則必須在生物安全柜內(nèi)進行操作。

血液、唾液、尿液等體液樣本應(yīng)在生物安全柜中重新加蓋。提取 DNA 或沉淀物前,可以對樣本先行消毒。包括 56 ℃孵育 30 min,加蛋白酶 K。黏液痰加胰蛋白酶或 4% NaOH 操作時,避免氣溶膠產(chǎn)生。保持環(huán)境有效負壓(如果具備條件),及時稀釋、排除氣溶膠。分泌物涂片也要在安全柜內(nèi)涂布,涂布后須紫外線照射 30 min。對樣本培養(yǎng)進行的相關(guān)操作,如液化、振蕩、涂布、劃線等,也須在生物安全柜內(nèi)完成。操作完畢,即用含 0.55% 氯的消毒液對生物安全柜進行消毒、清潔處理,并開啟紫外線燈消毒30 min。

SARS-COV-2 病毒主要感染肺臟,還可能感染食道、腎、膀胱、心臟和結(jié)直腸等組織器官[8],在處理來源于上述組織器官樣本時,應(yīng)該重點予以注意;另外,血液、唾液、痰、糞便和尿液是病毒所在體液,處理這些樣本更要嚴格按照規(guī)范操作和防護。樣本經(jīng)各種制備后,密封并做好特殊標識,表面須噴灑消毒液后保存。

實驗室檢測結(jié)束后的血樣樣本等經(jīng)高溫高壓處理后,由保管人員提交部門審批后送至醫(yī)院醫(yī)療生物樣本廢物暫存處,由指定單位集中進行焚燒處理。

4 隨訪

新型冠狀病毒肺炎疫情期間,根據(jù)研究方案要求,提前做好受試者隨訪計劃;在保證安全的前提下,盡量通過網(wǎng)絡(luò)視頻、電話、微信等其他即時通訊方式進行遠程隨訪,并如實詳盡記錄遠程隨訪的過程,盡量減少病例脫落。聯(lián)系隨訪者,應(yīng)詢問受試者目前是否有發(fā)熱、咳嗽等新型冠狀病毒肺炎相關(guān)癥狀。

樣本庫人員應(yīng)及時溝通臨床隨訪人員,如果發(fā)現(xiàn)樣本捐贈者新增確診為新型冠狀病毒感染,立即根據(jù)《新型冠狀病毒感染的肺炎疫情醫(yī)療廢物應(yīng)急處置管理與技術(shù)指南(試行)》[14]的相關(guān)規(guī)定對相關(guān)樣本進行處理。

5 小結(jié)

目前,新型冠狀病毒全球肆虐。SARS-CoV-2 病毒有極強的傳染性,還有隱性感染等特點,已對大眾生命健康造成了強于 SARS 的危害,并進一步影響了經(jīng)濟建設(shè)和民眾生活秩序。我們堅信只要貫徹“堅定信心、同舟共濟、科學(xué)防治、精準施策”的疫情防控指導(dǎo)原則,嚴格落實“分區(qū)分級差異化防控策略”的指示,統(tǒng)籌推進疫情防控和經(jīng)濟社會發(fā)展,就一定能打贏疫情防控阻擊戰(zhàn),同時努力實現(xiàn)我國經(jīng)濟社會發(fā)展目標任務(wù)。鑒于新型冠狀病毒感染患者的臨床特點,尤其存在一小部分新型冠狀病毒感染者癥狀輕微或無癥狀表現(xiàn),不能得到及時的診斷;另外,還有很少一部分患者,實驗室 SARS-CoV-2 病毒檢測呈現(xiàn)一次或幾次的假陰性現(xiàn)象。上述各種原因造成的新型冠狀病毒感染者的診斷遺漏,無疑給臨床組織樣本的采集、存儲和應(yīng)用帶來了的風險。本文總結(jié)了在不直接接觸新型冠狀病毒肺炎確診或疑似人群及其來源的生物組織樣本前提下,從事人體組織樣本采集、處理、存儲和應(yīng)用工作過程中的一些預(yù)防性措施和操作規(guī)范,供廣大同行在實踐中參考。毫無疑問,新型冠狀病毒是一種全新的傳染性極強的病毒,人們對其特性和發(fā)病機制認識尚處于初期階段,本文所述的觀點和措施肯定存在一些不當或值得改進之處,在此還請廣大讀者、特別是傳染病和生物樣本庫專業(yè)的老師不吝指正和建議,以便及時完善和修訂。

志謝 感謝鄭小輝、王艷、孫孟紅、陳福祥、許鋒等生物樣本庫領(lǐng)域的專家對論文的修改和建議。感謝“上海高水平地方高校創(chuàng)新團隊”成員的貢獻。

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上海市科學(xué)技術(shù)委員會資助項目(18DZ2291500);國家重點研發(fā)計劃(2016YFC0902700)

陳萬濤,Email:chenwantao2002@gmail.com

2020-03-05

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.02.003

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